Name: שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: למדו הדמיה באמצעות ראמאן וניתוח רב משתנים לחזות ליגנין, תאית והמיסלולוז בקירות תאי צמחים. שיטה זו מספקת מידע לא הרסני עם הכנה מינימלית של הדגימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למשרד המדע והטכנולוגיה של סין (2016YDF0600803) על התמיכה הכספית.

1. הכנה לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך גוש רקמות קטן (כ 3 מ&quot;מ x 3 מ&quot;מ x 5 מ&quot;מ) מן המדגם צמח ( למשל, גזע צפצפה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הרקמה במים רותח deionized למשך 30 דקות. מיד להעביר אותו מים deionized בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות. חזור על שלב זה עד שהרקמה שוקעת לתחתית המיכל, דבר המעיד על כך שהאוויר ברקמות הוסר וכי הרקמה התרככה. הערה: עבור הדגימות כי לשקוע לתחתית לפני שלב זה, בדרך כלל לחזור על מחזור זה 3-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20, 50, 70, 90% (V / V) aliquots של פוליאתילן גליקול (PEG) במים deionized, כמו גם PEG טהור, ולשמור על פתרונות ב 65 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמה בסדרה של אמבטיות PEG מדורגת כדי לתפוס את המים ולאפשר PEG להסתנן. הערה: בדרך כלל, PEG עם משקל מולקולרי 2,000 (PEG2000) משמש עבור הטבעה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הרקמה עם g(P) 50% PEG עבור 1.5 שעות, (c) 70% PEG עבור 2 שעות, (d) 90% PEG עבור 2 שעות, ו - (ה) 100% PEG למשך 10 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם קלטת על 65 מעלות צלזיוס בתנור. יוצקים את PEG המכיל את הבלוק לתוך הקלטת ולאחר מכן למקם את בלוק רקמות במצב הרצוי באמצעות פינצטה מראש פינצטה או מחטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להתקרר את הקלטת ולאחסן את הרקמה ב RT עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את גוש PEG המכיל את רקמה היעד לתוך גוש קטן (על 1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ x 2 ס&quot;מ) באמצעות להב סכין חד להרכיב אותו על microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור חלקים רזים של בלוק PEG (בדרך כלל 3-10 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את החלק עם מים deionized שעון זכוכית 10 פעמים כדי להסיר את PEG מן הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הסעיפים עם טולואן / אתנול (2: 1, V / V) במשך 6 שעות כדי להסיר את extractives. הכן את נוזל התגובה על ידי ערבוב 65 מ&quot;ל של מים deionized, 0.5 מ&quot;ל של חומצה אצטית, ו -0.6 גרם של נתרן chloלטבול בכוס. הוסף סעיף אחד ו 3 מ&quot;ל של נוזל התגובה בקבוקון 5 מ&quot;ל. בורג על החלק העליון של הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הבקבוקון באמבט מים על 75 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להסיר את הליגנין של הרקמה. שוטפים את החלק עם מים deionized שעון זכוכית 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החלק המטופל / delignified לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. לפתוח את הקטע בזהירות באמצעות מברשות או מחטים. הסר את המים deionized נוסף עם נייר טישו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקטע לתוך D 2 O. לכסות את המדגם עם כיסוי זכוכית להחליק. חותם את כיסוי להחליק עם לק על מנת למנוע את אידוי של D 2 O. </li></ol> 2. רכישת Spectral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת ההפעלה המכשיר של מיקרוסקופ ראמאן confocal. הפעל את הלייזר (אורך גל 532 ננומטר), להתמקד על פני השטח של סיליקון גבישי עם מטרה מיקרוסקופ 100X, ולחץ על כפתור הכיול לכייל את המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשירלמצב מיקרוסקופ אופטי ולהדליק את מנורת המיקרוסקופ. הר השקופית מיקרוסקופ על הבמה, עם כיסוי להחליק מול המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את המדגם עם מטרה מיקרוסקופ 20X ולאתר את האזור של עניין. החל שמן טבילה coverslip ולעבור למיקרוסקופ טבילה המטרה (60X, הצמצם המספרי NA = 1.35). דגש על פני השטח של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המכשיר למצב בדיקה ראמאן לכבות את מנורת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור מיפוי באמצעות כלי מלבני. לשנות את גודל צעד כדי לקבוע את מספר הספקטרום שהושג. הערה: להיות מודעים לגודל צעד (בדרך כלל גדול יותר מאשר קוטר ספוט מחושב על ידי הצמצם המספרי של המטרה, תיאורטית 1.22λ / NA). הגדלים הבאים יגרמו לדגימת יתר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הפרמטרים הספקטרליים האופטימליים כדי להשיג את יחס אות לרעש הטוב ביותר (SNR) ואיכות ספקטרלית בזמן רכישה מתאים (בדרך כלל &lt;8 שעות),Nding על ההתאמה המדגם. באופן כללי, הקלט את פרמטרים הדמיה בתוכנת המכשיר כדלקמן: לייזר (532 ננומטר), מסנן (100%), חור (300), חריץ (100), ספקטרומטר (1,840 ס&quot;מ -1 ), חריצים (1200t), אובייקטיבי שמן 60X), וזמן הרכישה (2 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הנתונים ספקטרלי לפני עיבוד נתונים להמיר אותם לפורמט אוניברסלי ( למשל, קבצי TXT). </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הנתונים ספקטרלי (קבצי TXT) לתוך תוכנת ניתוח נתונים ( למשל, Matlab). החלת טכניקת הפחתת רעש על הנתונים להגדיר כדי לשפר את SNR ( למשל, אלגוריתם Savitssky-Golay או אלגוריתם אדוה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדגימות לא מטופלות כדי לייצר את התמונות של ליגנין ופוליסכרידים. עבור הדמיה ליגנין, שקול את שיא רפאים סביב 1,600 ס&quot;מ -1 בשל טבעת ארומטית סימטרי מתיחה רטט. עבור הדמיה פוליסכריד (כולל תאית hemicellulose), להשתמש שיא רפאים אעגול 2,889 ס&quot;מ -1 בגלל CH ו- CH 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש דגימות delignified כדי ליצור את התמונות של תאית hemicellulose. בצע רזולוציה עצמית עקומת מודלים (SMCR) על הספקטרום רכשה להפלות את הספקטרום של תאית hemicellulose ולתדמיהם ההפצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח רכיב עיקרי (PCA) וניתוח אשכולות על הנתונים שנרכשו כדי להבדיל בין ספקטרום ראמאן מ שכבות קיר התא השונים. </li></ol>

