קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

בסרטון זה יוצגו שתי שיטות, ביוטינילציה על פני התא וביוטינילציה של רדיפת דופק. בהדגמה הבאה נשתמש באסטרוציטים. אלה הם סוגי תאי הגליה הנפוצים ביותר במוח, והם במקרה מבטאים את החלבון המעניין שלנו שהוא אקוופורין-4.

השיטות שבהן אנו משתמשים במאמר זה יכולות להיות מיושמות על סוגי תאים רבים ושונים, ואלה יכולות לכלול תאים בתרחיף או בתאים נצמדים. ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי לחקור את ביטוי פני התא והפנמה של כמעט כל חלבון טרנסממברני, כל עוד יש לו תחום חוץ-תאי נגיש לביוטין. המטרה הכוללת של בדיקת ביוטינילציה זו על פני התא היא לקבוע את ההשפעות של למינין על ביטוי התעלה החדירה למים Aquaporin-4 בקרום הפלזמה של אסטרוציטים.

כדי להתחיל בהליך זה, הסר את תרביות האסטרוציטים מהחממה, והשליך את המדיום על ידי שאיפה. שוטפים את התאים שלוש פעמים עם ארבעה מיליליטר CM-PBS צונן, ומניחים את הכלים על קרח כתוש. הסר את ה-CM-PBS על ידי שאיפה, ולאחר מכן פיפטה שני מיליליטר של מאגר ביוטין לכל באר.

הטה בעדינות את הכלים קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח כיסוי מלא לפני הנחת התרביות על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן הסר את מאגר הביוטין, החלף אותו בארבעה מיליליטר של מאגר מרווה ושמור את התרביות על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, שאפו והחליפו באותה כמות של מאגר המרווה לפני השארת התרביות על קרח למשך 10 דקות.

לאחר מכן, השליכו את מאגר המרווה ושטפו את התאים שלוש פעמים עם ארבעה מיליליטר CM-PBS צונן. לאחר מכן, מגרדים את התאים למיליליטר אחד של CM-PBS מקורר ומעבירים את המתלה לצינור מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-100 גרם למשך שלוש דקות במיקרו-צנטריפוגה מקוררת המוגדרת לארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה. לאחר מכן, השאירו את הדגימות על הקרח למשך 30 דקות, תוך מערבולת כל חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הליזאט ב-14,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול כל חומר ניקוי וחומרים מסיסים.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. חסוך 50 מיקרוליטר מהליזאט, והוסף לו 25 מיקרוליטר של שלושה מאגר טעינה X. לאחר מכן, יש לפגוע בו על ידי חימום בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס באמבטיה יבשה.

זהו חלק הקלט, המכיל גם חלבונים ביוטיניליים על פני התא וגם חלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים. בעזרת קצה פיפטה חתוך, העבירו 75 מיקרוליטר של חרוזי אגרוז סטרפטווידין לליזאט, ודגרו אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות על שייקר. לאחר מכן, גלולה את חרוזי הסטרפטווידין אגרוז על ידי צנטריפוגה ב -1, 500 גרם למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס.

חסוך 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט והוסף 25 מיקרוליטר של שלושה מאגר טעינה X. לאחר מכן, דנטורציה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס באמבט מים או בבלוק חימום. זה מייצג את החלק התוך תאי, ומורכב בעיקר מחלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים.

לאחר מכן, השעו מחדש את החרוזים הכדוריים במיליליטר אחד של מאגר כביסה ונדנדו אותו במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. גלול את החרוזים והשליך את הסופרנטנט. חזור על תהליך זה ארבע פעמים נוספות כדי למזער את הקישור הלא ספציפי של חלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים.

הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר טעינה מדולל ל-X אחד באמצעות מאגר ליזה. שחררו ביוטין וסטרפטווידין מהחרוזים על ידי דנטורציה שלהם ב-95 מעלות צלזיוס. חלק זה צריך להכיל חלבונים ביוטיניליים על פני התא בלבד.

לאחר מכן, הפרד את הקלט, משטח התא והשברים התוך תאיים על ידי SDS-PAGE ונתח על ידי כתמים מערביים. המטרה הכוללת של ניסוי הביוטינילציה היא לקבוע את קצב ההפנמה המשוער של אקוופורין-4 באסטרוציטים. ראשית, הסר את תרביות האסטרוציטים מהחממה ושאף את המדיום.

לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם ארבעה מיליליטר CM-PBS צונן והניחו את הכלים על קרח כתוש. שאפו את ה-CM-PBS, ולאחר מכן פיפטה שלושה מיליליטר של מאגר ביוטין לכל צלחת. הטו את הכלים קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח שהחיץ מפוזר היטב והשאירו אותם על קרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שאפו את מאגר הביוטין, והחליפו אותו בחמישה מיליליטר של מדיום חם. דגירה של מנת תרבות אחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומנה שנייה באותה טמפרטורה למשך 30 דקות. השאירו מנה נוספת בארבע מעלות צלזיוס כדגימת אפס דקות.

