חקירה של Synaptic תיוג / לכידה וצלב-לכידה באמצעות חריפות בהיפוקמפוס פרוסות ממכרסמים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור פלסטיות ארוכת טווח ותהליכים אסוציאטיביים נלווים, כגון סימון סינפטי (synaptic tagging), לכידה (capture) וסימון צולב (cross tagging), בנוירונים הפרא-פיראמידיים של אזור CA1 בהיפוקמפוס, תוך שימוש ב slices של היפוקמפוס ממכרסמים. דבר זה מושג תחילה על ידי נתיחת המוח ובידוד מהיר של ההיפוקמפוס לתוך נוזל חוט שדרה מלאכותי קר ומחומצן. השלב השני הוא הכנת slices חדים של ההיפוקמפוס באמצעות חותך רקמות ידני והדגרה שלהם בתא ממשק (interface chamber).

שני אלקטרודות גירוי ושתי אלקטרודות הקלטה נוספות ממוקמות באזור CA1 כדי להקליט תגובות של field EPSP ו-population spike משני קלטים סינפטיים. השלב הסופי הוא השראה של צורה חולפת של פלסטיות בקלט סינפטי אחד ושל צורה מתמשכת של פלסטיות בקלט אחר בתוך חלון זמן ספציפי. לבסוף, תגובות field EPSP משני הקלטים מוקלטות למשך פרקי זמן ממושכים כדי לחקור מנגנונים של synaptic tagging capture ו-cross capture.

סימון ולכידה סינפטית (Synaptic tagging and capture) מספקים בסיס מושגי לאופן שבו זיכרון לטווח קצר הופך לזיכרון לטווח ארוך בתוך מסגרת זמן מסוימת. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהשלבים הניסיוניים קשים ללמידה בהם הם כוללים גירוי והקלטה ממספר קלטים סינפטיים. את הפרוצדורה ידגימו Mahesh Shira, machete ו-maima Sharma, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, הכין A CSF והזרם בו בועות של 95% oxygen ו-5% carbon dioxide. מלא את תחתית תא הממשק במים מזוקקים עד לכ-70% מקיבולתו. לאחר מכן, הפעל את בקר הטמפרטורה שמוגדר מראש ל-32 degrees Celsius.

בשלב הבא, שטפו את התא העליון במשך 10 עד 15 דקות על ידי העברת מים מזוקקים דרך צינור הכניסה בקצב זרימה גבוה, לפני המעבר ל-A CSF בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לאחר מכן, הניחו רשת בתא העליון כדי לספק משטח מנוחה לפרוסות. התחילו להזרים קרבוגן לתא התחתון והטבילו את צינור הכניסה ב-A CSF המהולל באופן רציף בקרבוגן.

המתינו 20 דקות עד שה-A CSF ירווה בקרבוגן וימלא את התא העליון. בשלב זה, התקינו להב תער על קוצץ הרקמה (tissue chopper) וודאו שקצה החיתוך מיושר באופן אחיד. בצעו בדיקה על ידי קיצוץ של פיסת נייר סינון קטנה כדי לוודא שהלהב מקובע היטב.

לאחר מכן, הגדירו את המיקרומטר עם הเวอร์נייה (סרגל מדויק) למצב ההתחלה שלו. כעת, השתמשו בראש של חולדה שהורגזה, ובעזרת מספרי איריס, בצעו חתך דרך הגולגולת האחורית כדי להסיר את גזע המוח. לאחר מכן, בצעו חתך קטן לאורך הצד הימני של הגולגולת וחתך ארוך יותר בצד שמאל.

הסר בזהירות את הגולגולת באמצעות UR לעצם, החל מהצד השמאלי ועד לצד הימני של הגולגולת. כדי לחשוף את הקורטקס ואת שכבת הדורה הדקה המכסה אותו, הסר בזהירות את הדורה בעזרת שפכטל דק, ולאחר מכן הסר את הלוחיות הפרונטליות עם העצם. לאחר מכן, הסר את שארית הדורה, במיוחד בחיבור שבין הקורטקס לשעלת (cerebellum), באמצעות הקצה השטוח של שפכטל, והימנע מגרימת נזק למוח על ידי שמירה על לחץ כלפי מעלה.

