שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים
10 ביוני 2017
פרוטוקול זה נועד להציג שיטה כללית לדמיין ליגנין, תאית, hemicellulose בקירות תא הצמח באמצעות הדמיה ראמאן ניתוח רב משתני.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להציג שיטה כללית להדמיית ליגנין, תאית והמיצלולוז בדופן תא הצמח על ידי הדמיית ראמאן וניתוח רב-משתני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביומסה של הצמח, כגון כיצד הרכיבים הכימיים העיקריים מתפשטים בדופן תא הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג מידע נטול עבודה ולא הרסני על הדגימה עם הכנת דגימה מינימלית.
כדי להתחיל, חתוך גוש רקמות קטן מדגימת הצמח. טבלו את הרקמה במים רותחים נטולי יונים למשך 30 דקות. לאחר מכן, העבירו אותו מיד למים נטולי יונים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
חזור על שלב זה עד שהרקמה שוקעת לתחתית המיכל, מה שמצביע על כך שהאוויר ברקמה הוסר ושהרקמה התרככה. הכן 20%50%70% ו-90% של פוליאתילן גליקולים ומים נטולי יונים, כמו גם PEG טהור. שמור על התמיסות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס.
דגרו את הרקמה בסדרה של אמבטיות PEG מדורגות כדי להזיז את המים, ולאפשר ל-PEG לחדור. יבש ב-20% PEG למשך שעה, 50% PEG למשך שעה וחצי, 70% PEG למשך שעתיים, 90% PEG למשך שעתיים ו-100% PEG למשך 10 שעות. לאחר מכן, מחממים מראש קלטת בחום של 65 מעלות צלזיוס בתנור.
יוצקים את גוש הטישו המכיל PEG לקלטת, ולאחר מכן מניחים את גוש הטישו במיקום הרצוי באמצעות פינצטה או מחטים מחוממות מראש. מצננים לאט את הקסטה ומאחסנים את הטישו בטמפרטורת החדר עד לשימוש. נתח את בלוק ה-PEG המכיל את רקמת המטרה לגוש קטן באמצעות סכין גילוח חד.
הרכיבו את בלוק ה-PEG הקטן על המיקרוטום, וחתכו חלקים דקים מגוש ה-PEG. לאחר מכן, שטפו את החלקים במים נטולי יונים בשיעור שעון 10 פעמים כדי להסיר את ה-PEG מהרקמה. לאחר מכן, טבלו את החלקים עם טולואן ואתנול למשך שש שעות כדי להסיר את חומרי החילוץ.
הכן את נוזל התגובה על ידי ערבוב של 65 מ"ל מים נטולי יונים, 0.5 מ"ל חומצה אצטית ו-0.6 גרם נתרן כלורי בכוס. הוסף קטע אחד ו -3 מ"ל נוזל תגובה לבקבוקון של 5 מ"ל. הברג את החלק העליון של הבקבוקון.
לאחר מכן, מחממים את הבקבוקון באמבט מים בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי להסיר את הליגנין של הרקמה. שוטפים את החלק במים נטולי יונים בכוס שעון 10 פעמים. לאחר מכן, העבירו את החלק הלא מטופל והלא מכובד לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
קפל את החלק בזהירות בעזרת מברשות או מחטים. הסר את המים נטולי היונים הנוספים עם נייר טישו. לאחר מכן, טבלו את החלק בתחמוצת דאוטריום.
מכסים את המדגם בתלוש כיסוי זכוכית. אטום את החלקת הכיסוי עם לק כדי למנוע אידוי של תחמוצת הדאוטריום. פתח את תוכנת ההפעלה של המכשיר של מיקרוסקופ ראמאן קונפוקלי.
הפעל את הלייזר והתמקד בשירות הקריסטל והסיליקון עם מטרת מיקרוסקופ פי 100. לחץ על לחצן הכיול כדי לכייל את המכשיר. העבר את המכשיר למצב מיקרוסקופ אופטי והפעל את מנורת המיקרוסקופ.
התקן את שקופית המיקרוסקופ על הבמה, כאשר החלקת הכיסוי פונה למטרה. צפה בדגימה עם מטרת המיקרוסקופ פי 20 ואתר את אזור העניין. עבור למטרת מיקרוסקופ הטבילה.