בתום תקופת הדגירה יש להשליך את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם ארבעה מיליליטר CM-PBS צונן. לאחר מכן, שאפו את ה-CM-PBS, ולאחר מכן פיפטה שישה מיליליטר של חיץ מפחית מעל התאים, והשאירו את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, החלף את המדיום בשישה מיליליטר של מאגר הפחתה טרי, והניח את הדגימה על קרח למשך 15 דקות נוספות.

השלב הזה הוא קריטי, שכן הגלוטתיון שנמצא במאגר המפחית יקרע את נאזיס הביוטין שנותר על פני התא. זה מבטיח שרק חלבונים מופנמים יסומנו ביוטין. לאחר מכן, הסר את תמיסת ההפחתה, והחלף אותה בשישה מיליליטר של מאגר מרווה.

השאירו את הדגימה על קרח למשך 15 דקות נוספות, וחזרו על שלב המרווה פעם נוספת. לאחר מכן, השליכו את מאגר המרווה, ושטפו את התאים שלוש פעמים, עם ארבעה מיליליטר PBS צונן. שאפו את ה-CM-PBS, ולאחר מכן גרדו את התאים למיליליטר אחד של PBS מקורר, באמצעות מרים תאים, והעבירו את המתלה לצינור מיקרו-צנטריפוגה.

גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 100 גרם למשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה. השאירו את הדגימה על קרח למשך 30 דקות, ומערבולת כל חמש דקות.

צנטריפוגה את הליזאט ב -14, 000 גרם, למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, כדי לגלול את חומר הניקוי והחומרים המסיסים. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. חסוך 50 מיקרוליטר של ליזט זה, והוסף מאגר טעינה.

לאחר מכן, יש לפרק את התאים בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס, באמבטיה יבשה. זהו חלק הקלט, המכיל גם חלבונים אנדוציטוזיים ביוטיניליים, כמו גם חלבונים שאינם ביוטיניליים. בעזרת קצה פיפטה חתוך, מוסיפים לליזאט 150 מיקרוליטר מתמיסת הסטרפטווידין אגרוז, ודוגרים אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות, על שייקר.

לאחר שלוש שעות, גלול את חרוזי הסטרפטווידין אגרוז על ידי צנטריפוגה, ב -1, 500 גרם למשך 30 שניות, בארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של מאגר כביסה, ונדנדו אותם במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. גלו את החרוזים, והשליכו את הסופרנטנט.

חזור על תהליך זה ארבע פעמים נוספות כדי למזער את הקישור הלא ספציפי של חלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים. לאחר מכן, גלו את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב -1, 500 גרם למשך 30 שניות, בארבע מעלות צלזיוס. השלך את מאגר הכביסה שמעליו, והוסף 50 מיקרוליטר של מאגר טעינה אחד.

לשחרר ביוטין וסטרפטווידין מהחרוזים, על ידי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס. חלק זה צריך להכיל חלבונים מופנמים על פני התא בלבד. לאחר מכן, הפרד את הקלט, משטח התא והשברים הלא מאוגדים, על ידי SDS-PAGE, ונתח על ידי Western Blotting.

מוצגים כאן פני התא, החלקים התוך-תאיים והשברים הכוללים מהאסטרוציטים הלא מטופלים, ואסטרוציטים שטופלו ב-24 למינין ננו-מולרי, שנבדקו לאקוופורין-4 ובטא-דיסטרוגליקן. היסטוגרמה זו ממחישה את ההבדלים ברמות פני התא של אקוופורין-4, באסטרוציטים הלא מטופלים והלמינינים המטופלים, מנורמלים כנגד בטא-דיטרוגליקן. באיור זה, שברי החלבון המופנמים שנאספו באפס, 15 ו-30 דקות, נבדקו עבור Aquaporin-4.

והיסטוגרמה זו, מסכמת את ההפנמה של Aquaporin-4, עבור ארבעה ניסויים עצמאיים, מנורמלים כנגד ערכים עבור נקודת הזמן של דקה אפס. הכוכבית מצביעה על עלייה מובהקת סטטיסטית בכמות Aquaporin-4, אנדוציטוז בין 15 ל-30 דקות. כאשר משתמשים בגלוטתיון כדי לשבור את קשר הדיסולפיד באנלוגי הביוטין הניתן לניתוק, התרומה של משטח התא Aquaporin-4 לשבר הביוטיניל, מופחתת בחדות.

וכתוצאה מכך יש הבדל ברור בין דגימת האפס ל-15 דקות. כאשר השלב מושמט, האות שמקורו במאגר פני התא, הופך את השינוי בין שתי נקודות הזמן לבלתי ניתן לזיהוי. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כמו אימונופלואורסצנציה ומיקרוסקופ TIRF כדי לענות על שאלות נוספות, כולל סחר פיזי במטען.