זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

תאי גזע עצביים ותאי ניוון יכולים לחדש את עצמם ולהתבדל לסוגי תאים עצביים שונים, לתמוך בפיתוח מערכת העצבים ולהציע משאב לרפואה רגנרטיבית. תאים אלה הם הטרוגניים, ואנחנו צריכים לדעת סמני פני התא הספציפיים שלהם על מנת לקבל אוכלוסיות תאים מטוהרים ולהבין את הפונקציות שלהם. הפרוטוקול שלנו מספק טכניקה פשוטה, רגישה ויעילה לניתוח חלבוני קרום של תאי גזע עצביים ראשוניים ותאי צאצא, ומסייע בזיהוי סמני משטח חדשניים עבור תאים אלה.

היתרון העיקרי של הפרוטוקול שלנו הוא היכולת לנתח ישירות את פרוטיום פני השטח של גזע עצבי ראשוני ותאי צאצאים עם רגישות משופרת וספוטריות. זה מושגת על ידי הרחבת אותם באמצעות שיתוף תרבות בתוך תאים אנדותל במבחנה גבוהה תאית פנימית המתיחה MAPK-ERK מסלול תווית נקבוביות פני השטח. עם נקבוביות בעד שינויים בהרחבת תאי גזע במבחנה, ניתן ליישם בקלות את הפרוטוקול שלנו כדי לזהות סמני משטח של סוגי תאי גזע אחרים.

כדי להכין את תאי ה אנדותל, להשעות מחדש גלולת תא BEN3 מצלחת פטרי 10 ס"מ ב 90% confluence עם תשעה מיליליטר של מדיום תא BEN3. הוסף מיליליטר אחד של ההשעיה של התא לתוספה תמיכה חדירה אחת. הוסף עוד שני מיליליטר של מדיום BEN3 ל באר בתא התחתון של המטריצה.

המשך לתרבת את התאים ליום אחד ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. יום אחד לאחר ציפוי התאים בתוספות, שאפו בעדינות את המדיום, תחילה מהתא התחתון ולאחר מכן מהתוספות. לשטוף את הפנים של מוסיף שלוש פעמים עם DMEM מחומם מראש.

לשטוף את המשטח החיצוני של מוסיף על ידי שטיפה עם DMEM מחומם מראש. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של AM מחומם מראש להוספה אחת. מעבירים את המוסיף לתוך הבאר עם תאים קליפת המוח העיקריים.

הדגירה את התרבות השיתוף ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 12 שעות. להמיס Ac4ManAz ב DMSO כדי להשיג ריכוז מניות של 200 מילימולר. אחזר את צלחת התרבות הנוירלית-אנדותל מהאינקובטור.

הוסף מיקרוליטר אחד של מלאי Ac4ManAz לכל תא תחתון ו- 0.5 מיקרוליטר לכל הכנסה לתרבות ה-CO. תרבו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני במשך חמישה ימים. בעוד התאים הם culturing להוסיף 100 microliters של RM לכל הכנסה ו 200 microliters של RM לכל תא התחתון כדי להאכיל מחדש את התאים אנדותל ונוירונים כל יומיים.

ראשית להסיר את המוסיף מן הצלחות שיתוף תרבות שאף את מדיום התרבות מתחתית בארות. הבא לשטוף את התאים העצביים פעם אחת עם PBS מחומם מראש. שאפו את ה-PBS מה בארות והוסיפו מיליליטר אחד של פרפורמלדהיד מקורר מראש של 4% ב-PBS לכל באר.

לתקן את התאים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש. שאפו את ה-PBS והוסיפו מיליליטר אחד של חיץ תכלית ביוטין טרי 1 לתוך כל באר.

דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן, שאפו את מאגר התגובה מה בארות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ כתמים לכל באר של תאים ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.

לאחר מכן, שאפו את מאגר הכתמים מה בארות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש. הוסף מיליליטר אחד של חיץ חסימה לכל באר של תאים ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הסר את מאגר החסימה מה בארות והוסף מיליליטר אחד של פתרון נוגדנים ראשוני לכל באר.

דגירה התאים לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להסיר את פתרון הנוגדן העיקרי מה בארות. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש.

שאפו את ה-PBS מה בארות והוסיפו מיליליטר אחד של נוגדן משני לכל באר. דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר מכן, שאפו את הפתרון מה בארות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS מקורר מראש.

ראשית, הכינו את קומפלקס ה-BTTAA קופריק סולפט 2, חיץ מתלים מחדש של חלבון מלא, חיץ שטיפת חלבונים 1, חיץ שטיפת חלבונים 2 וחוצץ שטיפת חלבונים 3 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הסר את ההוספות מצלחות התרבות ה-שותף. שאפו את מדיום התרבות מה בארות התחתונות ושטפו את התאים העצביים פעם אחת עם PBS מקורר מראש.