מרחו שמן טבילה על החלקת הכיסוי, ולאחר מכן התמקדו במשטח הדגימה. לאחר מכן, העבר את המכשיר למצב בדיקת רמאן וכבה את מנורת המיקרוסקופ. בחירת אזור מיפוי באמצעות כלי מלבני.
שנה את גודל הצעד כדי לקבוע את מספר הספקטרום המתקבל. שים לב שגודל המדרגה צריך להיות גדול מקוטר הנקודה, המחושב על ידי הצמצם המספרי של המטרה. גדלים מתחת לכך יגרמו לדגימת יתר.
הגדר את הפרמטרים הספקטרליים האופטימליים כדי להשיג את יחס האות לרעש והאיכות הספקטרלית הטובים ביותר, וזמן רכישה מתאים בהתאם להתאמת המדגם. בדרך כלל, הזינו את פרמטרי ההדמיה בתוכנת המכשיר באמצעות אורך גל לייזר של 532 ננומטר, מסנן של 100%חור של 300, חריץ של 100, ספקטרומטר של 1840 סנטימטרים הפוכים, חריצים של 1200T, מטרת שמן פי 60 וזמן רכישה של שתי שניות. שמור את הנתונים הספקטרליים לפני עיבוד הנתונים, והמר את הנתונים לפורמט אוניברסלי לפני שתמשיך לניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
ספקטרום הראמאן המקורי של דופן תא הצפצפה מוצג כאן. שני אותות רעש עיקריים, כולל סחיפות בסיסיות וקפיצות קוסמיות, זולגים לתוך הערוצים יחד עם האותות בפועל. יש להסיר אותם לפני ניתוח הנתונים.
ניתן ליישם טכניקה להפחתת רעש כגון אלגוריתם Savitzky-Golay או אלגוריתם Wavelet כדי לחסל את אותות הרעש הללו. להדמיית ליגנין, שקול את השיא הספקטרלי בסביבות 1600 סנטימטרים הפוכים עקב רטט המתיחה הסימטרי של הטבעת הארומטית. להדמיית פוליסכריד, השתמש בשיא הספקטרלי בסביבות 2889 סנטימטרים הפוכים בגלל מתיחות CH ו-CH2.
עם זאת, לא ניתן ליצור תמונות ראמאן של תאית והמיצלולוז ישירות. דליניפיקציה היא הליך הכרחי כדי לחשוף את המאפיינים הספקטרליים שלהם. בדרך כלל, אנו חדשים בשיטה זו.
אנו נאבקים, מכיוון שזה דורש הכשרה בטיפול והופעה של חתך מדגם וניתוח הנתונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש מידע כימי על דופן תא הצמח בשיטות באתר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טיפול מקדים כימי על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו סרבנות של דופן תא הצמח.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופי המבני הפנימי והטופוכימיה בתוך דופן תא הצמח, ניתן ליישם אותה גם על דגימות ביולוגיות אחרות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיה של ליגנין, תאית והמיצלולוז בדפנות תאי צמחים באמצעות דימיון רמאן (Raman imaging) וניתוח רב-משתני. טכניקה זו מספקת תובנות לא-הרסניות לגבי ההרכב הכימי של ביומסה צמחית.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של הצמח
- מחקר ביומסה
- כימיה אנליטית
רקע
- הבנת הרכב דופן התא של הצמח חיונית לניצול הביומסה.
- דימוי רמן מאפשר מיפוי כימי מפורט של רקמות צמחים.
- ניתוח רב-משתני מסייע בפירוש נתונים מורכבים מהדימוי.
- שיטה זו ממזערת את הכנת הדגימות ואינה הרסנית.
מטרת המחקר
- להדמיות של פיזור הרכיבים הכימיים העיקריים בדפנות תאי צמחים.
- לספק שיטה ללא צורך בעבודה ידנית לאנליזה של ביומסה של צמחים.
- להעמיק את ההבנה לגבי מבנה והרכב דפנות תאי צמחים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חיתוך בלוקים קטנים של רקמה מדגימות צמחים.
- טבילת הרקמה במים דה-יוניזציה רותחים למשך 30 דקות.
- העברת הרקמה למים דה-יוניזציה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- שימוש בדימיון רמן (Raman imaging) לצורך ויזואליזציה ובניתוח רב-משתני לצורך פרשנות הנתונים.