<ol><li>Gonzalo, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Enzymes+Involved+in+Lignin+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation.</a> J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).</li>
<li>Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosatella%2C+AA+%22Ionic+Liquids+in+the+Biorefinery+Concept%3A+Challenges+and+Perspectives%22">Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives</a>. , Wiley. 38-64 (2016).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+tissue+specific+compositions+of+bioenergy+feedstocks+Through+hyperspectral+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bio%22%5BJournal%5D)">Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging.</a> Bio. 108 (2), 286-295 (2009).</li>
<li>Tolstik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+prediction+of+HCC+tissues+by+Raman+imaging+with+identification+of+fatty+acids+as+potential+lipid+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).</li>
<li>Schrader, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchrader%2C+B+%22Infrared+and+Raman+spectroscopy%3A+methods+and+applications%22">Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications</a>. , John Wiley and Sons. (2008).</li>
<li>Gierlinger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+plant+cell+walls+by+confocal+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).</li>
<li>Luca, A. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+fluorescence+suppression+in+modulated+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy.</a> Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).</li>
<li>Schlücker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microspectroscopy%3A+a+comparison+of+point%2C+line%2C+and+wide-field+imaging+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies.</a> Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).</li>
<li>Cooper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169743998001749">Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications.</a> Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).</li>
<li>Cheng, H. J., Hsiau, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003259101000046X">The study of granular agglomeration mechanism.</a> Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+removing+spectral+contaminants+to+improve+analysis+of+Raman+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data.</a> Sci. Rep. 6, 39891(2016).</li>
<li>Shinzawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jrs.2525/abstract">Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging.</a> J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).</li>
<li>Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/1267173">Self modeling curve resolution.</a> Technometrics. 13, 617-633 (1971).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+automatically+identifying+spectra+of+different+wood+cell+wall+layers+in+Raman+imaging+data+set%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set.</a> Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).</li>
<li>Kudelski, A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039914008001641">Analytical application of Raman spectroscopy.</a> Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

