כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא לכמת את היכולת של מונוציטים מדגימות קליניות אנושיות לעבור נדידה טרנסאנדותל ויצירת תאי קצף. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום הלב וכלי הדם כגון הפוטנציאל האטרוגני של תאים מאנשים הנמצאים בסיכון למחלת עורקים כליליים חריפה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד דגימות קליניות הן מדם מלא טרי והן מקבוצות מטופלים מאוחסנות.

יתר על כן, ניתן לכמת את היווצרות תאי הקצף הן על ידי מיקרוסקופיה והן על ידי ציטומטריית זרימה. ראשית, הכינו את ג'לי הקולגן הפולימריים מתרחיף קולגן טרי. לצינור פוליסטירן של חמישה מיליליטר, הוסף נתרן הידרוקסיד, ואז 10 פעמים M199, ואז חומצה חומצית, ולבסוף, הוסף קולגן סיבי.

מערבבים את זה היטב על ידי פיפטינג. לאחר מכן, הזרימו 50 מיקרוליטר לבארות הפנימיות של צלחת תרבית רקמות סטרילית עם תחתית שטוחה של 96 בארות. בקצוות החיצוניים של בארות, טען 200 מיקרוליטר של פעם אחת Dulbecco PBS כדי למנוע התייבשות.

לאחר שעתיים של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הקולגן יתפלמר. לאחר מכן, כסו את הג'לים ב-150 מיקרוליטר של M199 חד פעמי ודגרו אותם עד הצורך לשימוש חמישה ימים לאחר מכן. כדי להרחיב את תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי המאוחסנים, הכינו בקבוק תרבית בגודל 25 סנטימטר רבוע עם מיליליטר אחד של תמיסת פיברונקטין ודגרו את המנה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

בינתיים, הפשירו את התאים המאוחסנים באמבט מים כדי להשעות אותם מחדש ב-M20. לאחר הפשרת התאים, שאפו כל תמיסת פיברונקטין שנותרה מהצלחת וצלחו את התאים. לאחר מכן, תרבית למפגש על ידי החלפת המדיה לאחר יומיים-שלושה.

ה-HUVECs צריכים להיות מתכנסים ביום החמישי של התרבות. נתק אותם על ידי שאיבת הסופרנטנט של התרבית מהבקבוק, ולאחר מכן שטוף את החומר המכיל סרום באמצעות שניים עד שלושה מיליליטר של פעם PBS. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטר של טריפסין מדולל ודגרו על התאים לזמן קצר בטמפרטורת החדר תוך ניעור התאים בעדינות עד שהם נראים מנותקים.

לאחר מכן, אספו אותם במהירות עם חמישה מיליליטר M20 והעבירו את המתלה לצינור של 10 מיליליטר ותאים צנטריפוגים. כעת, השעו מחדש את התאים ב-M20 ב-200,000 תאים למיליליטר. לאחר מכן, שאפו את ה-M199 מצלחת הקולגן המוכנה והוסיפו 100 מיקרוליטר HUVECs לכל ג'ל.

המשיכו בתרבות במשך שלושה ימים. ביום השמיני של גידול ה-HUVECs, הפעל את החד-שכבות לפני הוספת המונוציטים. לאחר שאיבת אמצעי הכיסוי, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת TNF-אלפא אנושית לכל באר.

לאחר מכן, דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה יש להסיר את המדיה ולשטוף את הג'לים פעמיים באמצעות 100 מיקרוליטר M199 לכל שטיפה. כעת, הוסף 50,000 מונוציטים מבודדים טריים או תת-קבוצות מונוציטים מטוהרות ב-100 מיקרוליטר של M20 לחד-שכבות HUVEC.

לאחר הוספת המונוציטים, דגרו על הצלחת למשך שעה כדי לאפשר גלגול קדימה של התאים. לאחר שעה, אוספים את התאים הלא מועברים בתמיסת כביסה. התחל באיגום שתי שטיפות EGTA באמצעות 100 מיקרוליטר לבאר.