בעזרת השפכטל, העבירו בעדינות את המוח לכלי פטרי המונח על בלוק קירור מאלומיניום ומולא ב-A CSF קר ומגוזם. כדי לבודד את ההיפוקמפוס, השתמשו בסכין מנתח מספר 11 ובצעו חתך ישר להסרת המוחון וחתך נוסף להסרת רבע מהחלק הקדמי של המוח. לאחר מכן, בצעו חתך סגיטלי רדוד לאורך קו האמצע. התחילו מקו האמצע.

הסר בזהירות את קליפת המוח (cortex) באמצעות שפשף בצורת חלונית (sickle scaler) כדי לחשוף את ההיפוקמפוס הגבי (dorsal hippocampus). לאחר מכן, הסר את שכבת קליפת המוח שמעל ההיפוקמפוס. בצע חתך קטן בקומיסורה ההיפוקמפלית (hippocampal commissure).

הסר בעדינות את ההיפוקמפוס באמצעות שורט סיקלי (sickle scaler), החל מהקצה הדורסלי תוך שימוש בתנועות גלגול. לאחר מכן, הסר כל קליפה (cortex) ורקמות חיבור שסביב ההיפוקמפוס המבודד באמצעות הקצה המעוקל של השורט הסיקלי. כדי לפרוס את רקמת ההיפוקמפוס, הנח פיסת נייר סינון watman בגודל 30 מילימטר, הספוגה ב-CSF, על משטח הפריסה של הסכין הידנית.

העבירו את רקמת ההיפוקמפוס אל נייר המסנן. בעזרת הקצה השטוח של סכין ה-sickle, הזזו את נייר המסנן כדי ליישר את ההיפוקמפוס כך שיהיה במכוון נכון ביחס ללהב של השףר, כך שההיפוקמפוס ייחתך בזווית של כ-70 מעלות לציר ה-fia. לאחר מכן, ספגו את עודפי התמיסה שסביב רקמת ההיפוקמפוס.

באמצעות נייר סינון מקופל, חתכו את ההיפוקמפוס לנתחים רוחביים, והסירו את הרקמה מקצה ההיפוקמפוס שבו מורפולוגיית הנתח אינה ברורה. לאחר מכן, חתכו את הרקמה שנותרה לנתחים בעובי 400 micron, תוך כיוון המיקרומטר אחרי כל סבב חיתוך. לאחר כל חיתוך, העבירו בעדינות את הנתח מהלהב, באמצעות מברשת בעלת סיבים רכים, לכלי זכוכית קטן הממולא ב-cold carbonated A CSF.

לאחר מכן, העבירו בעדינות את הפרוסות אל הרשת בתא הפרוסות באמצעות פפיטת פלסטיק נקייה. בעזרת קצה רחב, כווננו בזהירות את מיקום הפרוסות באופן שיקל על מיקום האלקטרודה ובדיקת ההקלטה, כדי לוודא שהפרוסות מוקפות מספיק בשכבת A CSF, אך אינן שקועות לחלוטין. לאחר מכן, כסו את התא והדגירו את הפרוסות למשך שעתיים עד שלוש שעות בניסויי סימון ולכידה סינפטית.

תחת המיקרוסקופ, מקם את שתי אלקטרודות הגירוי ב-stratum radiatum של אזור CA1 כדי לגרות את סיבי ה-Schaffer collateral, ואלקטרודת רישום אחת באזור הדנדריטים האפיקליים של CA1, במרחק שווה בין אלקטרודות הגירוי. כדי לרשום תגובות F-E-P-S-P, מקם אלקטרודת רישום נוספת בשכבת ה-stratum pyramidale לרישום של population spike.

כאשר כל האלקטרודות נוגעות ב slice, הגש גירוי בדיקה כדי לוודא שניתן לקבל אות field EPSP תקין בשני הקלטים. ברגע שהתקבל אות F-E-P-S-P תקין, הורד בזהירות את האלקטרודות כ-200 microns נוספים באמצעות כפתורי התנועה העדינה של המניפולטורים. לאחר מכן, המתן 20 דקות כדי שה-slice יתאושש.

