ספיגת נוזלים באף ובסימפונות: דגימה מדויקת של רירית מערכת הנשימה האנושית, מעבדה בעיבוד של דגימות
21 בינואר 2018
כתב יד זה מתאר את השימוש בטכניקות קליטה באף ובסימפונות, ובמיוחד באמצעות מטריצות ספיגת ידע סינתטי (SAM) לדגימת הנוזל שורות mucosal (MLF) של דרכי הנשימה העליונים והתחתונים. שיטות אלה מספקים יותר סטנדרטיזציה והסבילות מאשר קיימות טכניקות הנשימה הדגימה.
היום, אנו הולכים להדגים את הטכניקה של ספיגת האף, צורה של דגימה רירית מדויקת באמצעות מטריצה סופגת סינתטית לספיגת נוזל רירית הרירית. דגימת האף מורכבת מידית ו-SAM בצינור קריוטי סטרילי. ה-SAM מורכב מפולימרים, סיבים או קצף, ונבחרו במיוחד להיות רכים וסופגים, עם פתילה מהירה לאיסוף דגימות.
ל-SAMs יש גם קשירת חלבון מינימלית, כדי לאפשר פליטה יעילה של הפרשות נספגות. ספיגה באף היא טכניקה עדינה מאוד ולא פולשנית שניתן לבצע בחולים בכל הגילאים, כולל תינוקות. בנוסף, דגימה סדרתית, אפילו כל כמה דקות, אפשרית.
בעת ביצוע ספיגה יש לשטוף תחילה את הידיים וללבוש כפפות, רצוי מול המטופל. ראשית בודקים את חלל האף. אנו ממליצים להשתמש בפנס ראש ולקלינאי להשתמש באגודל הלא דומיננטי שלו כדי למשוך את אפו של המטופל כדי לדמיין את חלל האף.
בדרך כלל אין צורך בספקולום באף. אם אתה מסתכל לתוך חלל האף, הנחיריים, או הנחיריים, אינם עגולים בחתך רוחב והם הולכים ישר לאחור. בדרך כלל אתה רואה את הטורבינאט התחתון כבליטה, שקע בדופן הצדדית של הנחיר, כאשר מחיצת האף יוצרת את הדופן המדיאלית החלקה והשטוחה.
אנו רוצים לדגום מהטורבינטה הנחותה הזו מכיוון שהאפיתל הבסיסי הוא אפיתל ריסני פשוט של דרכי הנשימה. בעת הדגימה, ה-SAM של ספיגת האף מועבר בעדינות במעלה הלומן, ומכוון אותו כך שיהיה שטוח כנגד הטורבינט התחתון. לאחר מכן השתמשו באצבע המורה כדי ללחוץ את ה-SAM על רירית האף.
זה יכול לגרום לדגדוג קל עם דמעות עיניים אפשריות כאשר ה-MLF נספג. בדרך כלל אנו משתמשים בספיגה מתוזמנת של 60 שניות. לאחר מכן מוציאים את מכשיר ספיגת האף מהנחיר, מחזירים אותו לתוך צינור הקירור וניתן לאחסן אותו מיד על קרח ולאחר מכן להקפיא עמוק.
לחלופין, אתה יכול להמשיך מיד לסילוק ה-MLF. ספיגה באף נחקרת במגוון מודלים של אתגר רירית האף וגם במחלות שונות של דרכי הנשימה. עם זאת, שיטה חדשה יחסית זו עדיין דורשת תיקוף רשמי מול שיטות דגימה נשימתיות אחרות.
טכניקת ספיגת הסימפונות משתמשת במטריצה סופגת סינתטית כדי לדגום את נוזל הרירית של הסימפונות. השיטה מבוצעת על ידי צוות מיוחד באמצעות ברונכוסקופ פיבראופטי. מכשיר ספיגת הסימפונות מורכב מצנתר חלול חיצוני עם חוט מנחה פלסטיק מרכזי.
יש לזה SAM בקצה שניתן להוציא עם הפעלת הידית. בדומה לספיגה באף, רצועת ה-SAM רכה וסופגת עם פתילה מהירה לאיסוף דגימות. יש לו גם קשירת חלבון מינימלית כדי לאפשר פליטה יעילה של הפרשות נספגות.
לפני הנחת מכשיר ספיגת הסימפונות במורד הברונכוסקופ, נהוג לבדוק שה-SAM יוצא ונסוג בחזרה לתוך הצנתר בקלות. כעת נדגים את שיטת ספיגת הסימפונות באמצעות סימולטור ברונכוסקופיה. תחילה מבוצעת ברונכוסקופיה סטנדרטית, המעבירה את הברונכוסקופ במורד קנה הנשימה, לתוך הסימפונות הראשיים הימניים, ולמפלס הסימפונות הבין-מדיוס ממש קרוב לחלוקת האונות האמצעיות התחתונות והימניות.
