חקירה של Synaptic תיוג / לכידה וצלב-לכידה באמצעות חריפות בהיפוקמפוס פרוסות ממכרסמים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור פלסטיות לטווח ארוך והתהליכים האסוציאטיביים שלה כגון תיוג סינפטי, לכידה ותיוג צולב בתאי העצב של CA one parametal באמצעות פרוסות היפוקמפוס Q ממכרסמים. זה מושג על ידי ניתוח המוח תחילה ובידוד מהיר של ההיפוקמפוס לנוזל מוח מלאכותי מחומצן קר. השלב השני הוא הכנת פרוסות היפוקמפוס חריפות באמצעות פורס רקמות ידני ודגירה בתא ממשק.

לאחר מכן, שתי אלקטרודות מגרות ושתי אלקטרודות הקלטה ממוקמות באזור קליפורניה, אזור אחד כדי לתעד את תגובות ה-EPSP והאוכלוסייה משתי כניסות סינפטיות. השלב האחרון הוא לגרום לצורה חולפת של פלסטיות בקלט סינפטי חד פעמי וצורה מתמשכת של פלסטיות בקלט אחר בתוך חלון זמן מסוים. בסופו של דבר, תגובות EPSP בשדה משתי הכניסות נרשמות לפרקי זמן ממושכים כדי לחקור מנגנוני לכידת תיוג סינפטי ולכידה צולבת.

תיוג ולכידה סינפטיים מספקים בסיס רעיוני לאופן שבו זיכרון לטווח קצר הופך לזיכרון לטווח ארוך במסגרת זמן מסוימת. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הניסוי מכיוון שהם כוללים גירוי והקלטה ממספר קלטים סינפטיים. ידגימו את ההליך מאהש שירה, מצ'טה ומיימה שארמה סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו CSF ובעבעו אותו ב-95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני. מלאו את החלק התחתון של תא הממשק במים מזוקקים עד כ-70% מהקיבולת שלו. לאחר מכן הפעל את בקר הטמפרטורה המוגדר מראש ל -32 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, שטפו את החדר העליון למשך 10 עד 15 דקות על ידי הזרמת מים מזוקקים דרך צינור הזרימה בקצב זרימה גבוה לפני המעבר ל-A CSF בקצב זרימה של מיליליטר לדקה. לאחר מכן הניחו רשת בתא העליון כדי לספק משטח מנוחה לפרוסות. התחל קרבוגן בתא התחתון טבל את צינור הזרימה ב-A CSF שהופך לקרבוגן ברציפות.

אפשר 20 דקות עד שה-A CSF יהיה רווי בקרבוגן וכדי שהוא ימלא את החדר העליון. בשלב זה, הרכיבו סכין גילוח על מסוק הרקמות וודאו שקצה החיתוך מיושר באופן שווה. בדוק על ידי קיצוץ נייר סינון קטן כדי לוודא שהלהב מאובטח היטב.

לאחר מכן הגדר את מיקרומטר הוורניר ההזזה למצב ההתחלה שלו. כעת השג ראש של חולדה שהורדמה ובעזרת מספריים לקשתית, בצע חתך דרך הגולגולת האחורית כדי להסיר את גזע המוח. לאחר מכן בצע חתך קטן בצד ימין של הגולגולת וחתך ארוך יותר בצד שמאל.

הסר בזהירות את הגולגולת עם עצם UR החל מהצד השמאלי והולך לצד ימין של הגולגולת. כדי לחשוף את קליפת המוח ואת שכבת הדורה הדקה המכסה אותה, הסר בזהירות את הדורה בעזרת מרית דקה ואז הסר את הלוחות הקדמיים עם העצם. לאחר מכן, הסר את הדורה שנותרה במיוחד בצומת בין קליפת המוח למוח הקטן עם הקצה השטוח של מרית, והימנע מפגיעה במוח על ידי שמירה על הלחץ כלפי מעלה.

