חילוץ מדגם, כימות כרומטוגרפי סימולטני של דוקסורוביצין, מיטומיצין C שלאחר משלוח סמים בשילוב של חלקיקים נושאות לעכברים

המטרה הכוללת של פרוטוקול אנליטי זה היא לחלץ ולכמת בו זמנית את שתי התרופות האנטי-סרטניות דוקסורוביצין ומיטומיצין C, המועברות במשותף על ידי ננו-חלקיקים היברידיים פולימרים-שומנים, והמטבוליט של דוקסורוביצין, דוקסורוביצינול, במטריצות ביולוגיות באמצעות שיטת כרומטוגרפיה נוזלית פשוטה וחזקה של פאזה הפוכה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום בננו-רפואה, כגון כיצד לתכנן מערכת ננו-נשיאה יעילה המבוססת על ננו-פרמקוקינטיקה של שילובי תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת כימות בו זמנית של שלוש תרכובות תרופות באותה מטריצה ביולוגית, ללא צורך בשינוי השלב הנייד של HPLC.

לכן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ההתנהגויות הביולוגיות של דוקסורוביצין, מיטומיצין C ודוקסורוביצינול בגידולי שד ראשוניים. ניתן ליישם אותו גם על סוגי סרטן אחרים המטופלים בתרופות דומות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד שלבי הכנת דגימה יעילים.

כדי להתחיל בהליך זה, אסוף והקפיא את כל הדם, האיברים העיקריים וגידול השד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שקלו במהירות את הרקמות הקפואות ורשמו את המשקל בפנקס הפתקים של המעבדה. לאחר מכן, העבירו אותם לצינור חרוטי תחתון עגול של 13 מיליליטר.

לאחר מכן, הוסף בין מיליליטר לחמישה מיליליטר של מאגר ליזה תאים קר כקרח. בעזרת הומוגנייזר ידני חשמלי, הומוגניזציה של הרקמה בתנועת מהלך למעלה ולמטה על קרח ב-18,000 סל"ד. לאחר מכן, שטפו את בדיקת מחולל השיניים המסור 10 מילימטר של ההומוגנייזר במים מזוקקים דה-יונים.

שטפו את הגשושית עם אתנול 70%, ולאחר מכן שוב במים מזוקקים. העבירו 50 מיקרוליטר של רקמה הומוגנית או דם מלא לצינור מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, ספייק עם חמישה מיקרוליטר של 2,000 ננוגרם למיליליטר תקן פנימי 4-MethylUmbelliferone.

הוסף ממס מיצוי קר כקרח המכיל 150 מיקרוליטר אצטוניטריל ו -100 מיקרוליטר של חמישה מילי-מולרי אמוניום אצטט. מערבלים במרץ את התערובת במשך שתי דקות. צנטריפוגה בחום של 3, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן, העבירו 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי ומקורר מראש. השתמש בזרם איטי של גז חנקן כדי לאדות את הסופרנטנט ב-60 מעלות צלזיוס עם הגנה מפני אור. לאחר מכן, הרכיבו מחדש את השאריות המיובשות עם 100 מיקרוליטר מתנול קר כקרח.

מערבולת נמרצת למשך 30 שניות. צנטריפוגה בחום של 3, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לתוך בקבוקון HPLC.

הנח את בקבוקוני הדגימה במגש דגימה אוטומטית להזרקה. כדי להתחיל, הכן את שלב הנייד של HPLC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגדר את התנאים ההתחלתיים של הרכב הפאזה הניידת ל-16.5% H2O ו-83.5% אצטוניטריל.

הגדר את קצב הזרימה האיזוקרטי ל-1.0 מיליליטר לדקה. לאחר מכן, הפרד את התרופות באמצעות מצב פאזה ניידת שיפוע כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הגדר את גלאי ה-UV בשני ערוצים: האחד ב-310 ננומטר עבור תקן פנימי 4-MethylUmbelliferone והשני ב-360 ננומטר עבור Mitomycin C.לאחר מכן, הגדר את הערוץ הראשון של גלאי הפלורסנט לאורך גל עירור של 365 ננומטר, ואורך גל פליטה של 445 ננומטר עבור 4-MethylUmbelliferone.