תוצאים עיקריים
- ויזואליזציה מוצלחת של ליגנין, תאית והמיצלולוז.
- הדגמה של דפוסי התפלגות של רכיבים כימיים בדפנות התאים.
- אספקה של שיטה לא-הרסנית לניתוח רקמות צמחים.
- קידום מחקרים נוספים ביישומים של ביומסה צמחית.
מסקנות
- השיטה יעילה לחקר הרכב דפנות התא של צמחים.
- דימות רמאן בשילוב עם ניתוח רב-משתני מספק תובנות בעלות ערך.
- גישה זו יכולה לקדם את המחקר בביולוגיה של צמחים ובניצול ביומסה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה לא-הרסנית וללא סימון של ליגנין, תאית והמיצלולוז בדפנות תאי צמחים, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בהמרה של ביומסה ובפיתוח חומרים מבוססי ביולוגיה. על ידי אספקת נתוני הרכב כימי ברזולוציה מרחבית, היא מסייעת בתיקוף יעדים להנדסת אנזימים ובאופטימיזציה של טיפולים מקדימים. הגישה מפחיתה את ההסתמכות על בדיקות הרסניות ומגבירה את הביטחון החזוי בתהליכי סריקת ביומסה בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ארכיטקטורת דופן התא הצמחי כדי לבסס השערות לגבי העמידות של הביומסה ונגישות אנזימטית.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי מתאם בין התפלגות כימית לתוצאות של עיכול אנזימטי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר פלטים ספקטרליים כמותיים שניתן לסטנדרטיזציה לצורך סריקה בעלת תפוקה גבוהה של וריאנטים של ביומסה.
- ערך תפעולי: מקל על מוכנות הבדיקה באמצעות הכנת דגימות הדירה ושונות מינימלית התלויה במפעיל לאחר ההדרכה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות על מערכות רלוונטיות למחלה על ידי קישור הרכב דופן התא לתכונות פנוטיפיות בתשואת ביומסה ובנצילות העיבוד.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף משלב הגילוי ועד להרחבה פרה-קלינית על ידי אספקת נתונים הרכביים עקביים וללא סימון (label-free) על פני סדרות של דגימות.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, תומכת באפיון מוקדם של ביומסה ומאפשרת קבלת החלטות מבוססת נתונים בתהליכי הפיתוח של אנזימים וטיפולים מקדימים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על מחסומים מבניים לפירוק ביומסה באמצעות ויזואליזציה ישירה של רשתות ליגנין-פוליסכריד.
- סריקה: מספקת מפות כימיות בעלות רזולוציה מרחבית המוכנות לבדיקה, המאפשרות השוואה של שינויים בהרכב דופן התא שנגרמו על ידי טיפול או שינוי גנטי.
- אנליטיקה: מייצרת פלטי רב-משתנים המכמתים את פיזור הרכיבים והקו-לוקליזציה שלהם, ובכך מאפשרת השוואה אובייקטיבית בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת נקודות ייחוס להרכב, לצורך הערכת התאמת הביומסה למסלולי ייצור דלק ביולוגי או מוצרים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הדימיון ואנליזה ניתנת לשימוש חוזר, הישימה על סוגי ביומסה מגוונים ובשלבים שונים של הפרויקט.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בעמידות הביומסה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקולים מוגדרים לרכישת ספקטרום ועיבוד נתונים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בפיתוח זני ביומסה או טיפולים מקדימים, על ידי אספקת הערכת סיכון הרכבית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ביומסה מותאם סיכונים, בהתבסס על פרופילים מבניים והרכביים מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בספקטרוסקופיית Raman, ניתוח נתונים רב-משתני וטיפול ברקמות צמחים.
- תלוי בגישה למיקרוסקופי Raman קונפוקאליים עם אורכי גל של לייזר ועדשות מתאימות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנת דגימות, חיתוך ופרשנות נתונים כדי להבטיח הדירות.
- כרוך בשיקולי התאמה בעת יישום השיטה על מיני צמחים או סוגי רקמות מגוונים עם מורכבות משתנה של דפנות התאים.
- מוגבל בשל הצורך בדליגניפיקציה כדי להבחין באותות של תאית והמיצלולוז, דבר המוסיף שלבי ביצוע ושונות פוטנציאלית.