בעזרת המרית, גרפו בעדינות את המוח לתוך צלחת פטרי על גוש קירור מאלומיניום מלא ב-CSF קר ומוגז כדי לבודד את ההיפוקמפוס באמצעות אזמל מספר 11, בצע חתך ישר כדי להסיר את המוח הקטן וחתך נוסף כדי להסיר רבע מהחלק הקדמי של המוח. לאחר מכן בצע חתך סגיטלי רדוד לאורך קו האמצע. החל מקו האמצע.

הסר בזהירות את קליפת המוח עם אבנית המגל כדי לחשוף את ההיפוקמפוס הגבי. לאחר מכן, הסר את שכבת קליפת המוח מעל ההיפוקמפוס. בצע חתך קטן לקומיסור ההיפוקמפוס.

הסר בעדינות את ההיפוקמפוס עם אבנית המגל, החל מהקצה הגבי בתנועות גלגול. לאחר מכן, הסר את כל קליפת המוח ורקמות החיבור סביב ההיפוקמפוס המבודד באמצעות הקצה המעוקל של אבנית המגל. כדי לפרוס את רקמת ההיפוקמפוס, הנח חתיכת נייר סינון ווטמן ספוג CSF 30 מילימטר על שלב החיתוך של הפורס הידני.

העבירו את רקמת ההיפוקמפוס על נייר המסנן. בעזרת הקצה השטוח של סקאלור המגל, הזז את נייר הסינון כדי ליישר את ההיפוקמפוס בכיוון הנכון ביחס ללהב הפורס, כך שההיפוקמפוס נחתך בזווית של כ-70 מעלות ל-FIA. לאחר מכן, כתם את התמיסה העודפת המקיפה את רקמת ההיפוקמפוס.

בעזרת נייר פילטר מקופל, פורסים את ההיפוקמפוס, לרוחב, וזורקים רקמה מהקצה הקיצוני של ההיפוקמפוס שבו מורפולוגיה של הפרוסה אינה ברורה. לאחר מכן פורסים את הרקמה הנותרת לפרוסות בעובי 400 מיקרון על ידי התאמת מיקרומטר הוורניר לאחר כל סיבוב חיתוך. לאחר כל חיתוך, העבירו את הפרוסה בעדינות מהלהב בעזרת מברשת עם זיפים רכים לכוס קטנה מלאה ב-CSF מוגז קר.

לאחר מכן העבירו את הפרוסות בעדינות על הרשת בתא הפרוסות באמצעות פיפטה מפלסטיק נקי. בעזרת קצה רחב, התאם בזהירות את מיקום הפרוסות באופן שמקל על מיקום האלקטרודות ובדיקת ההקלטה כדי לוודא שהפרוסות מוקפות מספיק בשכבה של A CSF, אך לא שקועות לחלוטין. לאחר מכן, כסו את החדר ודגרו על הפרוסות במשך שעתיים-שלוש בניסויי תיוג ולכידה סינפטיים.

מתחת למיקרוסקופ ממקמות את שתי האלקטרודות המגרות בשכבת אטום הרדיו של ה-CA אזור אחד כדי לעורר את הסיבים הצדדיים של שאפר ובעת רישום אלקטרודה באזור הדנדריטי האפיקלי של ca אחד באמצע הדרך בין האלקטרודות המעוררות. כדי להקליט תגובות F-E-P-S-P, הנח אלקטרודת הקלטה נוספת בשכבה הפרידית. שכבת DO לתיעוד עלייה באוכלוסייה.

כאשר כל האלקטרודות נוגעות בפרוסה, ספק גירוי בדיקה כדי להבטיח שניתן לקבל אות EPSP שדה תקין בשתי הכניסות. לאחר קבלת אות F-E-P-S-P תקין, הורד בזהירות את האלקטרודות כ-200 מיקרון נוספות באמצעות כפתורי התנועה העדינים של המניפולטורים. לאחר מכן אפשר 20 דקות עד שהפרוסה תתאושש.