הגדר את הערוץ השני לאורך גל עירור של 480 ננומטר, ואורך גל פליטה של 560 ננומטר עבור דוקסורוביצין ודוקסורוביצינול. כדי להתחיל, השתמש בדגימה האוטומטית כדי להזריק 15 מיקרוליטר מהדגימה. הרכב הפאזה הניידת של השיפוע המתוכנת משתנה אוטומטית על ידי הגדלת הרכב האצטוניטריל מעל אפס ל-18 דקות.

לאחר 18 דקות, מצב השלב הנייד מוחזר למצב ההתחלתי ומתאזן מחדש לזריקה הבאה. לאחר הפעלת כל דגימה, שימו לב לפסגות של תרכובות התרופה ולזמני החזקתן. לאחר מכן, השתמש בתוכנת HPLC כדי לשלב את אזור השיא מתחת לעקומה עבור תרכובות התרופה.

חשב את אחוז ההחלמה מהתרופה ואת השטח מתחת ליחס העקומה בין כל תרכובת תרופה לתקן הפנימי, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בהליך זה, שתי תרופות אנטי-סרטניות, דוקסורוביצין ומיטומיצין C, יחד עם מטבוליט דוקסורוביצין, דוקסורוביצינול, מתגלות ללא התערבות ביולוגית. ניתוח HPLC מראה שכל תרופה מופרדת היטב מהאחרות.

שיטת HPLC שפותחה מציגה שונות של פחות מ-15% ברמת הדיוק והדיוק היומית של כל אחת מהתרופות הנחקרות, הן בדם מלא והן במטריצות ביולוגיות שונות, מה שמעיד על יכולת שחזור מצוינת. לאחר מכן נקבעת ההתפלגות הפרמקוקינטית והביולוגית של אספקה משותפת מבוססת ננו-חלקיקים במחזור ארוך או מבוססת פגיל של דוקסורוביצין ומיטומיצין C. בדם, ריכוזי התרופה המועברים על ידי ננו-חלקיקים היברידיים פולימרים-ליפידים לאורך זמן נראים גבוהים לפחות פי שישה מאשר בתמיסות התרופות החופשיות המקבילות.

בגידול שד אורתוטופי, ננו-חלקיקים היברידיים פולימרים-ליפידים יכולים לספק במשותף דוקסורוביצין ומיטומיצין C ביחס התרופות הסינרגטי שלהם. בהשוואה לתמיסת תרופות חופשיות, ננו-חלקיקים נראים כבעלי הצטברות גידול מוגברת. זאת בשל המחזור השיטתי הממושך, המאפשר לננו-חלקיקים לנצל את השפעות החדירות והשימור המשופרות של הגידול.

היווצרות כמותית נוספת של דוקסורוביצינול בגידול השד במשך 24 שעות, יחד עם אפופטוזיס גידול משופר, מצביעה על כך שהזמינות הביולוגית של התרופה היא קריטית בתכנון ניסוח יעיל של ננו-חלקיקים. באמצעות שיטת HPLC זו, הוכח בהצלחה כי ננו-חלקיקים היברידיים פולימרים-ליפידים יכולים להעביר במדויק שילוב תרופות סינרגטי לתאים סרטניים in vivo, מה שמוביל לשיפור הכימותרפיה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

כדי למזער ביזה פוטנציאלית של תרופות, חשוב לזכור להימנע מאור שמש ישיר ולשמור את הדגימה על קרח בזמן ניסיון הליך זה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום הננו-רפואה לחקור את הננו-פרמקוקינטיקה של שילוב התרופות, ולתכנן טוב יותר את ניסוח הננו-חלקיקים היעיל לטיפול בסרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין כיצד לחלץ בו זמנית ולזהות את המטבוליט של דוקסורוביצין, מיטומיצין C ודוקסורוביצין, דוקסורוביצינול, על פני טווחים רחבים של הדגימות הביולוגיות המכילות ננו-חלקיקים טעונים את שילוב התרופות.

אל תשכח שעבודה עם תרופות אנטי סרטניות וחומצה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש ליישם אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות, משקפי מגן ומעילי מעבדה בעת ביצוע פרוטוקול זה.