שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה כללית לדמיין ליגנין, תאית, hemicellulose בקירות תא הצמח באמצעות הדמיה ראמאן ניתוח רב משתני.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להציג שיטה כללית להדמיית ליגנין, תאית והמיצלולוז בדופן תא הצמח על ידי הדמיית ראמאן וניתוח רב-משתני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביומסה של הצמח, כגון כיצד הרכיבים הכימיים העיקריים מתפשטים בדופן תא הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג מידע נטול עבודה ולא הרסני על הדגימה עם הכנת דגימה מינימלית.

כדי להתחיל, חתוך גוש רקמות קטן מדגימת הצמח. טבלו את הרקמה במים רותחים נטולי יונים למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו אותו מיד למים נטולי יונים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

חזור על שלב זה עד שהרקמה שוקעת לתחתית המיכל, מה שמצביע על כך שהאוויר ברקמה הוסר ושהרקמה התרככה. הכן 20%50%70% ו-90% של פוליאתילן גליקולים ומים נטולי יונים, כמו גם PEG טהור. שמור על התמיסות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.

דגרו את הרקמה בסדרה של אמבטיות PEG מדורגות כדי להזיז את המים, ולאפשר ל-PEG לחדור. יבש ב-20% PEG למשך שעה, 50% PEG למשך שעה וחצי, 70% PEG למשך שעתיים, 90% PEG למשך שעתיים ו-100% PEG למשך 10 שעות. לאחר מכן, מחממים מראש קלטת בחום של 65 מעלות צלזיוס בתנור.

יוצקים את גוש הטישו המכיל PEG לקלטת, ולאחר מכן מניחים את גוש הטישו במיקום הרצוי באמצעות פינצטה או מחטים מחוממות מראש. מצננים לאט את הקסטה ומאחסנים את הטישו בטמפרטורת החדר עד לשימוש. נתח את בלוק ה-PEG המכיל את רקמת המטרה לגוש קטן באמצעות סכין גילוח חד.

הרכיבו את בלוק ה-PEG הקטן על המיקרוטום, וחתכו חלקים דקים מגוש ה-PEG. לאחר מכן, שטפו את החלקים במים נטולי יונים בשיעור שעון 10 פעמים כדי להסיר את ה-PEG מהרקמה. לאחר מכן, טבלו את החלקים עם טולואן ואתנול למשך שש שעות כדי להסיר את חומרי החילוץ.

הכן את נוזל התגובה על ידי ערבוב של 65 מ"ל מים נטולי יונים, 0.5 מ"ל חומצה אצטית ו-0.6 גרם נתרן כלורי בכוס. הוסף קטע אחד ו -3 מ"ל נוזל תגובה לבקבוקון של 5 מ"ל. הברג את החלק העליון של הבקבוקון.

לאחר מכן, מחממים את הבקבוקון באמבט מים בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי להסיר את הליגנין של הרקמה. שוטפים את החלק במים נטולי יונים בכוס שעון 10 פעמים. לאחר מכן, העבירו את החלק הלא מטופל והלא מכובד לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.

קפל את החלק בזהירות בעזרת מברשות או מחטים. הסר את המים נטולי היונים הנוספים עם נייר טישו. לאחר מכן, טבלו את החלק בתחמוצת דאוטריום.

מכסים את המדגם בתלוש כיסוי זכוכית. אטום את החלקת הכיסוי עם לק כדי למנוע אידוי של תחמוצת הדאוטריום. פתח את תוכנת ההפעלה של המכשיר של מיקרוסקופ ראמאן קונפוקלי.

הפעל את הלייזר והתמקד בשירות הקריסטל והסיליקון עם מטרת מיקרוסקופ פי 100. לחץ על לחצן הכיול כדי לכייל את המכשיר. העבר את המכשיר למצב מיקרוסקופ אופטי והפעל את מנורת המיקרוסקופ.

התקן את שקופית המיקרוסקופ על הבמה, כאשר החלקת הכיסוי פונה למטרה. צפה בדגימה עם מטרת המיקרוסקופ פי 20 ואתר את אזור העניין. עבור למטרת מיקרוסקופ הטבילה.

מרחו שמן טבילה על החלקת הכיסוי, ולאחר מכן התמקדו במשטח הדגימה. לאחר מכן, העבר את המכשיר למצב בדיקת רמאן וכבה את מנורת המיקרוסקופ. בחירת אזור מיפוי באמצעות כלי מלבני.

שנה את גודל הצעד כדי לקבוע את מספר הספקטרום המתקבל. שים לב שגודל המדרגה צריך להיות גדול מקוטר הנקודה, המחושב על ידי הצמצם המספרי של המטרה. גדלים מתחת לכך יגרמו לדגימת יתר.

הגדר את הפרמטרים הספקטרליים האופטימליים כדי להשיג את יחס האות לרעש והאיכות הספקטרלית הטובים ביותר, וזמן רכישה מתאים בהתאם להתאמת המדגם. בדרך כלל, הזינו את פרמטרי ההדמיה בתוכנת המכשיר באמצעות אורך גל לייזר של 532 ננומטר, מסנן של 100%חור של 300, חריץ של 100, ספקטרומטר של 1840 סנטימטרים הפוכים, חריצים של 1200T, מטרת שמן פי 60 וזמן רכישה של שתי שניות. שמור את הנתונים הספקטרליים לפני עיבוד הנתונים, והמר את הנתונים לפורמט אוניברסלי לפני שתמשיך לניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

ספקטרום הראמאן המקורי של דופן תא הצפצפה מוצג כאן. שני אותות רעש עיקריים, כולל סחיפות בסיסיות וקפיצות קוסמיות, זולגים לתוך הערוצים יחד עם האותות בפועל. יש להסיר אותם לפני ניתוח הנתונים.

ניתן ליישם טכניקה להפחתת רעש כגון אלגוריתם Savitzky-Golay או אלגוריתם Wavelet כדי לחסל את אותות הרעש הללו. להדמיית ליגנין, שקול את השיא הספקטרלי בסביבות 1600 סנטימטרים הפוכים עקב רטט המתיחה הסימטרי של הטבעת הארומטית. להדמיית פוליסכריד, השתמש בשיא הספקטרלי בסביבות 2889 סנטימטרים הפוכים בגלל מתיחות CH ו-CH2.

עם זאת, לא ניתן ליצור תמונות ראמאן של תאית והמיצלולוז ישירות. דליניפיקציה היא הליך הכרחי כדי לחשוף את המאפיינים הספקטרליים שלהם. בדרך כלל, אנו חדשים בשיטה זו.

אנו נאבקים, מכיוון שזה דורש הכשרה בטיפול והופעה של חתך מדגם וניתוח הנתונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש מידע כימי על דופן תא הצמח בשיטות באתר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טיפול מקדים כימי על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו סרבנות של דופן תא הצמח.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופי המבני הפנימי והטופוכימיה בתוך דופן תא הצמח, ניתן ליישם אותה גם על דגימות ביולוגיות אחרות.