לאחר מכן, קבע את יחס יציאת הכניסה על ידי מדידת שיפוע השדה EPSP על טווח עוצמות זרם מ-20 מיקרו-אמפר עד 100 מיקרו-אמפר. לאחר מכן, עבור כל קלט, הגדר את עוצמת הגירוי המעוררת 40% משיפוע ה-EPSP המקסימלי של השדה כגירוי קבוע לאורך כל הניסוי. לאחר 15 עד 20 דקות, התחל להקליט את רשומת הבסיס קו בסיס יציב של לפחות 30 עד 60 דקות לפני אינדוקציה L-T-P-L-T-D בקלט אחד, לגרום ל-LTP מוקדם באמצעות פרוטוקול טטין חלש המורכב מגירוי יחיד בתדר גבוה.

בעוד שהקלט השני ממשיך לתעד את קו הבסיס 30 דקות לאחר השראת ה-LTP המוקדמת, גרמו ל-LTP מאוחר בקלט S 2, תוך שימוש בפרוטוקול טטין חזק הכולל גירוי חוזר בתדר גבוה עם מרווח בין רכבות של 10 דקות. לאחר מכן רשום את תגובות ה-EPSP של השדה למשכים מורחבים כדי לחשוף את הטרנספורמציה של LTP מוקדם בקלט S אחד ל-LTP מאוחר על ידי התיוג והלכידה הסינפטיים. באופן דומה, בניסוי לכידה צולבת, תחילה גרם ל-LTP מוקדם וקלט אחד ואחריו 30 דקות לאחר מכן אינדוקציה מאוחרת של LTD בקלט אחר, תוך שימוש בפרוטוקול גירוי חזק בתדר נמוך המורכב מ-900 התפרצויות לאורך 15 דקות.

לאחר מכן רשום את תגובות ה-EPSP בשדה למשכי זמן מורחבים כדי לחשוף את הטרנספורמציה של LTP מוקדם בקלט S אחד ל-LTP מאוחר על ידי הלכידה הצולבת. בייצוג זה, שתי אלקטרודות מגרות ממוקמות בשכבת אטום הרדיו של אזור CA אחד כדי לעורר שתי כניסות סינפטיות עצמאיות אך חופפות. על CA נוירונים פרמטאליים אחד, שתי אלקטרודות הקלטה חוץ-תאיות.

אחד להקלטת F-E-P-S-P מהתא הדנדריטי האפיקלי. ועוד אחד לתיעוד עלייה באוכלוסייה הסומטית מגופי התאים הפרה-מתכתיים ממוקמים בשכבה רדי אטום ושכבה para בהתאמה. איור זה מראה את השבוע שלפני פרדיגמה חזקה לחקר תיוג ולכידה סינפטיים.

טטין חלש מוחל על S 1 לגרימת LTP מוקדם, ואחריו טטין חזק של S 2 לאחר 30 דקות כדי לגרום ל-LTP מאוחר, ואיור זה מראה את השבוע שלפני פרדיגמה חזקה לחקר תיוג צולב. LTP מוקדם מושרה על ידי טטין חלש ב-S one, ואחריו אינדוקציה של LTD מאוחר ב-S 2 באמצעות פרוטוקול גירוי חזק בתדר נמוך. לאחר 30 דקות ב-S 1, ה-LTP המוקדם הופך ל-LTP מאוחר שנמשך שש שעות, ומציג תיוג צולב ולכידה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו של חיתוך והכנת פרוסות במהירות רבה תוך שלוש עד חמש דקות. לפיכך, ניתן לשמור על כדאיות הפרוסות להקלטות ארוכות טווח. באמצעות שיטה זו, ניתן גם לבדוק את ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים שונים על תהליכי התיוג והלכידה הסינפטיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויי פלסטיות פונקציונליים ארוכי טווח ואת תהליכי התיוג והלכידה הסינפטיים.