Name: קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: למד שיטות ביוטינילציה לבדיקת ביטוי משטח תאים וקצב אנדוציטוזה של Aquaporin-4 באסטרוציטים ראשוניים. טכניקות אלו מאפשרות חקר דינמיקת חלבונים בממברנת התא בנוירומדע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר PG # 20R47867.

1. קביעת יחסית חלבון חלבון הביטוי ב Astrocytes ידי Biotinylation הערה: כאן, אנו ממחישים את היישום של טכניקה biotinylation זו לחקר ההשפעות של laminin מולקולה תאית מולקולרית על לוקליזציה משטח התא של ערוץ חדיר מים aquaporin-4 (AQP4). חומרים מיוחדים הנדרשים assay זה כוללים sulfo-NHS-LC ביוטין שרף streptavidin-agarose (ראה טבלה של חומרים ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשיטה המתוארת בנואל ואח &#39;. 12 , להכין תרבויות של astrocytes קליפת המוח כ 2 שבועות מראש של assay, ולגדול אותם 75 ס&quot;מ 2 צלוחיות פרקו תרבות. כאשר האסטרוציטים הם 80 - 90% confluent, לנתק אותם משטח התרבות באמצעות 0.05% טריפסין, ולאחר מכן לעבור אותם 1: 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 שעות לפני assay, כאשר התאים שוב 80 - 90% confluent, אסטרוציטים המעבר 1: 3 (חשבונאות עבור cHange בתבנית התרבות) על גבי 60 מ&quot;מ צלחות תרבות התא כך שהם&gt; 70% confluent ביום הניסוי יתקיים. ודא כי התאים מחולקים באופן שווה בין הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 16 שעות לפני assay, laminin פיפטה לתוך בינוני תרבות לריכוז סופי של 24 ננומטר, ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני assay, להכין את הבאים, ולאחר מכן למקם על קרח או קירור: CM-PBS (100 מ&quot;ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו 100 מ&quot;ג / L CaCl 2 ב 1X PBS, pH 7.4), חיץ ביוטין (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​sulfo-NHS-LC ביוטין ב CM-PBS), מרווה חיץ (50 מ&quot;מ NH 4 Cl ב CM-PBS), חיץ תמוגה (25 מ&quot;מ טריס, pH 7.4, גליצין 25 מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl ו 5 מ&quot;מ EDT, 1% טריטון X-100, קוקטייל 1X פרוטאז inhibitor), 3X חיץ טוען (150 מ&quot;מ טריס, pH 6.8, SDS 6%, גליצרול 30%, 300 מ&quot;מ DTT ו 0.01% ברומופנול כחול), לשטוף חיץ (10 מ&quot;מ Tris (pH 7.4), 1.5 מ&quot;מ EDTA, 150 מ&quot;מ NaCl, 1% Triton X-100, קוקטייל 1X פרוטאז מעכב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RemOve מנות מחזיק את תרבויות astrocyte מן האינקובטור, וזורקים את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל קר C-PBS, ומניחים את הכלים על קרח כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 מ&quot;ל חיץ biotin לתוך כל טוב, בעדינות להטות מנות קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח כיסוי מלא. השאירו על הקרח במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ ביוטין באמצעות aspirator, ולהחליף עם 4 מ&quot;ל מרווה חיץ. השאירו על הקרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המאגר מרווה, ולהחליף עם נפח שווה של אותו. שוב, להשאיר על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את המאגר מרווה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל מקורר CM-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לגרד לתוך 1 מ&quot;ל מקורר CM-PBS באמצעות מרים התא, ולהעביר את ההשעיה כדי microcentrifuge צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 100 במשך 3 דקות. מחק supernatant, מחדש להשעות תאים μL 500 של חיץ תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו דגימות על קרח במשך 30 דקות, vortexing כל 5 דקות, או plאס אותם על סוף סוף מסובב על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב XG 14,000 במשך 10 דקות על 4 מעלות צלזיוס כדי גלולה כל חומרי ניקוי מסיסים. מעבירים את supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 50 μL של lysate ולהוסיף חיץ טוען אליו. ואז להכחיש אותו על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס באמבטיה יבשה; זהו חלק &quot;קלט&quot;, המכיל שני חלבונים פני השטח biotinylated, כמו גם חלבונים cytosolic שאינם biotinylated. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב את הפתח של קצה פיפטה ידי חיתוך כ 0.5 ס&quot;מ של חומר מקצהו באמצעות זוג מספריים חדים. באמצעות קצה זה פיפטה, העברת 75 μL של חרוזים streptavidin-agarose (מאוחסן בדרך כלל 4 מעלות צלזיוס) כדי lysate, ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות על שייקר / נדנדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו streptavidin-agarose נמכר לעתים קרובות כמו סלורי המכיל 50% חרוזים על ידי נפח, מושעה פתרון מיקרוביאלית, triturate slurry כדי להבטיח כי חרוזיםהם מושעה באופן שווה, ולאחר מכן פיפטה 150 μL ההשעיה לתוך כל מדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה streptavidin-agarose חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 עבור 30 s ב 4 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 50 μL של supernatant (להוסיף חיץ טוען וללכת אותו על 95 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום); זה מייצג את החלק &quot;תאיים&quot;, והוא מורכב בעיקר של biotinylated cytosolic חלבונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים pelleted במאגר 1 מ&quot;ל לשטוף, רוק זה 3 דקות ב 4 ° C. גלולות חרוזים (כמו בשלב 1.16), ולזנוח supernatant. חזור על תהליך זה 4x כדי למזער את החיבור הלא ספציפי של חלבונים cytosolic nonbiotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה את החרוזים על ידי צנטריפוגה (1500 xg במשך 30 s ב 4 ° C), ולבטל את החיץ לשטוף מעל. הוסף 50 μL של חיץ 1X טוען (מדולל באמצעות חיץ תמוגה). שחרור ביוטין ו streptavidin מחרוזים על ידי denaturing זה ב 95 מעלות צלזיוס; זה קטע שוUld מכילים biotinylated תאים חלבונים פני השטח בלבד (&quot;שטח התא&quot; שבר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפרד קלט, משטח התא, שברים תאיים ידי SDS-PAGE 13 , ולנתח על ידי סופג המערבי 