לאחר מכן, סובב את תמיסות הכביסה המשולבות ב -300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב-30 מיקרוליטר של PBS וספרו את התאים כדי לקבוע את אחוז התאים שהועברו קדימה. כעת, שטפו בארות צלחת פעם אחת עם M199 והוסיפו 100 מיקרוליטר M20 טרי לבארות הצלחות ודגרו על הצלחת למשך יומיים.

לאחר יומיים, חזור על ההליך לאיסוף התאים הלא מותמרים בתמיסת שטיפת EGTA על מנת לאסוף תאים שהועברו הפוכה ולהמשיך בניתוח פנוטיפי של התאים. כדי לאפיין פנוטיפית את התאים הקשורים לג'ל על ידי ניתוח FACS, עכל את התאים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של קולגן D ב-37 מעלות צלזיוס ודגירה למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, יש להשרות את הג'לים בעזרת קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר ולדגור אותם למשך 20 דקות נוספות כדי לעכל את הג'לים במלואם.

לאחר העיכול המלא, סנן ואגד את הג'לים המשוכפלים המעוכלים דרך רשת ניילון של 35 מיקרון לתוך צינור FACS על קרח. כעת, שטפו את התאים המסוננים פעם אחת עם תמיסת כביסה קרה של FACS. צנטריפוגה את התאים והשעיה אותם מחדש ב 100 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה קרה.

לאחר מכן, בצע צביעה וניתוח של FACS בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כדי לנתח את התאים במיקרוסקופיה, תחילה צבעו את התאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לנתק את התאים המוכתמים, שפכו את הבארות באמצעות מחט בגודל 21 כשהשיפוע פונה כלפי חוץ.

לאחר מכן, הכינו שקופיות להרכבת הג'לים. אגרוף שני חורים קטנים לרצועת סרט דו צדדי ואז קבע את הסרט לשקופית והסר את ציפוי המגן. לאחר מכן, הוסף טיפת מים לכל חור בקלטת.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו בעדינות שני ג'לים על שני החורים וכסו את הסרט. לבסוף, חבר בזהירות כיסוי לקלטת והמשך בהדמיה של התאים. לאחר הגלגול, תאים שלא עברו טרנסגרציה נספרו כמתואר.

בסך הכל נמצאו 15,000 תאים שלא עברו טרנספורמציה, ואחוז הגלגול קדימה נקבע כ-95% לאחר 48 שעות של דגירה נוספת, נמצאו 36,000 תאים שעברו העברה הפוכה שהסתכמו ב-12.6% גלגול הפוך. צביעת הג'לים בשמן אדום O חשפה תאי קצף שצוינו על ידי חיצים לבנים ומקרופאגים שצוינו בחיצים שחורים. מונוציטים אלה טופלו ב-LDL מחומצן במהלך גלגול, חומר המשמש להשראת היווצרות תאי קצף במודלים קונבנציונליים של אינדוקציה של תאי קצף.

נתוני ספירת תאים מצטברים מ-12 תורמים אישרו כי הדגירה של מונוציטים עם LDL מחומצן גרמה להיווצרות תאי קצף רבה יותר מאשר כאשר מונוציטים מודגרים עם מדיה מקורית של LDL או M199 בלבד. התאים שהועברו נותחו גם על ידי ציטומטריית זרימה. לאחר אי הכללת תאים מתים, כפולים ו-HUVECs שליליים CD45, נבחרה האוכלוסייה העיקרית של תאים נודדים ועוצמת הקרינה הממוצעת של הקולטנים המעניינים הושוותה לנתוני בקרת הקרינה מינוס אחד או איזוטיפ.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בבדיקה זו כדי לכמת נדידה טרנסאנדותל מונוציטים והיווצרות תאי קצף מדגימות קליניות אנושיות. אל תשכח שעבודה עם דגימות קליניות אנושיות עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש להשתמש בטכניקת מעבדה טובה.