קיר תא הצמח הוא מורכב כי מאורגן למספר שכבות, כולל פינת התא (CC), הקיר המשני (SW, עם S1, S2, ו S3 שכבות), ו lamella תרכובת באמצע (CML, lamella באמצע בתוספת העיקרי יסודי קיר), אשר מקשה להשיג משטח שטוח במהלך הכנת המדגם. לפיכך, דגימות צמח, במיוחד הדשא, אשר יש מבנה מסובך יותר מאשר עץ, לעתים קרובות צריך להיות מוצק כדי לאפשר חתך בסדר. PEG הוא מטריצה ​​קשה אידיאלי לחיתוך החקירה ראמאן, שכן הוא מסיס במים. זה ניתן להסיר בקלות על ידי שטיפה במים deionized. PEG המשמש להטבעה יש משקולות מולקולריו...

ביומסה צמחית היא המשאב המתחדש הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ; מורכבת בעיקר מליגנין, תאית והמיצלולוז; ונחשבת למקור אטרקטיבי של ביו-אנרגיה וכימיקלים מבוססי ביו1. למרבה הצער, הוא יכול לעמוד בפני השפלה ולהעניק יציבות הידרוליטית או חוסן מבני לדופן תא הצמח. עמידות כזו מיוחסת לשטח הפנים הנגיש, גודל חלקיקי הביומסה, מידת הפילמור, גבישיות התאית ומחלקת הליגנין2. הבנה מקיפה של האופי המבני והכימי של דופן תא הצמח היא אפוא משמעותית מנקודת המבט של הביולוגיה והכימיה של הצמח, כמו גם מנקודת המבט של השימוש המסחרי. ניתוחים כימיים רטובים נפוצים, כגון כרומטוגרפיה, ספקטרומטריית מסה וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית, מספקים רק נתוני הרכב ממוצעים של הדגימה הנמדדת. יתר על כן, שיטות אלו פולשניות והורסות את המבנה המקורי של רקמת הצמח3. 
טכניקת הדמיית ראמאן היא כלי רב עוצמה להדמיה לא הרסנית של מידע כימי שנפתר מרחבית4. הוא משתמש באור לייזר כדי לגרום לפיזור לא אלסטי עם פוטון ומסתמך על שינויים בקיטוב הנובעים מהתנודות המולקולריות. במקרה זה, מים גורמים לפיזור רמאן חלש, מה שהופך גישה זו למתאימה לחקירות באתרן של דגימות ביולוגיות5. היישום של טכניקת הדמיית ראמאן על דופן תא הצמח יכול להבהיר את המבנה וההרכב של דפנות תאי הצמח במצבם המקורי, עם הרזולוציה בקנה המידה של התא הבודד ואפילו של שכבות דופן התא6. ניתוח הדמיית ראמאן טיפוסי של דופן תא צמח מורכב בדרך כלל משלושה שלבים: 1) הכנת דגימה, 2) רכישה ספקטרלית ו-3) עיבוד נתונים. 
למרות שאחד היתרונות העיקריים של הדמיית ראמאן הוא היכולת להשיג ספקטרום נטול תוויות ולא הרסני עם הכנת דגימה מינימלית, עדיין יש צורך בחיתוך דגימה פיזי כדי לחשוף את פני השטח. יש לבצע תהליך זה בזהירות כדי להשיג משטח ישר, מכיוון שהטכניקה תלויה בשמירה על מיקוד אופטי7. רכישה ספקטרלית דורשת איזון בין איכות התמונה לבין זמני רכישה נרחבים8. עיבוד הנתונים נועד לחלץ ביעילות את המידע הכימי מנתוני התמונה, במיוחד עבור רכיבים בעלי מבנים כימיים דומים, כגון תאית והמיצלולוז. בשל החפיפה הספקטרלית החזקה, קשה להבחין בספקטרום המדויק. במקרה זה, ניתוח רב-משתני הוא גישה פשוטה לחשוף ביעילות את המידע המבני והכימי המסתיר9. עבודה זו מציגה פרוטוקול כללי המתאר את השימוש בהדמיית רמאן כדי להמחיש את המרכיבים העיקריים בדפנות תאי הצמח, כולל ליגנין, תאית והמיצלולוז.