14 . הערה: למרות שהשתמשנו בג&#39;ל מדורג של 4% -20% בניסוי שלנו, הפרדה של 12% 14% עם שכבה של 4% בערימה (כל אחת המכילה 0.1% SDS) צריכה להספיק עבור החלבונים המעניינים במחקר זה. תקן משקל מולקולרי של טווח הגודל המתאים צריך לשמש גם. שים לב כי לפעמים יכול להיות upshift הנצפים בהמונים המולקולרית לכאורה של חלבונים biotinylated. </li></ol></li></ol> 2. קביעת שיעור הפנמה של חלבונים על פני התא באסטרוציטים על ידי Biotinylation הערה: להלן, אנו מתארים ניסוי טיפוסי הדופק לרדוף biotinylation בשימוש במקרה זה כדי לעקוב אחר אנדוציטוזה של AQP4 ב astrocytes. זֶההשיטה מבוססת על זה בשימוש על ידי מדריד et al. 15 . חומרים מיוחדים הנדרשים כוללים sulfo-NHS-SS- ביוטין, שרף streptavidin-agarose, מופחת גלוטתיון, ו iodoacetamide (ראה טבלה של חומרים ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תרבויות של astrocytes קליפת המוח במנות 60 מ&quot;מ באמצעות השיטות המתוארות בסעיף הקודם. ודא כי תאים הם כ 70% confluent ביום assay, וכי כל מנה מכילה מספר שווה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני assay, להכין את הבאים, ומניחים על קרח או קירור: CM-PBS (100 מ&quot;ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו 100 מ&quot;ג / L CaCl 2 ב 1X PBS, pH7.4), חיץ ביוטין (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​sulfo-NHS-SS-biotin ב CM-PBS), צמצום חיץ (50 מ&quot;מ מופחת גלוטתיון, 75 מ&quot;מ NaCl ו 75 מ&quot;מ NaOH), חיץ מרווה (50 מ&quot;מ iodoacetamide, 1% BSA, ב CM- PBS) חיץ תמוגה (25 מ&quot;מ טריס, pH 7.4, גליצין 25 מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl ו 5 מ&quot;מ EDTA, 1% טריטון X-100, 1קוקטייל מעכב פרוטאז X), חיץ 3X טעינה (150 מ&quot;מ טריס, pH 6.8, SDS 6%, גליצרול 30%, 300 מ&quot;מ DTT ו 0.01% ברומופנול כחול), לשטוף חיץ (10 מ&quot;מ טריס, pH 7.4, 1.5 מ&quot;מ EDTA, 150 מ&quot;מ NaCl, 1% טריטון X-100, קוקטייל 1X פרוטאז מעכב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבית תאים טרי (DMEM בתוספת 10% עוברי Bbovine בסרום (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו -1% L- גלוטמין), ומניחים אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תרבויות astrocyte מן האינקובטור, לשאוב את המדיום באמצעות aspirator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל קר C-PBS, ומניחים את הכלים על קרח כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 3 מ&quot;ל חיץ biotin לתוך כל מנה, להטות מנות קדימה ואחורה כמה פעמים על מנת להבטיח כי חיץ מופץ היטב, ולהשאיר את זה על קרח במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב חיץ ביוטין, ולהחליף אותו עם בינוני 5 מ&quot;ל חם. דגירה צלחת תרבות על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, וכן צלחת שנייה באותה טמפרטורה במשך 30 דקות. השאירו מנה נוספת ב 46; C כמו 0 דקות מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תקופת הדגירה, להשליך בינוני, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל קר C-PBS. פיפטה 6 מ&quot;ל חיץ הפחתת על תאים, ולהשאיר על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ הפחתת, ולאחר מכן להחליף עם חיץ 6 מ&quot;ל צמצום טרי. מניחים על הקרח במשך 15 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון הפחתת להחליף עם 6 מ&quot;ל מרווה חיץ. השאירו על הקרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מרווה צעד שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק חיץ מרווה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל PBS צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לגרד לתוך 1 מ&quot;ל מקורר PBS באמצעות מרים התא, ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 100 במשך 3 דקות. מחק supernatant, תאים resuspend במאגר 500 תמוגה μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את זה על קרח במשך 30 דקות ו מערבולת כל 5 דקות. לחלופין, במקום דגימות על מסובבי סוף סוף על 4 מעלות צלזיוס למשך זמן זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה לייסיאט ב XG 14,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי גלולה חומרי ניקוי חומרי ניקוי, ולאחר מכן להעביר supernatant לצינור microcentrifuge חדש. שמור 50 μL של lysate זה, להוסיף חיץ טוען אליו ולפגוע ב 95 ° C באמבטיה יבשה; זהו חלק &quot;קלט&quot;, המכיל שני חלבונים endocytosed biotinylated, כמו גם חלבונים nonbiotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה פיפטה לחתוך, להוסיף 150 μL של slrery streptavidin-agarose כדי lysate, ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות על שייקר / נדנדה. לפרטים נוספים על שלב זה ראה 1.15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה streptavidin-agarose חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 s ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend במאגר 1 מ&quot;ל לשטוף, רוק במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. גלולות חרוזים (לפי שלב 2.18), ולזנוח supernatant. חזור על תהליך זה 4x כדי למזער את החיבור הלא ספציפי של חלבונים cytosolic nonbiotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 s, ב 4 ° C, וזורקים oveלשטוף לשטוף חיץ. הוסף 50 μL חיץ 1X טוען (מדולל באמצעות חיץ תמוגה). שחרור ביוטין ו streptavidin מחרוזים על ידי denaturing ב 95 ° C; שבר זה צריך להכיל חלבונים פנימיים פנימיים בלבד (&quot;endocytosed&quot; חלק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הקלט, את פני השטח של התא, ואת החלקים הלא מאוגדים על-ידי SDS-PAGE 13 , ונותח על-ידי סופג מערבי 14 . הערה: למרות שהשתמשנו בג&#39;ל מדורג של 4% -20% בניסוי שלנו, הפרדה של 12% 14% עם שכבה של 4% בערימה (כל אחת המכילה 0.1% SDS) צריכה להספיק עבור החלבונים המעניינים במחקר זה. תקן משקל מולקולרי של טווח הגודל המתאים צריך לשמש גם. שים לב כי לפעמים יכול להיות upshift הנצפים בהמונים המולקולרית לכאורה של חלבונים biotinylated. </li></ol>