לאחר שהוכנס לרמה זו, מתבצעים חמישה שלבים. אחד, קטטר למטה. הכנס את קטטר הסימפונות דרך תעלת ההפעלה של הברונכוסקופ עד שהקצה הלבן נראה בדרכי הנשימה עד למרחק מקסימלי של סנטימטר אחד לקצה הברונכוסקופ.
שמור את הברונכוסקופ וקצה הקטטר במרכז לומן דרכי הנשימה. הקפד למזער את המגע בין קצה הצנתר לרירית הסימפונות כדי להפחית את הסיכון לנזק לרירית הסימפונות. שתיים, SAM החוצה.
לחץ על הידית של מכשיר ספיגת הסימפונות כך שרצועת ה-SAM תחולץ לתוך הלומן של דרכי הנשימה האמצעית או הימנית התחתונה. בראייה ישירה, כופפו את קצה הברונכוסקופ כדי לוודא שה-SAM יוצר מגע עם נוזל הרירית בדופן דרכי הנשימה. השאירו את רצועת ה-SAM בתוך דרכי הנשימה, שטוחה לדופן הרירית למשך 30 שניות מתוזמנות.
שלוש, SAM בפנים. בראייה ישירה, החזר את ה-SAM ישירות לתוך הצנתר. כשאתה נסוג, ודא שבדיקת ה-SAM הלחה ישרה.
במידת הצורך, ניתן להחזיר את הקטטר ואת קצה הברונכוסקופ כדי ליישר את ה-SAM. אם יש קושי להחזיר את ה-SAM, משוך את כל המכשיר כשה-SAM מופק בחזרה מדרכי הנשימה. ארבע, קטטר למעלה.
משוך את כל הקטטר מתעלת ההפעלה של הברונכוסקופ. חמש, חתכו את ה-SAM. ה-SAM נחתך במספריים סטריליים, מכניס אותו לתוך צינורית קריוטי, ויש להניח אותו מיד על קרח לפני שהוא מקפיא עמוק או מוריד אותו ישירות.
הסרטון הבא מראה שחול של SAM לדרכי הנשימה של מטופל שעובר ברונכוסקופיה מחקרית. ספיגת סימפונות נחקרת כיום במגוון מחלות ריאה שונות. אנו מקווים ששיטה זו של דגימת רירית מדויקת תוכיח את עצמה כשימושית בעבודת אבחון וריבוד וניטור חולים.
עיבוד מעבדה לאחר ספיחת אף וספיחת סימפונות. הוצאת נוזל הרירית ממטריצת הספיגה הסינתטית. היום אנו הולכים להדגים את העקרונות הכלליים של עיבוד דגימות מעבדה לאחר טכניקות הדגימה הריריות הלא פולשניות של ספיגת אף וספיחת סימפונות.
בפרט, נדגים כיצד אנו מסירים את דגימת נוזל הרירית מהמטריצה הסיפטה הסינתטית. בנקודת האיסוף יש להניח דגימות על קרח להובלה למעבדה. ניתן לעבד דגימות באופן מיידי או להניח אותן ישירות להקפאה עמוקה בצינור הדגימה המקורי שלהן לפליטה במועד מאוחר יותר.
אם מתבצע עיבוד מיידי, ניתן להעביר את הדגימה על קרח למעבדה בשפופרת הדגימה המקורית שלה. לחלופין, ניתן לנתק את ה-SAM ולהניח אותו במאגר פליטה בנקודת האיסוף ולאחר מכן להעביר אותו על קרח למעבדה. דגימות יכולות להישאר על הקרח במאגר או בתוך צינור הדגימה שלהן במשך מספר שעות לפני העיבוד.
שלב שטיפה לפני הצנטריפוגה ופליטת הספין של ה-SAM נועד לייעל את תפוקת הדגימה. כדי להשיג זאת, ה-SAM מוחדר לתוך צינור אפנדורף יחד עם באגר המיצוי הרצוי. לאחר מכן מערבבים את הדגימה על מערבל מערבולת למשך 30 שניות כדי לשטוף את ה-SAM מנוזלים וביו-מולקולות המחוברים באופן רופף.
כדי להבטיח התאוששות מלאה של הדגימה, פליטת סחיטה מתבצעת על ידי הוספת ה-SAM הלח לתוספת ספין בתוך אותו צינור אפנדורף המשמש לשטיפה. יש להשתמש במלקחיים נקיים להליך זה ויש להחליף אותם בין דגימות כדי למנוע זיהום. שיטה זו משתמשת בצנטריפוגה כדי לחלץ את הנוזל מה-SAM.
