כימות של מידע מקודד על ידי גנים ביטוי רמות במהלך תוחלת החיים אפנון תחת הגבלת תזונה מגוון רחב C . elegans

המטרה הכוללת של מסגרת זו היא לזהות גנים המעורבים בהגבלה תזונתית רחבת טווח, לכמת את המידע הסביבתי המקודד על ידי רמות הביטוי שלהם ולהבין את אסטרטגיית הקידוד הבסיסית המקשרת בין הסביבה לתוחלת החיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה של ההזדקנות, כגון, אילו גנים מעבירים מידע מהסביבה כדי לווסת את תוחלת החיים. למרות שמסגרת זו יכולה לספק תובנה על מערכת החישה C Elegan, ניתן ליישם אותה באופן כללי יותר על כל מערכת ביולוגית שמרכיביה משתפים פעולה, כדי לעבד מידע סביבתי.

היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מכמתת את המידע הסביבתי המקודד על ידי קבוצות של נוירונים וקובעת את אסטרטגיית הקידוד המופעלת על ידי נוירוסלקוויטים כדי להעביר מידע זה למטרות במורד הזרם. לאחר גידול OP50 על לוחות MGM על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו 500 מיליליטר של מדיום LB בכל אחת משתי צלוחיות ארלנמאייר ליטר ובצעו חיטוי. חסנו כל בקבוק במושבה אחת של OP50 וגדלו את התרביות ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך כ-14 שעות.

לאחר מכן, השלימו את התרבויות עם 50 מיקרוגרם למיליליטר סטרפטומיצין. לאחר מכן מנערים את הצלוחיות למשך 30 דקות נוספות בחום של 37 מעלות צלזיוס, לפני שמניחים את הצלוחיות על קרח למשך 15 דקות. העבירו 450 מיליליטר מכל תרבית לבקבוקי צנטריפוגה סטריליים נפרדים של 500 מיליליטר, שמרו את שאריות התרבות על קרח, מכיוון שהיא תשמש לקביעת ריכוז החיידקים.

סובבו את הבקבוקים בחום של 4500 x G וארבע מעלות צלזיוס למשך 25 דקות, ואז השליכו את הסופרנטנט ואחסנו את הבקבוקים על קרח. עם 900 מיקרוליטר LB סטרילי, יש לדלל 100 מיקרוליטר של שאריות תרבית מכל בקבוק. השתמש במיליליטר אחד של LB סטרילי כדי לאפס את הספקטרופוטומטר ולאחר מכן קבע את ה-OD600 של הדילול פי 10 של כל תרבית.

אם לדוגמה, ה-OD600 של הדילול פי 10 של תרבית הלילה הוא 0.28, אז לתרבית היה OD600 בפועל של 2.8. מדוגמה זו, כדי להגיע לתמיסת מלאי עבודה של 1.12 x 10 לתאי OP50 העשיריים למיליליטר, השווה ל-OD600 של 56, השעו מחדש את הגלולה מתרבית 450 מיליליטר ב-20 מהנפח המקורי או 22.5 מיליליטר של תמיסת בסיס סטרילית S או SB, בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין. בצע את כל הריכוזים הבאים המשמשים בניסויים ב-SB ובסטרפטוקוק, מדילולים סדרתיים של המלאי העובד, תוך שימוש בגורמי הדילול המפורטים בטבלה זו.

לאחר תרבית וסנכרון זני דיווח C Elegans על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש ב-15 מיליליטר SB כדי לשטוף באופן סדרתי את התולעים משלוש הצלחות ולאסוף את הנוזל בשפופרת סטרילית של 15 מיליליטר. אפשר לזחלי L4 לשקוע באופן טבעי ואז לשאוב את כל הנוזל מלבד כ-0.5 מיליליטר. בזני הדיווח מסוג הבר, סוג זה מסיר את כל הזחלים הצעירים מרקע מוטנטי L4.In, שלב זה מסייע בהסרת כל זחל שנעצר כמו שלנו, במקרה של מוות של OK3125.

לאחר מכן, השתמש בתשעה מיליליטר של SB כדי להשעות מחדש את התולעים. שוב, עקוב אחר קצב המשקע של זחלי L4 ולאחר מכן שאב את כל הסופרנטנט מלבד כ-0.5 מיליליטר לאחר שרוב זחלי L4 גלו לפני שתחזור על התהליך. הוסף 10 מיקרוליטר של מדיום בסיס סטרילי S, בתוספת 0.1% פלורוני F127 לנוזל המכיל את זחלי L4.

זה משמש כחומר פעילי שטח ומונע מהזחלים להיצמד למשטח הפנימי של קצות פיפטות הפלסטיק. בעזרת קצה פיפטה עם שמירה נמוכה P200, השעו בעדינות את הזחלים, ולאחר מכן הניחו 150 מיקרוליטר על שלוש צלחות RNAi של 10 סנטימטר שנזרעו עם 5 x 225 מיקרוליטר של ביצה חמישה חיידקי RNAi. ודא שהתולעים מפוזרות באופן שווה על פני כל חמשת מדשאות החיידקים.