<ol><li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li>
<li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li>
<li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li>
<li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+family%3A+endocytosis+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li>
<li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li>
<li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation%3A+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+1.+the+use+of+%5B14-C%5Dbiotin+for+kinetic+studies+and+for+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li>
<li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin%2C+a+high+affinity+biotin-binding+protein%2C+as+a+tool+and+subject+of+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450(2012).</li>
<li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805(2014).</li>
<li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li>
<li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan%2C+Dynamin%2C+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439(2016).</li>
</ol>

המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.

שינויים: כמו שיטות אלה נועדו לשימוש עם תאים חסיד, ציינו את השימוש של PBS המכיל 100 מ&quot;ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו 100 מ&quot;ג / L CaCl 2 (CM-PBS) על מדרגות כביסה כבסיס למאגרים מסוימים, על מנת להבטיח כי התאים להישאר מחוברים למשטח התרבות, כי צמתים תא התא אינם משבשים. עם זאת, הפרוטוקולים עשויים להיות מיושמים גם על סוגי תאים nonadherent אם התאים הם pelleted בי...

חלבונים על פני התא לשחק מגוון של תפקידים מרכזי לשמירה על תפקוד התא. במקרים רבים הפעילות שלהם תלויה, או מאופיינת על ידי תהליכים אנדוציטיים, כי גם לרשום אותם באופן זמני באתרים תאיים, או לכוון אותם כלפי מסלולים השפלה 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . כאן, אנו מדגישים 2 biotinylation מבוסס גישות שנועדו לאפשר למשתמש לתייג באופן ספציפי לבודד חלבונים לידי ביטוי על קרום פלזמה, ואלו החדשה הופנמו. באמצעות שיטות אלה, את פני השטח של התא ואת שיעור endocytic של כל חלבון של עניין ניתן לכמת, ובכך מאפשר הערכה ברורה של הרגולציה שלה להיות מושגת. קביעת יחסית תא פני השטח חלבון הביטוי על ידי biotinylation ביוטין, או ויטמין B7, המכונה בעבר ויטמין H 6 , הוא מולקולה מסיס מים קטן שניתן להשתמש בהם כדי לשנות כימית אמינים, sulfhydryl, קבוצות carboxyl של מולקולות ביולוגיות. היבול הנוכחי של ריאגנטים biotinylation פני השטח של התא מורכב בעיקר של קרום nul hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) אסטרונומים של ביוטין או נגזרות שלה, שנועד להגיב עם אמינים נוכח על שרשראות הצד של ליסין שאריות של חלבונים לידי ביטוי ב את משטח התא כאשר אלה הופכים deprotonated בתנאים בסיסיים, וכתוצאה מכך האחרון להרכיב קשר amide עם מחלת ביוטין 7 . כך, למשל, חלבונים של תאי-תאים עשויים להיות מבודדים באמצעות שימוש ב- avidin, חלבון tetrameric של 66 - 69 kDa בעל זיקה רבה לביוטין, המחייב את השני עם קבוע דיסוציאציה של כ -15-15 , מסמן אותו כאחד אינטראקציות noncovalent החזק ביותר הידוע 8 </suP&gt; , 9 . מספר שיטות חלופיות לכימות ביטוי חלבון על פני התא שימשו מחקרים קודמים. תיוג של תאים unpermeabilized באמצעות נוגדנים מתויגים fluorescently ספציפי לחלבון של עניין, ואחריו ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, למשל, היא