אנו דגימות צנטריפוגות במשך 20 דקות ב -16, 000 גרם בצנטריפוגה מקוררת לארבע מעלות צלזיוס. באגר הפליטה המשמש ייקבע על ידי היישום הרצוי. בדרך כלל אנו משתמשים במאגר בדיקת אמינו המכיל חלבון או במאגר ליזה RNA.
ניתן להשתמש בשני סוגים של מסנן ספין. הראשון מכיל רק רשת פלסטיק המחזיקה את ה-SAM במקומו, ומאפשרת פליטה מלאה של נוזלים. לחלופין, אם עובדים עם חומרים זיהומיים, ניתן להשתמש במסנני ספין בגודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר.
מסננים אלה יטהרו דגימות נגועות ומתאימים לדגימות עם חשד לזיהום מיקרובקטריאלי. אם נדרשים מסננים כאלה, חשוב לכלול שלב טרום דגירה שבו מותר למאגר חלבוני להיספג דרך המסנן לפני הוספת הדגימה. שלב זה ממזער את קשירת המתווכים למסנן על ידי ספיגת חלבון לא ספציפית.
להלן שיטה לדוגמה המשמשת את המעבדה שלנו לעיבוד ספיחת אף וסימפונות של דגימות שאינן דורשות שלב טיהור כולל פתוגנים מסוג 2. שלב ראשון, ה-SAM מוכנס לתוך אפנדורף המכיל את המאגר והמערבולת המתאימים למשך 30 שניות. עבור ספיגה באף אנו משתמשים בדרך כלל ב-300 מיקרוליטר של בופר ולספיגת סימפונות ב-100 מיקרוליטר.
שלב שני, מסירים את ה-SAM באמצעות מלקחיים ומכניסים אותו לכוס מסנן רשת פלסטיק יחד עם המאגר המשמש לשטיפת ה-SAM. שלב שלישי, מסנן רשת הפלסטיק המכילה את ה-SAM מוחזרת לאפנדורף המקורי. שלב רביעי, ה-Eppendorf המכיל פילטר, מאגר ו-SAM עובר צנטריפוגה למשך 20 דקות ב-16,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הצנטריפוגה, המסנן המכילה את ה-SAM מוסרת ונפטרת. לאחר מכן ניתן להוציא את האלוט ולהקפיא אותו עמוק לניתוח במועד מאוחר יותר. דגימת אף יושמה במספר הגדרות מחקר נשימה קליניות.
זה כולל מדידות של מתווכים דלקתיים במהלך אתגר אלרגנים באף כגון פרוסטגלנדין D2 ואינטרלוקין 5. חשוב לציין שבהגדרות מודל האתגר הללו, דגימה על ידי אף מאפשרת פרופיל קינטי תכוף של רמות המתווך, כאשר ניתן לחזור על הדגימה כל כמה דקות. נסוספציה שימשה גם במהלך אתגר זיהום רינו-וירוס בנבדקים בריאים וחולי אסתמה אלרגיים, שם נסוספגה חוזרת על עצמה מדי יום במהלך תקופת המחקר.
השימוש בספיגה במחקר איפשר אפיון רגיש של תגובות אינטרפרון לזיהום רינו-וירוס. לבסוף, השתמשנו בדגימת אף כדי לחקור תינוקות עם ברונכיוליטיס. במחקר זה זיהום בנגיף סינציאלי נשימתי היה קשור לרמות גבוהות יותר של מתווכים דלקתיים, כגון אינטרפרון גמא.
חשוב לציין, דגימה עם אף מאפשרת הכללה של קבוצת ביקורת בריאה למחקרים בתינוקות. ספיגת סימפונות שימשה גם במחקר אתגר רינו-וירוס בנבדקים בריאים וחולי אסתמה אלרגיים. מחקר זה הדגים עלייה משמעותית במתווכי הדלקת אינטרפרון גמא, ITAC, IL-10 ו-IL-5 בדרכי הנשימה התחתונות במהלך זיהום רינו-וירוס.
הכללת טכניקה זו במחקרים של דרכי הנשימה התחתונות יוצרת אפשרות למדידת רמות מתווכים, שעשויות להיות בלתי ניתנות לגילוי בשיטות קונבנציונליות כגון שטיפת סימפונות. לסיכום, ניתן להשיג נוזל רירית באופן לא פולשני ויש לו פוטנציאל מרגש למדוד תגובות דלקתיות בזיהום ודלקת. יש להתאים את שיטות הפליטה בהתאם לאופי הדגימות והפרמטרים שיש למדוד.
