הערכת הפנמה של חלבוני פני השטח של המטרה באמצעות נגזרת ביוטין

טפל באסטרוציטים בקליפת המוח של העכבר עם נגזרת ביוטין ניתנת לניתוק.

דגירה בטמפרטורה נמוכה כדי למנוע הפנמת חלבון ולהקל על היצמדות ביוטין לחלבוני פני המטרה.

שוטפים ומוסיפים מדיום חם, ואז דוגרים כדי לגרום להפנמה של החלבונים הביוטיניליים.

יש לשטוף ולטפל בחומר הפחתה אטום לממברנה כדי לבקע את הביוטין הלא מופנם.

הוסף מגיב מרווה כדי לעצור את התגובה ולשטוף.

קצרו את התאים והצנטריפוגה. הסר את ה-supernatant.

הוסף מאגר ליזה כדי ליז את התאים, ושחרר את החלבונים הביוטיניים הלא ביוטיניים והמופנמים.

צנטריפוגה כדי לזרוק את פסולת התא.

אספו את החלבונים המכילים סופרנטנט, הוסיפו חרוזי סטרפטווידין-אגרוז וערבבו כדי ללכוד את החלבונים הביוטיניים.

צנטריפוגה כדי לגלול את החרוזים ולהשליך את הסופרנטנט.

הוסף חיץ טעינה וחום כדי לפרק ולשחרר את החלבונים מהחרוזים.

העבירו את החלבון על ג'ל והעבירו אותו לקרום סופג.

זיהוי באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים כדי לדמיין פס חלבון מובחן, המאשר הפנמה מוצלחת של חלבון.

ראשית, הסר את תרביות האסטרוציטים מהחממה ושאף את המדיום. לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם 4 מיליליטר CM-PBS צונן והניחו את הכלים על קרח כתוש. שאפו את ה-CM-PBS ולאחר מכן פיפטה 3 מיליליטר של מאגר ביוטין לכל צלחת. הטו את הכלים קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח שהחיץ מפוזר היטב, והשאירו אותם על קרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, שאפו את מאגר הביוטין והחליפו אותו ב -5 מיליליטר של מדיום חם. דגירה של מנת תרבות אחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ומנה שנייה באותה טמפרטורה למשך 30 דקות. השאירו מנה נוספת בחום של 4 מעלות צלזיוס כדגימה של אפס דקות.

בתום תקופת הדגירה יש להשליך את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 4 מיליליטר CM-PBS צונן. לאחר מכן, שאפו את ה-CM-PBS ולאחר מכן פיפטה 6 מיליליטר של חיץ מפחית מעל התאים, והשאירו את הדגימה על קרח למשך 15 דקות.

לאחר מכן, החלף את המדיום ב-6 מיליליטר של חיץ מפחית טרי והניח את הדגימה על קרח למשך 15 דקות נוספות.

שלב זה הוא קריטי, שכן הגלוטתיון שנמצא במאגר המפחית יקרע את חלקיקי הביוטין שנותרו על פני התא. זה מבטיח שרק חלבונים מופנמים יהיו מוטים ומסומנים.

לאחר מכן, הסר את תמיסת ההפחתה והחלף אותה ב-6 מיליליטר של מאגר מרווה. השאירו את הדגימה על קרח למשך 15 דקות נוספות וחזרו על שלב המרווה פעם נוספת. לאחר מכן, השליכו את מאגר המרווה ושטפו את התאים שלוש פעמים עם 4 מיליליטר PBS צונן.

שאפו את ה-CM-PBS ולאחר מכן, גרדו את התאים ל-1 מיליליטר של PBS צונן באמצעות מרים תאים, והעבירו את המתלה לצינור מיקרו-צנטריפוגה. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 100 גרם למשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה.

השאירו את הדגימה על קרח למשך 30 דקות ומערבולת כל חמש דקות. צנטריפוגה את הליזאט ב-14,000 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את חומר הניקוי והחומרים המסיסים. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.

בעזרת קצה פיפטה חתוך, מוסיפים לליזאט 150 מיקרוליטר מתמיסת הסטרפטווידין אגרוז ודוגרים אותה בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות על שייקר. לאחר שלוש שעות, גלולה את חרוזי הסטרפטווידין אגרוז על ידי צנטריפוגה ב -1,500 גרם למשך 30 שניות ב -4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של מאגר כביסה ונדנדו אותם למשך שלוש דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. גלול את החרוזים והשליך את הסופרנטנט.

חזור על תהליך זה ארבע פעמים נוספות כדי למזער את הקישור הלא ספציפי של חלבונים ציטוזוליים שאינם ביוטיניליים. לאחר מכן, גלו את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב-1,500 גרם למשך 30 שניות ב-4 מעלות צלזיוס. השלך את מאגר הכביסה שמעליו, והוסף 50 מיקרוליטר של מאגר טעינה 1x.

שחררו ביוטין וסטרפטווידין מהחרוזים על ידי דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס. חלק זה צריך להכיל חלבונים מופנמים על פני התא בלבד. לאחר מכן, הפרד את הקלט, משטח התא והשברים הלא קשורים על ידי SDS-PAGE ונתח על ידי Western Blotting.