גישה נפוץ, אבל הוא מסתמך במידה רבה על הזמינות של נוגדנים שיכולים להיקשר epitopes תאיים. לאחרונה, שיטות המעורבות בשימוש חלבונים chimeric הנושאת fluorophores רגישים ל- pH המגיבים לחשיפה לחומרי חומצה, הועסקו בהצלחה גם 10 . עם זאת, מבחני כזה בדרך כלל כרוך הביטוי אקסוגני של מבנים אלה בקווים התא שבו החלבון של עניין לא נמצא באופן מקורי. גישות אלה בכל זאת מסוגלים לספק מידע בעל ערך לגבי לוקליזציה תת-תאית ומסע exocytic שלחלבון היעד, ולכן יש להשתמש בשילוב עם גישות biotinylation מבוסס המתואר כאן אם הכלים זמינים. ב assay biotinylation טיפוסי, התאים נשטפים תחילה ביסודיות 4 מעלות צלזיוס PBS. זה מסיר כל עקבות של חלבונים בסרום הציג על ידי המדיום התרבות, ובכך להבטיח כי אלה לא יצרוך כמויות עודפות של ביוטין בשלב הבא. חשוב יותר, הירידה בטמפרטורה גורמת לאנדוציטוזה להאט משמעותית. מגיב biotinylation לאחר מכן הוסיף. לאחר מכן, התאים נשטפים שוב, ולאחר מכן מודגרות עם חיץ מרווה המכיל גם גליצין או NH 4 Cl, המטרה של אשר היא להשבית את כל עקבות הנותרים של ביוטין בלתי ממומש. התאים הם lysed אז, בעקבות אשר agarose- משותק streptavidin נוסף כדי להאיץ את החלבונים biotinylated. ניתוח מבוצע בדרך כלל באמצעות סופג המערבי, ומאפשר את פני השטח של תא יחסית של יחסי ציבור שוניםOutins להיות לכמת. בשל הבסיס של assay זה, הוא מתאים לשימוש רק עם חלבונים בעלי חלקים חשופים הסביבה תאיים. מולטיפאס טרנסממברני חלבונים, אשר סביר להניח שיש מספר lysines תגובתי בתוך אזורי לולאה שלהם, הם המתאימים ביותר לשיטה זו, ואילו חלבונים לעבור יחיד נוטים להיות רגישים פחות להיות biotinylated. אפילו במקרים אלה, נותרה אפשרות ששינויים קונפורמטיביים או אינטראקציות בין-מולקולאריות עשויים לחסום אתרים תגובתיים מסוימים, וכתוצאה מכך תשואה ביוטילינאצית נמוכה מהצפוי. קביעת שיעור ההפנמה של חלבונים משטח התא על ידי biotinylation העקרונות של assay זה דומים במידה רבה לאלה של biotinylation בתא השטח, עם מספר חריגים, החשוב שבהם הוא השימוש reagents biotinylation הפיך. קבוצות ביוטין (של אלה) יש disuLfide, בתוך המבנים שלהם, כי הם רגישים לצמצום סוכנים; זה מנוצל על מנת להבטיח כי רק חלבונים משטח התא נלקח לאתרים תאיים במהלך תקופת assay יישאר biotinylated. Assay מתרחשת בדרך כלל באופן הבא. התאים נשטפים הראשון biotinylated עם ריאגנטים קר, ואז בינוני תרבות התא ב 37 ° C הוא מחדש הציג, ואת התאים מוחזרים החממה; זה גורם לתאים שכותרתו חלבונים פני כדי לעבור אנדוציטוזה. הפחתת הסוכר גלוטתיון - אשר לא יכול לחדור את הממברנה - לאחר מכן הוסיף לשבור את הקשרים דיסולפיד של moieties ביוטין המצורפת חלבונים שנותרו על פני התא. לבסוף, קשרים disulfide שבור מגיבים עם iodoacetamide, לצרוך את קבוצות thiol labile ומניעת הקשרים מ רפורמה. כמו קודם, התאים הם lysed אז, ואת החלבונים שכותרתו הם זירז באמצעות streptavidin-agarose. דיסק המגבלותבסעיף הקודם חל גם כאן בשל הדמיון המשותף בין השיטות. בנוסף, כדאי לזכור כי משמרות הטמפרטורה המעורבים assay זה למנוע את הקביעה המדויקת של כמה חלבון הוא endocytosed עבור כל תוספת של זמן, במיוחד במקרה של במהירות מופנם או במהירות מיחזור חלבונים. Assay ולכן מספק רק הערכה semiquantitative של שיעורי endocytic. סך הכל מיקרוסקופ השתקפות הקרינה הפנימית ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ספיגה של כל שלפוחית ​​טעון לספק מדידה מדויקת יותר של הקינטיקה של אנדוציטוזה. זה יכול ולכן לספק השלמה מאוד שימושי assay זה, בהנחה כי fluorescently מתויג chimeric לבנות של חלבון של עניין זמין 11 .