<table><tbody><tr><td>מיקרוטום</td><td>תרמו מדעי</td><td>מיקרום HM430</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ רמאן קונפוקלי</td><td>Horiba Jobin Yvon</td><td>Xplora</td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td>שנחאי ZHICHENG</td><td>ZXFD-A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו hemicellulose בקיר תא צמחים

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

היישום של הדמיה ראמאן כדי ביומסה צמח גדל כי זה יכול להציע מידע מרחבי ומלחבי על פתרונות מימיים. הניתוח אינו דורש בדרך כלל הכנת מדגם נרחב; מידע מבניים וכימיים ניתן להשיג ללא תיוג. עם זאת, כל תמונה ראמאן מכיל אלפי ספקטרום; זה מעלה קשיים בעת חילוץ מידע מוסתר, במיוחד עבור רכיבים עם מבנים כימיים דומים. עבודה זו מציגה ניתוח רב משתני כדי לטפל בבעיה זו. הפרוטוקול קובע שיטה כללית לדמיין את המרכיבים העיקריים, כולל ליגנין, תאית, hemicellulose בתוך קיר התא צמחים. בפרוטוקול זה, נהלים להכנת המדגם, רכישה ספקטרלית, ועיבוד נתונים מתוארים. זה תלוי מאוד במיומנות המפעיל על הכנת המדגם וניתוח נתונים. באמצעות גישה זו, חקירה ראמאן יכול להתבצע על ידי משתמש שאינו מומחה לרכוש higנתונים באיכות h ותוצאות משמעותיות עבור ניתוח קיר התא צמחים.

איור 1 מציג סקירה של מערכת טיפוסי מיקרו ראמאן הדמיה ראמאן של קיר תא צמחים. כדוגמה, ספקטרום ראמאן המקורי של צפצפה ( Populus nigra L.) יש היסודות משמעותיים דוקרנים ( איור 2 א ). לאחר ביצוע שיטת עיבוד אוטומטי מראש עבור נתונים הדמיה ראמאן להגדיר (APRI), אלה שני מזהמים ספקטרליים מוסרים בהצלחה ( איור 2 ב ). ספקטרום ראמאני טיפוסי של צפצפה מוצג <strong class=...

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה כללית לדמיין ליגנין, תאית, hemicellulose בקירות תא הצמח באמצעות הדמיה ראמאן ניתוח רב משתני.

