כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב ארבידופסיס שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

תאית גבישית היא מרכיב חשוב בדופן התא של הצמח. עם זאת, הכימות שלו ברזולוציה סלולרית הוא מאתגר מבחינה טכנית. כאן, אנו מדווחים על שימוש בטכנולוגיית אור מקוטב וחתכי שורש כדי לקבל מידע על הרכב דופן התא ברזולוציה מרחבית-זמנית.

המטרה הכוללת של הכנת חתך אנטומי זה היא לכמת הצטברות גבישים ותאית יחסית ברזולוציה התאית המאפשרת השוואה ישירה בין הרקמות השונות בשורש הארבידופסיס הראשוני. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה וההתפתחות של הצמח כגון כיצד הרכב תאי של סוג תא נתון משפיע על צמיחת איברים שלמים. לאחר עיקור זרעי Arabidopsis על פי פרוטוקול הטקסט, מורחים את הזרעים הסטריליים על צלחות המכילות 0.8% אגר צמחי ומדיום 0.5XM.

בעזרת פרפילם עוטפים את הצלחות ומכסים בנייר אלומיניום. אחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך יום עד ארבעה ימים כדי לקדם נביטה אחידה. לאחר מכן העבירו את הצלחות לתא גידול המתאים לגידול שתילי ארבידופסיס, כיוון את הצלחות אנכית כדי לשמור על צמיחת השורשים על גבי מדיום האגר הכן את הפתרון של ריצ'רדסון על פי פרוטוקול הטקסט סנן דרך יחידת מסנן PVD מונעת מזרק 0.22 מיקרון לפני השימוש.

לאחר מכן, מתחת למכסה המנוע הכימי, הכינו 50 מיליליטר של קיבוע על ידי שילוב של 38 מ"ל של 0.5M נתרן קקודילאט עם 2.5 מ"ל גלוטראלדהיד. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ריצ'רדסון לתמיסת הקיבוע כדי ליצור את תמיסת הקיבוע הסופית. השתמש בצלחת מסומנת מראש, ואז הניח 2 עד 3 מ"ל של תמיסת קיבוע סופית לבארות כך שהתמיסה תכסה את השתילים במלואם.

בעזרת מלקחיים מפלסטיק העבירו בזהירות עד 10 שתילים לכל באר. השתמש בפרפילם כדי לאטום את הצלחות לפני האחסון בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לילה אחד לפחות ועד שבוע. כדי לייבש את השתילים הקבועים השתמש במלקחיים כדי לאסוף את הצמחים על ידי העברתם לבארות של שש לוחות בארות מסומנים חדשים המכילים ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול לזמנים המפורטים כאן.

הכן מדיום הסתננות בבקבוק זכוכית קטן על ידי ערבוב תכולת שקית אחת של Historesin Activator עם 50 מ"ל נוזל שרף בסיסי. הכנס מגנט וערבב את התמיסה על צלחת הערבוב למשך 20 דקות. מלאו את הבארות המסומנות של צלחת שש בארות עם 2 עד 3 מ"ל של מדיום הסתננות.

לאחר מכן, כאשר השתילים מיובשים לחלוטין, השתמשו במלקחיים כדי להעביר אותם מתמיסת האתנול של 95% למדיום ההסתננות, ולהבטיח שהם מכוסים במלואם על ידי המדיום. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים לפחות כדי להבטיח חדירה מקסימלית לרקמות הצמח. להכנת בלוקים, הניחו עיפרון תוויות קטנות המסומן בשם המדגם בתוך כל תבניות הטמעת באר.

הכן את מדיום ההטבעה על ידי הוספת 1 מ"ל של מקשה ל -15 מ"ל של מדיום הסתננות. עם כ -200 מיקרוליטר של הטבעה בינונית ממלאים מחצית מכל באר בתבנית. והשתמש בפיסת סרט עילית כדי לכסות את התבנית בתוספת של 1 מ"ל מכל צד.

דגרו את התבניות בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות כדי לאפשר פילמור חלקי. לאחר מכן, הכינו אצווה נוספת של מדיום הטבעה ושמרו אותו יפה כדי למנוע פילמור בזמן שקצות השורשים מסודרים בתבנית. מוסיפים מדיום הטמעה לצלחת קטנה ומניחים שתיל אחד במדיום.