<table><tbody><tr><td>אמוניום כלוריד (NH<תת>4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז cOmplete</td><td>11697498001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיסודיום אתילנדיאמין-טטראצטט דיהידרט ( EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8898&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>ביו-ראד</td> <td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>למינין מקרום הבסיס של סרקומה עכברית Engelbreth-Holm-Swarm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>להפשיר על קרח.</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי לעכבר אנטי-ובטא;-אקטין (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד ובטא;-דיסטרוגליקן לעכבר (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat אנטי-ארנב IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>גלוטתיון מופחת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>862010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין שרף אגרוז</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td> <td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-AQP4 נוגדן</td><td>אלומון</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריס (בסיס טריזמה)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות biotinylation

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

חלבונים של תאים סלולריים מתווכים מגוון רחב של פונקציות. במקרים רבים, פעילותם מוסדרת על ידי תהליכים אנדוציטיים המווסתים את רמותיהם בקרום הפלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים עבור 2 שיטות להקל על המחקר של תהליכים כאלה, אשר שניהם מבוססים על העיקרון של biotinylation של חלבונים משטח התא. הראשון נועד לאפשר את קביעת חצי כמותי של רמות היחסי של חלבון מסוים על פני התא. בתוך זה, שאריות ליזין של חלבונים קרום פלזמה של תאים מסומנים הראשון עם מחלת ביוטין. לאחר התאים lysed, חלבונים אלה עשויים להיות זירז במיוחד באמצעות שימוש agreose- משותקת streptavidin על ידי ניצול הזיקה הטבעית של האחרון עבור ביוטין. החלבונים מבודדים בצורה כזו ניתן לאחר מכן ניתח באמצעות גישה סופנית המערבי סופג. השיטה השנייה מספקת אמצעי לקביעת קצב אנדוציטי של חלקיקהמטרה של פני השטח על פני תקופה של זמן. תאים חלבונים פנימיים הם שונו לראשונה עם נגזרות ביוטין המכיל קשר disculfide חדה. התאים מועברים בחזרה לתנאי התרבות הרגילים, מה שגורם ספיגה endocytic של חלק של חלבונים biotinylated. לאחר מכן, את הקשרים דיסולפיד של קבוצות ביוטין שאינם מופחתים מופחתים באמצעות קרום בלתי חדיר צמצום גלוטתיון סוכן. באמצעות גישה זו, חלבונים endocytosed ולכן יכול להיות מבודד לכמת עם רמה גבוהה של ספציפיות.

באמצעות biotinylation תא השטח כדי להעריך את ביטוי הממברנה פלזמה של AQP4 ב astrocytes Laminin שטופלו תרבויות astrocyte ותאי שליטה מטופלים היו כפופים biotinylation תא של התא באמצעות השיטות המתוארות. חלבונים Biotinylated היו זירז עם streptavidin agarose- מצומדות, ולאחר מכן מופרדים באמצעות SDS-PAGE. שברים משטח נייד נבדקו עבור AQP4 ו β-dystroglycan (β-DG) כמשטח הטעינה משטח הטעינה, בעוד שברים קלט תאיים היו מסוממים עבור AQP4 ו β- א...