בפרט, MLF יכול לשמש למדידת ציטוקינים וכימוקינים ברירית, זיהומים ויראליים, עומס נגיפי, זיהומים חיידקיים ופטרייתיים והמיקרוביום ונוגדנים ריריים. לבסוף, שיטות דגימה ופליטה של רירית ידרשו פיתוח מותאם ואימות קפדני לפרויקטים בודדים.
סקירה
כתב היד מתאר את טכניקות הנאסוסורפציה והברונכוסורפציה באמצעות מטריצות ספיגה סינתטיות (SAM) לדגימת נוזל הרירי מקו הרירי העליון והתחתון. שיטות אלו משפרות את הסטנדרטיזציה והסבילות בהשוואה לשיטות דגימה נשימתיות מסורתיות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- רפואת נשימה
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- נאסוסורפציה היא טכניקה לא פולשנית לדגימת נוזל הרירי מקו הרירי האף.
- ברונכוסורפציה משמשת לדגימת נוזל הרירי מקו הרירי הסימפונות באמצעות ברונכוסקופיה.
- שתי הטכניקות משתמשות במטריצות ספיגה סינתטיות לאיסוף דגימות יעיל.
- נערכות מחקרים על היישום של שיטות אלו במחלות דרכי הנשימה השונות.
מטרת המחקר
- להדגים את טכניקות הנאסוסורפציה והברונכוסורפציה.
- להעריך את יעילות ה-SAM בדגימת ריר.
- לחקור את הפוטנציאל של שיטות אלו באבחון קליני ובמחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נאסוסורפציה כרוכה בהחדרת SAM לחלל האף לספיגת נוזל הרירי.
- ברונכוסורפציה משתמשת בברונכוסקופ להצבת SAM בדרכי הנשימה הסימפוניות.
- שתי השיטות דורשות טיפול זהיר ותזמון לאיסוף דגימות מיטבי.
- הדגימות מעובדות באופן מיידי או מאוחסנות לחליטה מאוחרת יותר.
תוצאות עיקריות
- נאסוסורפציה מאפשרת דגימה עדינה ולא פולשנית המתאימה לכל הגילאים.
- ברונכוסורפציה מבוצעת על ידי צוות מומחה ויעילה באיסוף נוזל סימפוני.
- שתי השיטות מראות הבטחה לשימוש במצבי נשימה שונים.
- נדרך אימות נוסף מול שיטות קיימות.
מסקנות
- נאסוסורפציה וברונכוסורפציה הן שיטות חדשניות לדגימת ריר.
- שיטות אלו עשויות לשפר את הדיוק האבחוני ואת ניטור החולים.
- מחקר מתמשך נחוץ כדי לבסס את התועלת הקלינית שלהן.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Precision sampling of respiratory mucosal lining fluid using synthetic absorptive matrices (SAM) enables minimally invasive, reproducible collection of airway biomarkers. These techniques address the need for standardized, repeatable sampling in respiratory disease research and translational biomarker development. Their integration supports confident target validation and risk-adjusted progression in respiratory drug discovery portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of airway inflammatory mediators for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by capturing dynamic mucosal responses to challenge models.
- Facilitates inclusion of healthy controls and patient stratification in early studies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, quantitative samples suitable for downstream biomarker assays.
- Improves reproducibility and scalability of respiratory fluid collection for assay development.
- Reduces variability compared to conventional swabbing or lavage, enhancing screening reliability.
Translational & Preclinical Research
- Enables kinetic profiling of biomarkers during infection or allergen challenge in disease-relevant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by allowing frequent, minimally invasive sampling.
- Permits sensitive detection of mediators often undetectable by traditional methods.
Pipeline & Workflow Integration
Nasosorption and bronchosorption fit within the continuum from early discovery through translational research, enabling hypothesis testing and biomarker validation in both upper and lower airways.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of airway immune responses and mediator dynamics.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative samples for assay readiness and platform standardization.
- Analytics: Supports measurement of cytokines, chemokines, viral load, and microbiome composition for comparative analyses.
- Translational Research: Aligns with preclinical and clinical biomarker strategies by enabling frequent, noninvasive sampling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable sampling platform adaptable to diverse respiratory research and development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in respiratory target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mucosal sampling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust biomarker data collection.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of respiratory programs.
Implementation Considerations
- Requires trained personnel for bronchosorption and careful handling to minimize mucosal damage.
- Needs access to laboratory infrastructure for sample elution, centrifugation, and biomarker analysis.
- Demands cross-team standardization of sampling and processing protocols for reproducibility.
- Adaptable to various airway diseases and challenge models with tailored validation.
- Formal validation against existing methods is necessary for regulatory and translational adoption.