לאחר שהנוזל נספג באגר, הסר את כל הזחלים שאינם L4 מהצלחות שלא חוסלו בהליך הכביסה, על ידי איסוף ידני שלהם. לאחר מכן אחסן את הצלחות בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. כדי ליזום DR בטווח רחב, בחר את כל הזחלים הצעירים שנמלטו משלב ההסרה הידני הקודם, והשאיר רק את הבוגרים בני היום על הצלחות.

עבור כל זן, השתמש ב-15 מיליליטר של סטרפטוקוס SB סטרילי, כדי לשטוף את המבוגרים בני היום משלוש הצלחות, לתוך צינור של 15 מיליליטר. אפשרו לתולעים לשקוע באופן טבעי ואז שאפו את כל הסופרנטנט מלבד 0.5 מיליליטר. השעו מחדש את התולעים עם 9.5 מיליליטר סטרפטוקוקוקוס SB וחזרו על שלבי השקיעה והשטיפה.

לאחר השטיפה הסופית והשאיפה של כל הסופרנטנט מלבד 0.5 מיליליטר, הוסף 10 מיקרוליטר של SB Plu והשתמש בקצה פיפטה P200 כדי לתלות מחדש בעדינות את הזחלים. הציגו 100 מיקרוליטר מהזחלים על צלחת NSC, זרעים עם 5 x 225 מיקרוליטר חיידקים, בריכוז של 2 x 10 לתאים התשיעי למיליליטר. מחלקים את 100 המיקרוליטר באופן שווה על פני כל חמשת מדשאות החיידקים.

תחת מיקרוסקופ, העריכו את מספר בעלי החיים הנמצאים על הצלחת, במטרה להגיע בין 100 ל-150 תולעים לצלחת. קבע את נפח הנוזל הנדרש להשגת צפיפות תולעת בטווח זה ולאחר מכן העבר אותו לשתי צלחות נוספות. התאם את מספר התולעים בצלחת הראשונה כך שייכנס גם לטווח זה.

ואז אחסן את הצלחות בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, אספו את הבוגרים בני היומיים וחלקו את התולעים לצלחות NSC חדשות שנזרעו עם הרצון לריכוז ניסיוני של מזון. לאחר שהנוזל נספג באגר, העבירו את הצלחות לטמפרטורת הניסוי הרצויה למשך 24 שעות.

למחרת, אספו את הבוגרים בני שלושת הימים וחלקו אותם לצלחות NSC טריות, עם אותו ריכוז ניסיוני של מזון. לאחר שהנוזל נספג באגר, החזירו את הצלחות לטמפרטורת הניסוי למשך 48 שעות. לבסוף, השתמש במכשיר מיקרופלואידי כדי לדמות את החיות לפני הרכבה וכימות של הנתונים על פי פרוטוקול הטקסט.

כפי שמוצג כאן, תוחלת החיים הממוצעת של זן n2 מסוג פראי, מציגה תגובה מורכבת ל-DR בטווח רחב. עוצמת התגובה הזו מוחלשת במוטציה של הגן daf-7, מה שמרמז על כך שגן זה משפיע על יכולתה של התולעת להגיב נכון לשינויים בשפע המזון. רמות הביטוי הממוצעות של מדווח שעתוק עבור הגן daf-7 ורקע הסוג הפראי, מציגות גם תגובה מורכבת לא מונוטונית לטווח רחב DR.In ה-daf-7 (רקע גנטי, הביטוי של מדווח שעתוק זה מוחלש מאוד ומראה תגובה מועטה לשינויים ברמת המזון. איור זה ממחיש את הערכת ההתפלגות המשותפת של ביטוי TPH1 בתאי עצב ADF וביטוי daf-7 בתאי עצב ASI עבור רמת מזון נתונה.

גרפי עמודות אלה מציגים את מידע המזון המקודד, באופן משולב או פרטני, על ידי נוירונים ADF, ASI ו-NSM, בהתבסס על רמות ביטוי הגנים של TPH1 ו-daf-7. תווים מיותרים וסינרגטיים של הקידוד, נובעים מההשוואה בין מידע קומבינטורי ואינדיבידואלי המקודד על ידי נוירונים המיוצגים על ידי ההבדל בגובה הפסים המוערמים מימין והמידע המקודד על ידי המעגל המלא. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי שכפול תורת המידע כדי לכמת את אסטרטגיית הקידוד דורש הערכה מדויקת של התפלגות ביטוי הגנים.

מסיבה זו, גודל המדגם הוא גורם קריטי לתחולה הכללית של מסגרת זו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע ניסויים בהגבלת תזונה בטווח רחב כדי לזהות ולאפיין גנים חדשים המקשרים בין שפע מזון לתוחלת החיים.