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

בסרטון זה יוצגו שתי שיטות: ביוטינילציה של פני השטח של התא, וביוטינילציה מסוג pulse-chase. בהדגמה הבאה נשתמש באסטרוציטים. אלו הם סוגי תאי הדבקה הנפוצים ביותר במוח, והם מבטאים את החלבון שבו אנו מעוניינים, Aquaporin-4.ניתן ליישם את השיטות המפורטות במאמר זה על סוגי תאים שונים רבים, כולל תאים בתרחיף או תאים נצמדים. ניתן להשתמש בטכניקות אלו כדי לחקור את הביטוי על פני השטח של התא ואת ההפנמה של כמעט כל חלבון טרנס-ממברנלי, כל עוד יש לו דומיין חוץ-תאי נגיש לביוטין. המטרה הכוללת של בדיקת הביוטינילציה של פני השטח של התא היא לקבוע את השפעות הלמינין על הביטוי של תעלת המים Aquaporin-4 בממברנת הפלזמה של אסטרוציטים.כדי להתחיל בהליך זה, הוצא את תרביות האסטרוציטים מהאינקובטור, והסר את המצע באמצעות שאיבה. שטוף את התאים שלוש פעמים עם 4 mL של CM-PBS מקורר, והנח את הצלחות על קרח גרוס. הסר את ה-CM-PBS בשאיבה, ולאחר מכן טפטף 2 mL של בופר ביוטין לתוך כל באר.הטו את הצלחות בעדינות קדימה ואחורה מספר פעמים כדי להבטיח כיסוי מלא לפני הנחת התרביות על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסר את biotin buffer, החלף אותו ב-4 milliliters של quenching buffer והשאר את התרביות על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, שאב את הנוזל והחלף אותו באותה כמות של quenching buffer לפני השארת התרביות על קרח למשך 10 דקות.לאחר מכן, יש לשפוך את תמיסת השביטה (quenching buffer) ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 4 ml של CM-PBS מקורר. לאחר מכן, יש לגרד את התאים לתוך 1 ml של CM-PBS מקורר ולהעביר את התו suspension למבחנת מיקרוצנטריפוגה. בשלב הבא, יש להשקיע את התאים באמצעות צנטריפוגציה ב-100 g למשך שלוש דקות במיקרוצנטריפוגה מקוררת המכוונת ל-4 °C.לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את התאים ב-500 µl של בופר ליזה. לאחר מכן, השאירו את הדגימות על קרח למשך 30 דקות, תוך ערבוב ב-vortex מדי חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגו את הליזט ב-14,000 g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לשקיע דטרגנטים וחומרים מסיסים.לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה של מיקרוצנטריפוגה. שמרו 50 µL מהליזאט, והוסיפו לו 25 µL של loading buffer בריכוז three X. לאחר מכן, דנטורו אותו על ידי חימום ב-95 °C בבן-מאיץ (dry bath).זהו פракציית הקלט, המכילה הן חלבונים ממסביב התא שביוטינלו והן חלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטינלו. באמצעות קצה של פיפטה חתוך, העבר 75 µL של חרוזי streptavidin agarose אל הליזאט, והדגר אותו בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש שעות על שייקר. לאחר מכן, שקיע את חרוזי ה-streptavidin agarose על ידי צנטריפוגציה ב-1,500 g למשך 30 שניות בטמפרטורה של 4 °C.שמרו 50 µL מהעליון והוסיפו 25 µL של loading buffer בריכוז 3X. לאחר מכן, בצעו דנטורציה בטמפרטורה של 95 °C במבן מים או בבלוק חימום. חלק זה מייצג את הפרקציה התוך-תאית, והוא מורכב בעיקר מחלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים.לאחר מכן, השביו את כדוריות המשקע במיליליטר אחד של בופר שטיפה וטלטלו אותן במשך שלוש דקות בטמפרטורה של 4°C. השקיעו את הכדוריות והסירו את הנוזל העליון. חזרו על תהליך זה ארבע פעמים נוספות כדי למזער קישור לא ספציפי של חלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים.הוסיפו 50 µL של תמיסת טעינה (loading buffer) המדוללת לריכוז של one X באמצעות תמיסת ליזיס (lysis buffer). שחררו את הביוטין והסטרפטאווידין מהחרוזים על ידי דנטורציה בטמפרטורה של 95 °C. פראקציה זו צריכה להכיל חלבונים מהמעטפת התאית שעברו ביוטיניציה בלבד.לאחר מכן, הפרד את מקטעי הקלט (input), פני השטח של התא והמקטעים התוך-תאיים באמצעות SDS-PAGE ונחח אותם בבדיקת western blotting. המטרה הכללית של ניסוי biotinylation מסוג pulse-chase היא לקבוע את קצב ההפנמה המשוער של Aquaporin-4 באסטרוציטים. ראשית, הוצא את תרביות האסטרוציטים מהאינקובטור ושאב את המצע.לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 4 mL של CM-PBS מקורר והניחו את הצלחות על קרח גרוס. שאבו את ה-CM-PBS, ואז העבירו בפיפט 3 mL של biotin buffer לכל צלחת. הטו את הצלחות קדימה ואחורה מספר פעמים כדי להבטיח שהבופר התחלק היטב, והשאירו אותן על קרח למשך 30 דקות.