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להציג שיטה כללית להדמיית ליגנין, תאית והמיצלולוז בדופן התא הצמחי באמצעות דימוי רמון (Raman imaging) ואנליזה רב-משתנית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביומסה של צמחים, כגון כיצד מתפלגים המרכיבים הכימיים העיקריים בדופן התא הצמחי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג מידע על הדגימה ללא צורך בעבודה מאומצת ובאופן לא הרסני, עם הכנה מינימלית של הדגימה.כדי להתחיל, חתכו נתח רקמה קטן מדגימת הצמח. טבלו את הרקמה במים דה-יוניים רותחים למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו אותה מיד למים דה-יוניים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.חזור על שלב זה עד שהרקמה שוקעת לתחתית המיכל, דבר המעיד על כך שהאוויר מהרקמה הוסר ושהרקמה התרככה. הכן מנות של PEG ומים דה-יוניים בריכוזים של 20%, 50%, 70% ו-90%, וכן PEG טהור. שמור את התמיסות בטמפרטורה של 65 degrees Celsius.דגרו את הרקמה בסדרה של רחצות PEG בריכוזים מדורגים כדי להחליף את המים ולאפשר ל-PEG לחלחל. ייבשו ב-20%PEG למשך שעה אחת, ב-50%PEG למשך שעה וחצי, ב-70%PEG למשך שעתיים, ב-90%PEG למשך שעתיים, וב-100%PEG למשך 10 שעות. לאחר מכן, חממו מראש קסטה בטמפרטורה של 65 degrees Celsius בתנור.שפכו את בלוק הרקמה המכיל PEG לתוך הקסטה, ולאחר מכן מקמו את בלוק הרקמה במיקום הרצוי באמצעות פינצטה או מחטים שחוממו מראש. קררו את הקסטה באיטיות, ואחסנו את הרקמה בטמפרטורת החדר עד לשימוש. חתכו את בלוק ה-PEG המכיל את רקמת המטרה לבלוק קטן באמצעות להב תער חד.מקבעו את בלוק ה-PEG הקטן על המיקרוטום, וחתכו חתכים דקים מבלוק ה-PEG. לאחר מכן, שטפו את החתכים עם מים דה-יוניים בתוך זכוכית שעון 10 פעמים כדי להסיר את ה-PEG מהרקמה. בשלב הבא, השריו את החתכים בטולואן ובאתנול למשך שש שעות כדי להסיר את החומרים הממיסים (extractives).הכינו את נוזל התגובה על ידי ערבוב של 65 מ"ל מים דה-יוניים, 0.5 מ"ל חומצה אצטית ו-0.6 גרם נתרן כלורי בתוך כלי כימי (beaker). הוסיפו מקטע אחד ו-3 מ"ל מנוזל התגובה לתוך מבחנה (vial) של 5 מ"ל. סגרו את מכסה המבחנה בהברגה.לאחר מכן, חממו את המבחנה באמבט מים בטמפרטורה של 75 °C למשך שעתיים כדי להסיר את הליגנין מהרקמה. שטפו את החתך במים דה-יוניים בתוך זכוכית שעון 10 פעמים. לאחר מכן, העבירו את החתך שלא עבר טיפול ואת החתך לאחר הסרת הליגנין לזכוכית מיקרוסקופ.פרוש את החתך בזהירות באמצעות מברשות או מחטים. הסר את עודפי המים דה-יוניים בעזרת נייר סופג. לאחר מכן, טבול את החתך ב-deuterium oxide.כסו את הדגימה באמצעות כיסוי זכוכית (cover slip). אטמו את כיסוי הזכוכית בעזרת לק לציפורניים כדי למנוע התאיידות של ה-deuterium oxide. פתחו את תוכנת ההפעלה של מיקרוסקופ ה-confocal Raman.הדלק את הלייזר, ומקד את האלומה על פני השטח של הגביש והסיליקון באמצעות עדשת מיקרוסקופ 100x. לחץ על כפתור הכיול כדי לכייל את המכשיר. העבר את המכשיר למצב מיקרוסקופ אופטי והדלק את נורת המיקרוסקופ.מקם את תגית המיקרוסקופ על הבמה, כאשר הזכוכית המכסה פונה לעבר העדשה. בחן את הדגימה באמצעות עדשה אובייקטיבית של 20x ואתר את האזור המבוקש. עבור לעדשה אובייקטיבית של טבילה (immersion).מרחו שמן אימרסיה על לוכית המכסה, ולאחר מכן התמקדו במשטח הדגימה. בשלב הבא, העבירו את המכשיר למצב בדיקת Raman וכבו את נורת המיקרוסקופ. בחרו אזור מיפוי באמצעות כלי מלבני.שנו את גודל הצעד כדי לקבוע את מספר הספקטרומים שיתקבלו. שימו לב שגודל הצעד צריך להיות גדול מקוטר הנקודה, המחושב על פי הממספר הנומרי של העדשה. גדלים קטנים מכך יביאו לדגימת-יתר.הגדירו את הפרמטרים הספקטרליים האופטימליים כדי להשיג את יחס אות לרעש ואת האיכות הספקטרלית הטובים ביותר, וזמן רכישה מתאים בהתאם להתאמת הדגימה. באופן כללי, הזינו את פרמטרי הדימוי בתוכנת המכשיר תוך שימוש באורך גל של לייזר של 532 nanometers, מסנן של 100%a חור של 300, חריץ של 100, ספקטרומטר של 1840 inverse centimeters, חריצים של 1200T, עדשה שמנית 60x oil, וזמן רכישה של שני שניות. שמרו את הנתונים הספקטרליים לפני עיבוד הנתונים, והמירו את הנתונים לפורמט אוניברסלי לפני המעבר לניתוח נתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.ספקטרומי ה-Raman המקוריים של דופן התא של הצפצפה מוצגים כאן. שני אותות רעש עיקריים, הכוללים סטיות בקו הבסיס (baseline drifts) ופיקים קוסמיים (cosmic spikes), חולפים בערוצים יחד עם האותות הממשיים. יש להסיר אותם לפני ניתוח הנתונים.ניתן להחיל טכניקה להפחתת רעשים, כגון אלגוריתם Savitzky-Golay או אלגוריתם wavelet, כדי לסנן אותות רעש אלו. לצורך דימוי של ליגנין, יש להתייחס לשיא הספקטרלי סביב 1600 cm⁻¹ הנובע מרטט מתיחה סימטרי של הטבעת הארומטית. לצורך דימוי של פוליסכרידים, השתמש בשיא הספקטרלי סביב 2889 cm⁻¹ בשל מתיחות של CH ו-CH2.עם זאת, לא ניתן להפיק תמונות Raman של תאית והמיצלולוז באופן ישיר. הסרת ליגנין היא הליך נחוץ כדי לחשוף את המאפיינים הספקטרליים שלהם. באופן כללי, שיטה זו חדשה עבורנו.אנו נתקלים בקשיים, כיוון שהדבר דורש הכשרה בטיפול בדגימות, במראה של חיתוכי הדגימה ובניתוח הנתונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשיג מידע כימי על דופן התא הצמחי באמצעות שיטות in-situ. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טיפול כימי מקדים, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון העמידות (recalcitrance) של דופן התא הצמחי.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הטבע המבני הפנימי והטופוכימיה בתוך הדופן של תאי הצמח, ניתן ליישם אותה גם על דגימות ביולוגיות אחרות.