תחת היקף חיתוך, השתמש באזמל כדי לחתוך כל קצה שורש, ולאחר מכן מקם אותו בזהירות רבה בתבנית, במרחק של כ -2 עד 3 מ"מ מהיקף התבנית, או אנכית לקטעי העברה או אופקית עבור קטעי אורך. לאחר סידור הרקמה השתמש במדיום הטבעה כדי למלא את התבנית לחלוטין, ולכסות בסרט תקורה. לאחר מכן דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות, כדי לייבש את הבלוקים, הניחו אותם בחומר ייבוש עם ג'ל סיליקה יבש והשאירו בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

בעזרת יצרן סכינים המצויד בכלי ניקוד יהלומים מכינים סכיני זכוכית ממוטות זכוכית, על ידי חיתוך דרך הזכוכית לריבוע ולאחר מכן חיתוך הריבוע באלכסון לייצור שני סכינים. ודא שלשני הסכינים יש קצוות חדים. הרכיב בלוק למחזיק.

לאחר מכן, בעזרת להב תעשייתי בקצה אחד, הסר את חומר הבלוק העודף עד מ"מ אחד מקצה השורש לקבלת צורת פירמידה. חתכו את הגוש המעוצב לפרוסות ברוחב 2 עד 3 מיקרון והעבירו את הפרוסות לשקופית זכוכית מסומנת. ואז מוסיפים טיפות מים על הפרוסות.

חשוב להכין קטעים אחידים ברוחב כדי למזער את השונות של הנתונים המנותחים. הנח את מגלשות הזכוכית על גושי החום המכוונים לאש נמוכה עד שהמים מתאדים. להכנת שקופיות לצפייה במיקרוסקופ מקוטב יש לדלל את תמיסת ריצ'רדסון ל-2% מהתמיסה המקורית ולהשתמש בכ-1 מ"ל לכיסוי הפרוסות.

לאחר מכן הניחו את הדגימות על גוש החום למשך 5 שניות והשתמשו במים מזוקקים כדי לשטוף אותן. לאחר ייבוש השקופיות על הפלטה החמה, התבונן בפרוסות תחת מיקרוסקופ מנתח והשתמש בטוש כדי לסמן את החלק האחורי של שקופית כדי לציין את מיקום הפרוסות המעניינות. הוסף 100 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה לפני הכיסוי עם החלקת הכיסוי.

צלם ונתח לפי פרוטוקול הטקסט. מוצג כאן חתך רוחב של השורש הראשוני של Arabidopsis עם ארגון רדיאלי של התאים והרקמות המרכיבים אותו, כולל תאים שאינם שערות, תאי שיער וקליפת המוח. תמונה קונפוקלית זו מציגה ביטוי BRI1-GFP בתאים שאינם שערות על רקע מוטנטי BRI1 המעכב את ההתרחבות החד-כיוונית של תאים שכנים וצמיחת שורש שלמה.

כפי שניתן לראות כאן, קטעי אורך של השורשים המתקבלים מסוג בר ומקווים המבטאים BRI1 בתאים שאינם שערות הראו אוריינטציה דומה של מיקרופיברילים תאית עם שונות גבוהה של זוויות הקיימות בתאים מריסטמטיים בהשוואה לתאים באזור המעבר. זה מאפשר השוואה של הצטברות יחסית של גביש בתאית בתאים המריסטמטיים והמתארכים המתאימים של שני הרקע הגנטי כפי שמוצג כאן בחתכים וחושף מתאם בין ביטוי BRI1 בתאים שאינם שערה לבין הצטברות מקומית גבוהה של גביש בתאית. בדרך כלל בסרטונים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שזה מאתגר להשיג שורשים מכוונים היטב במהלך הליך ההטמעה.

לכן, יש להכין מספר בלוקים לחיתוך. לאחר השליטה, ניתן לבצע קטע בלוק בודד תוך שעתיים עד שלוש. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי הצטברות הגביש בתאית ניתנת להשוואה בין תאים אם יש להם אוריינטציה דומה של המיקרו-סיבי התאית שלו, כפי שנקבע על ידי חתכי האורך.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתקן שתילי Arabidopsis וכיצד להטמיע אותם בבלוקים וכיצד להכין חתכי שורש אורכיים ורוחביים. כמו כן, צריכה להיות לך תובנה טובה לגבי הנתונים שניתן להשיג משימוש במיקרוסקופ אור מקוטב.