לאחר מכן, שאבו את בופר הביוטין והחליפו אותו בחמישה מיליליטר של מצע חמים. דגרו צלחת תרבית אחת ב-37 °C למשך 15 דקות וצלחת שנייה באותה טמפרטורה למשך 30 דקות. השאירו צלחת נוספת ב-4 °C כדגימת אפס דקות.בסיום תקופת האינקובציה, יש לשפוך את המצע ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 4 mL של CM-PBS מקורר. לאחר מכן, יש לשאוב את ה-CM-PBS, להוסיף באמצעות פיפטה 6 mL של באפר מחזר (reducing buffer) על התאים, ולהשאיר את הדגימה על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, יש להחליף את המצע ב-6 mL של באפר מחזר טרי, ולהניח את הדגימה על קרח ל-15 דקות נוספות.שלב זה הוא קריטי, שכן הגלוטתיון הכלול בבופר החמצון ינתק את מולקולות הביוטין שנותרו על פני התא. פעולה זו מבטיחה שרק חלבונים שהופנמו יסומנו בביוטין. לאחר מכן, יש להסיר את תמיסת החמצון ולהחליפה ב-6 ml של בופר כיבוי (quenching buffer).השאירו את הדגימה על קרח למשך 15 דקות נוספות, וחזרו על שלב השביטה פעם אחת נוספת. לאחר מכן, השליכו את תמיסת השביטה, ושטפו את התאים שלוש פעמים, עם 4 mL של PBS קר. שאבו את ה-CM-PBS, ולאחר מכן גרדו את התאים אל תוך 1 mL של PBS קר, באמצעות מגרדת תאים (cell lifter), והעבירו את התו сусפנזיה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה.שקיע את התאים באמצעות סבוב בצנטריפוגה ב-100 g למשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, השלך את הנוזל העליון, ותלה את התאים מחדש ב-500 microliters של lysis buffer. השאר את הדגימה על קרח למשך 30 דקות, ובצע ערבוב ב-vortex בכל חמש דקות.סובב את הליזט בצנטריפוגה ב-14,000 g למשך 10 דקות ב-4 °C, כדי לשקיע את הדטרגנט והחומרים המסיסים. לאחר מכן, העבר את העלייה לנבובת מיקרוצנטריפוגה חדשה. שמור 50 µL מליזט זה, והוסף באפר טעינה.בשלב הבא, דנטורasikan את התאים בטמפרטורה של 95 degrees celsius, בבן-מריה יבש. זהו פראקציית הקלט, המכילה הן חלבונים שעברו אנדוציטוזה וביוטינילציה, והן חלבונים שאינם ביוטיניליים. באמצעות טיפ של פיפטה חתוך, הוסף 150 microliters של תמיסת streptavidin agarose לליזט, והדגר אותו בטמפרטורה של ארבע degrees celsius למשך שלוש שעות, על שייקר.לאחר שלוש שעות, השקיעו את חרוזי ה-streptavidin agarose באמצעות סרטיפוגציה, ב-1,500 g למשך 30 שניות, בטמפרטורה של 4 °C. השעיקו מחדש את החרוזים ב-1 mL של תמיסת שטיפה (wash buffer), והניחו להם להתנדנד בערבול (rocking) למשך שלוש דקות ב-4 °C. השקיעו את החרוזים, והסירו את הנוזל העליון (supernatant).חזור על תהליך זה ארבע פעמים נוספות כדי למזער את הקישור הלא-ספציפי של חלבוני ציטוזול שאינם ביוטיניליים. לאחר מכן, השק את החרוזים על ידי סנטריפוגציה ב-1,500 g למשך 30 שניות, בטמפרטורה של 4°C. הסר את בופר השטיפה שמעל, והוסף 50 µL של loading buffer בריכוז 1x.שחררו את הביוטין והסטרפטאבידין מהחרוזים על ידי דנטורציה ב-95 degrees celsius. פракציה זו צריכה להכיל חלבונים internalized של פני השטח של התא בלבד. לאחר מכן, הפרידו את פракציות ה-input, פני השטח של התא והפракציות שאינן קשורות (unbound) באמצעות SDS-PAGE, ובצעו ניתוח באמצעות Western blotting.מוצגים כאן הפרקציות של פני התא, התוכן התאי והפרקציות הכוללות מאסטרוציטים שלא טופלו ומאסטרוציטים שטופלו ב-24 nanomolar של laminin, אשר נבחנו עבור Aquaporin-4 ו-beta-dystroglycan. היסטוגרמה זו ממחישה את ההבדלים ברמות של Aquaporin-4 על פני התא, באסטרוציטים שלא טופלו ובאסטרוציטים שטופלו ב-laminin, כאשר התוצאות נורמלו מול beta-dytroglycan. באיור זה, פרקציות חלבון שהופנמו (internalized) אשר נאספו ב-0, 15 ו-30 דקות, נבחנו עבור Aquaporin-4.היסטוגרמה זו מסכמת את הפנימיזציה (internalization) של Aquaporin-4, עבור ארבעה ניסויים בלתי תלויים, אשר נורמלו ביחס לערכים בנקודת הזמן של דקה 0. הכוכבית מציינת עלייה מובהקת סטטיסטית בכמות ה-Aquaporin-4 שעברה אנדוציטוזה בין דקה 15 לדקה 30. כאשר משתמשים ב-glutathione כדי לשבור את קשר הדיסולפיד באנלוג הביוטין הניתן לשבירה, התרומה של Aquaporin-4 מפני השטח של התא לחלק הביוטינתי פוחתת באופן חד.מה שיוביל להבדל ברור בין הדגימות של דקה 0 ושל 15 דקות. כאשר שלב זה מושמט, האות שמקורו במאגר שעל פני השטח של התא הופך את השינוי בין שתי נקודות הזמן לבלתי ניתן לזיהוי. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון אימונופלורסצנציה ומיקרוסקופיית TIRF, כדי לענות על שאלות נוספות, כולל תעבורה פיזית של המטען.