לאחר מכן, קבעו את יחסי הקלט-פלט על ידי מדידת השיפוע של ה-field EPSP עבור טווח של עוצמות זרם מ-20 microamps ועד 100 microamps. לאחר מכן, עבור כל קלט, הגדירו כגירוי קבוע לאורך כל הניסוי את עוצמת הגירוי המעוררת 40% משיפוע ה-field EPSP המקסימלי. לאחר 15 עד 20 דקות, התחילו בהקלטה; הקליטו קו בסיס יציב למשך לפחות 30 עד 60 דקות לפני השראת L-T-P-L-T-D בקלט אחד, והשרו LTP מוקדם באמצעות פרוטוקול tetin חלש המורכב מגירוי בודד בתדר גבוה.

בעוד שהקלט השני ממשיך להקליט את קו הבסיס 30 דקות לאחר השראת LTP מוקדמת, השרו LTP מאוחר בקלט S שני, באמצעות פרוטוקול tetin חזק הכולל גירוי חוזר בתדר גבוה עם מרווח בין רכבות של 10 דקות. לאחר מכן, הקליטו את תגובות ה-field EPSP למשך פרקי זמן ממושכים כדי לחשוף את הפיכת ה-LTP המוקדם בקלט S ראשון ל-LTP מאוחר באמצעות תיוג ותפיסה סינפטית (synaptic tagging and capture). באופן דומה, בניסוי של תפיסה מצליבה (cross capture), השרו תחילה LTP מוקדם בקלט אחד, ולאחר 30 דקות השרו LTD מאוחר בקלט אחר, באמצעות פרוטוקול גירוי חזק בתדר נמוך המורכב מ-900 פרצי גירוי לאורך 15 דקות.

לאחר מכן, רשמו את תגובות ה-EPSP השדה למשך זמנים ממושך כדי לחשוף את ההמרה של LTP מוקדם בכניסה S אחת ל-LTP מאוחר באמצעות לכידה צולבת (cross capture). בייצוג זה, שתי אלקטרודות גירוי ממוקמות ב-stratum radiatum של אזור ה-CA1 כדי לגרות שתי כניסות סינפטיות עצמאיות אך חופפות. על גבי נוירונים פירמידליים ב-CA1 ממוקמות שתי אלקטרודות הקלטה חוץ-תאיות.

אחד להקלטת F-E-P-S-P מהמדור הדנדריטרי האפיקלי. ואחר להקלטת פולס אוכלוסייה סומטי מגופי תאי ה-parametal הממוקמים ב-stratum radiatum וב-stratum pyramidale בהתאמה. איור זה מציג את פרדיגמת השבוע שלפניו (week before) למחקר של תיוג ולכידה סינפטית (synaptic tagging and capture).

גירוי חזרתי (tetin) חלש מיושם על S one להשראת LTP מוקדם, ולאחריו גירוי חזרתי חזק של S two לאחר 30 דקות להשראת LTP מאוחר, ואיור זה מציג את הפרדיגמה החלשה לפני הפרדיגמה החזקה לצורך חקר cross tagging. LTP מוקדם מושרא על ידי גירוי חזרתי חלש ב-S one, ולאחריו השראה של LTD מאוחר ב-S two באמצעות פרוטוקול גירוי בתדר נמוך וחזק. לאחר 30 דקות ב-S one, ה-LTP המוקדם הופך ל-LTP מאוחר הנמשך שש שעות, דבר המעיד על cross tagging ו-capture.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את הניתוח והכנת הפרוסות במהירות רבה, תוך שלושה עד חמישה דקות. כך ניתן לשמר את חיוניות הפרוסות לצורך הקלטות ארוכות טווח. באמצעות שיטה זו, ניתן לבחון גם את ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים שונים על תהליכי סימון ולכידה סינפטית (synaptic tagging and capture).

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכושו הבנה טובה על אופן ביצוע ניסויי פלסטיות תפקודית ארוכת טווח ועל התהליכים של תיוג ולכידה סינפטית.