combining-raman-imaging-multivariate-analysis-to-visualize-lignin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן הרכב ליגנין polyphenolic.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן והרכב של פחמימות קיר נגזר.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

השיטה מבוססת על מיקרוסקופיה ראמאן confocal מוצג שמקנה ללא תווית להדמיה של ליגנין בדפנות תא הצמח והשוואת lignification ברקמות, מדגמים שונים או מין.

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

מבנה דופן התא של הצמח ותכונות הכימיה מוערכים כדי לזהות חומרי גלם אידיאליים לדלקים ביולוגיים וביו-חומרים. לשיטות סטנדרטיות יש מגבלות כאשר הן מיושמות על ערכות נתונים גדולות. שיטות טיפול מקדים בתפוקה גבוהה, סכריזציה של אנזימים וספקטרומטריית מסה של קרן פירוליזה-מולקולרית משוות מספר רב של דגימות ביומסה עם ירידה בזמן הניסוי ובעלות.

הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה&quot;כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

תאית גבישית היא מרכיב חשוב בדופן התא של הצמח. עם זאת, הכימות שלו ברזולוציה סלולרית הוא מאתגר מבחינה טכנית.  כאן, אנו מדווחים על שימוש בטכנולוגיית אור מקוטב וחתכי שורש כדי לקבל מידע על הרכב דופן התא ברזולוציה מרחבית-זמנית.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

בליס, פרוטוקול תיוג כפול ללמוד דינמיקה lignification, פותחה. שימוש monolignol סינתטי כתבים ושילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC, CuAAC לחץ תגובות, מתודולוגיה זו סוללת את הדרך כדי ניתוח מעמיק של הגורמים המסדירים את להן של lignins ב הפיסקו.

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

פרוטוקול זה מתאר התקנה מקורית המשלבת מדידות ספקטרליות ולאורך החיים כדי להעריך förster תהודה העברת אנרגיה (לדאוג) בין מבוססי rhodamine בבדיקות פלורסנט ליגנין פולימר ישירות בסעיפים צמח עבה.

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

פרוטוקול זה מציג גישה רב-מודאלית המשלבת ספקטרוסקופיה של ראמאן ומיקרוסקופ פאזה טומוגרפית לפנוטיפ נטול תוויות ולא פולשני של תאי סרטן שד אנושיים חיים. הוא כולל צינור ניתוח ידידותי למשתמש ונטול הטיות אנושיות לניתוח מורפו-כימי מהיר וכמותי, המספק תובנות מולקולריות ומבניות מפורטות עם יישומים בחקר הסרטן וביולוגיה של התא.

מסגרת הדמיה רב-מודאלית לקידום פנוטיפ של תאי סרטן שד חיים ללא תווית

בכתב יד זה מוצגות שיטות חמצון תקופתי וקישור צולב גלוטרלדהיד לקיבוע קוולנטי של נוגדנים על דיסקיות נייר. הוערכה פעילות הקישור של נוגדנים משותקים. בהתבסס על תוצאות אלה, נעשה שימוש בשיטת קישור צולב גלוטראלדהיד לפיתוח בדיקה חיסונית חדשה מבוססת נייר לזיהוי אימונוגלובולין G (IgG).

קשר הקוולנטי של נוגדני דיסקי נייר תאיים ואת היישומים שלהם ב Immunoassays מדד-צבע Naked-עין

כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria.

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

למדו הדמיה באמצעות ראמאן וניתוח רב משתנים לחזות ליגנין, תאית והמיסלולוז בקירות תאי צמחים. שיטה זו מספקת מידע לא הרסני עם הכנה מינימלית של הדגימה.

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

גלה סרטונים נוספים