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

סרטון זה מדגים את הבידוד של חלבונים תוך-תאיים ותוך-תאיים מתרבית אסטרוציטים. תרבית האסטרוציטים מונחת על קרח כדי לעכב אנדוציטוזה, ואז חלבוני פני התא מסומנים בריאגנט ביוטינילציה. התאים עוברים ליזה כדי לשחרר את החלבונים הביו-טיניליים שעל פני התא ואת החלבונים התוך-תאיים שאינם ביוטינילטים. לבסוף, חרוזים מצופים סטרפטווידין משמשים להפרדת חלבוני פני התא הביוטיניליים מהחלבונים התוך-תאיים.

בידוד חלבונים תוך-תאיים ותוך-תאיים מתרבית אסטרוציטים

סרטון זה מדגים שיטה להערכת הפנמת חלבון המטרה באסטרוציטים בקליפת המוח של עכברים באמצעות ביוטינילציה, ואחריה ליזה של תאים, מיצוי חלבון מבוסס סטרפטווידין, דנטורציה וניתוח כתמים מערביים כדי לאשר הפנמה מוצלחת.

הערכת הפנמה של חלבוני פני השטח של המטרה באמצעות נגזרת ביוטין

מקור: Creighton, B. A., et al. הדמיה וניתוח הובלה תוך-תאית של אברונים ומטענים אחרים באסטרוציטים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההדמיה של הובלת מטען תוך-תאית באסטרוציטים מתורבתים באמצעות בדיקה חומצתית פלואורסצנטית המסמנת באופן סלקטיבי שלפוחיות אנדוליזוזומליות חומציות. הדמיית זמן-lapse ורכישת Z-stack עם מיקרוסקופ קונפוקלי מאפשרים מעקב אחר מטען עם תווית פלואורסצנטית לאורך נפח התא התלת מימדי. הניתוח מבדיל בין מטען נייח למטען הנע לעבר פריפריית התא או הגרעין, ומספק תובנות לגבי דינמיקת הובלה...

הדמיה של הובלה תוך-תאית של מטען באסטרוציטים מתורבתים

סחר בממברנה כרוך בהובלה של חלבונים מקרום הפלזמה לפנים התא (כלומר אנדוציטוזיס) ואחריו סחר לליזוזומים לפירוק או לקרום הפלזמה למיחזור. השיטות המתוארות במאמר זה נועדו לחקור אנדוציטוזיס ומיחזור של חלבוני ממברנת פלזמה.

מבחני הגנת L-גלוטתיון מבוססי תאים לחקר אנדוציטוזיס ומיחזור של חלבוני ממברנת פלזמה

סחר קרום עצבי דינמי שולט זמינה פלזמה קרום חלבון ומשמעותי עצבית משפיע. נכון להיום, זה כבר מאתגר למדוד סחר endocytic עצבי בנוירונים בוגרים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה מאוד, כמוני למדידת שינויים מהירים בביטוי חלבון פני השטח vivo לשעבר בפרוסות מוח חריפות.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

מוצג כאן הוא פרוטוקול המשלב במערכת התרבותית העצבית-אנדותל ושיתוף תרבות מטבולית והתאגדות המטבולית של sialoglycan עם קבוצות פונקציונליות bioorthogonal כדי להרחיב את גזע הגוף העצבי ואת התאים מחולל מותג התווית שלהם סיליגליקורופנס להדמיה או ניתוח המסה-ספקטרומטריה של סמני שטח התא.

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.

גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

למד שיטות ביוטינילציה לבדיקת ביטוי משטח תאים וקצב אנדוציטוזה של Aquaporin-4 באסטרוציטים ראשוניים. טכניקות אלו מאפשרות חקר דינמיקת חלבונים בממברנת התא בנוירומדע.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

גלה סרטונים נוספים