שאפו את ה-PBS והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מאגר RIPA מקורר מראש לכל באר. הדגירה את הצלחות על הקרח במשך חמש דקות ואז לאסוף את ת ליסיס החלבון לתוך 1.5 צינורות מיליליטר. צנטריפוגה ב 12000 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי גלולה פסולת התא.

להעביר את supernatant לתוך צינורות חדשים 1.5 מיליליטר ולקבוע את ריכוז החלבון עם ערכת BCA על פי הוראות היצרנים. לאחר מכן, להתאים את ריכוז החלבון למיליגרם אחד למיליליטר. הוסף 100 ביוטין אלקיד מיקרומולרית, 2.5 מילימולר נתרן אסקורבאט ו 1XBTTAA קומפלקס גופרית קופרית 2 עד 1 מיליליטר של תות חלבון.

מערבבים היטב את הפתרון ומדרגרים אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה. לאחר מכן, להעביר את פתרון התגובה לתוך 20 מיליליטר של מתנול מקורר מראש בצינור חרוט 50 מיליליטר. מערבבים היטב ו דגירה לילה במינוס 30 מעלות צלזיוס כדי לזרז את החלבונים.

צנטריפוגה ב 4500 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי גלולה את משקעי החלבון. לשטוף את גלולה פעמיים באמצעות 20 מיליליטר של מתנול מקורר מראש לכל לשטוף. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת החלבון בארבעה מיליליטר של חיץ מתלים מחדש.

מעבירים את ההשעיה מחדש של החלבון לצינור חרוט חדש של 15 מיליליטר. לשטוף 50 microliters של חרוזים סטרפטבידין שלוש פעמים עם PBS. מוסיפים את חרוזי השטוף לחלבון מתלים מחדש ודורגים את הפתרון בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות על מסובב אנכי במהירות סיבוב של 20 סל"ד.

לאחר מכן, לשטוף את חרוזים ברצף עם כל מאגר כביסה המוצג כאן. להשעות מחדש את חרוזים שטף עם 20 microliters של PBS ולהעביר אותם לתוך צינור חדש 1.5 מיליליטר. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מאגר טעינת חלבונים 2X וטפלו ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן לעבד את דגימות החלבון עם SDS-PAGE ולהכתים אותם עם כחול מבריק קומאסי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה NSPCs עובריים ראשוניים מורחבים ומתויגים באופן מטבולי במבחנה. תרבות אנדותל מוצלחת מובילה את NSPCs ליצור שיבוטים גדולים דמויי גיליון.

כשל חיסוני בנוגדנים מגלה כי בשכפול, רוב התאים הם NSPCs חיוביים של נסטין, בעוד שמעטים מאוד הם בטא טובולין 3 תאים עצביים חיוביים. לעומת זאת, אחוז התאים החיוביים של נסטין ובטא טובולין 3 תאים עצביים חיוביים בשכפולים שנוצרו במערכת שאינה תרבתית הם כמעט זהים. הכתב הכימי Ac4ManAz הוא אנלוגי מטבולי והוא יכול להיות משולב לתוך מסלול סיאליציה חלבון מהותי.

ריכוז תיוג ממוטב של 100 מיקרומולרים עבור NSPCs ראשוניים משמש והערכה משולבת של מוות תאי המצוין על ידי מורפולוגיה תאית וגוקלית מצביעה על כך שריכוז תיוג זה אינו גורם לאפקטים ציטוקסיים ברורים והוא מסוגל לסמן ביעילות NSPCs. המורפולוגיה המשובטת, פוטנציאל ההתחדשות העצמית והבידול של NSPCs הן בתרבות ה אנדותל והן במערכת שאינה תרבות-שותפים אינם מושפעים. דגימות חלבון שהוכנו מתרבות Ac4ManAz שכותרתו על ידי הטיית ביוטין וטיהור חטיף סטרפטבידין מראות אות כתמים כחול מבריק קומאסי חזק בג'לים SDS-PAGE.

בינתיים היו רק אותות רקע מכתימים ואותות מחייבים לא ספציפיים בנתיבים עמוסים בדגימות חלבון מקבוצה הבקרה של DMSO. הדבר מציין גם את התיוג היעיל של NSPCs על-ידי Ac4ManAz. בעת ניסיון פרוטוקול זה, כל הפתרונות הדרושים לתגובה biocellular צריך להיות מוכן טרי זמן התגובה צריך להיות נשלט בחוזקה כדי למנוע מעל תגובה לא מספקת.

בעקבות הפרוטוקול שלנו ניתן לנתח את המבנה של הגליקן המועשר בתאי גזע עצביים. הפרוטוקול שלנו של גזע עצבי וחלבוני משטח מועשרים בתאי האב לא רק עולים סמנים אלא גם ממלאים תפקידים חשובים באסטרטגיית טיהור הדפוסים המוגבהת ובהמחשה של מעגלי אותות קשיחים עבור אוכלוסיית תאים זו.