גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של RNA, כגון מהי המשמעות הביולוגית של RdRP או TERT בתאים אנושיים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבדיקה זו מבוססת כשיטה הרגישה הראשונה לאיתור פעילות RdRP אנושית המתבטאת בתאים. התחל הליך זה בהכנת תאי HeLa כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

שוטפים את התאים פעם אחת עם 10 מיליליטר PBS. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 1,450 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט. השתמש במיליליטר אחד של Lysis Buffer A קר כקרח לכל 10 מיליון תאים כדי לליז את התאים על ידי פיפטינג עדין.

סוניקציה של הדגימה בשפופרת של 1.5 מיליליטר בהגברת סוניקטור של 25% למשך 10 שניות. לאחר סוניקציה, צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 20, 400 למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט, והעבירו מיליליטר אחד מכל אחד מהסופרנטנט לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגות של 1.5 מיליליטר.

נקה מראש את הליזאט על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של חרוזי חלבון A-אגרוז שטופים מראש לכל מיליליטר אחד של הליזאט. מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. לאחר מכן, סובב את הדגימה למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה של הדגימה בכוח הכבידה פי 13,000 למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס, ושחזר את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של חרוזי חלבון A-אגרוז שטופים מראש ו-10 מיקרוגרם של נוגדן TERT אנטי-אנושי לליזט שנוקה מראש. מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים, וסובבו את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 3, 300 למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם Wash Buffer One. הוסף מיליליטר אחד של Wash Buffer One לחרוזים, וערבב היטב על ידי היפוך הצינור.

לאחר מכן, סובב את הדגימה למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה של הדגימה בכוח הכבידה פי 3,300 למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס. הסירו את ה-supernatant וחזרו על שלב זה שלוש פעמים נוספות.

לאחר שטיפת תמיסת AGC כמתואר בפרוטוקול הטקסט, טפל בחרוזים בנוקלאז מיקרוקוקלי על ידי השעייתם מחדש ב-60 מיקרוליטר של תערובת תגובת הנוקלאז המיקרוקוקלי על ידי פיפטינג עדין. לאחר מכן, נער את הדגימה בעדינות על פטיפון של שייקר המוגדר באינקובטור מסוג פלטייר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה של הדגימה בכוח הכבידה פי 3, 300 למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס, הסר את הסופרנטנט.

לבסוף, שטפו את החרוזים פעמיים עם תמיסת AGC המכילה שלושה מילי-מולרי EGTA, ושטפו את החרוזים פעם אחת עם Wash Buffer Two כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן את תערובת התגובה של RdRP בשפופרת חדשה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף לתערובת התגובה שישה מיקרוליטר של אורידין טריפוספט המסומן על קבוצת אלפא פוספט עם P Dash 32, וערבב היטב על ידי פיפטינג.

לאחר מכן, מוסיפים לתערובת מיקרוליטר אחד של RNA תבנית, ומערבבים היטב. השעו מחדש את החרוזים עם 20 מיקרוליטר מתערובת התגובה RdRP המתקבלת. לאחר מכן, נענע את הדגימה בעדינות על פטיפון של שייקר המוגדר בחממה מסוג פלטייר למשך שעתיים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, הוסף לתערובת התגובה 5.4 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K ו-45.4 מיקרוליטר של 2X Proteinase K Buffer. מערבבים על ידי פיפטינג, ומנערים את הדגימה באינקובטור מסוג פלטייר למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הוספת 109.2 מיקרוליטר של מים נטולי RNase לדגימה, הוסף 200 מיקרוליטר של חומצה פנול-כלורופורם.

מערבבים היטב על ידי מערבולת לפני צנטריפוגה של הדגימה בכוח הכבידה פי 21, 100 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את השלב המימי לצינור חדש. חזור על שלב זה פעם אחת.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי, pH 5.2, ארבעה מיקרוליטר של נושא משקעים ו -250 מיקרוליטר אתנול לשלב הימי. לנער היטב את הצינור לערבוב. צנטריפוגה של הדגימה בכוח הכבידה פי 21, פי 100 למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, והשליכו את הסופרנטנט.

לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם 300 מיקרוליטר קר של 70% נפח לנפח אתנול המאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה של הדגימה בכוח הכבידה פי 21, פי 100 למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט וייבשו את הגלולה באוויר.

השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיקרוליטר מים ללא RNase. הכן את תערובת תגובת ה-RNase בשפופרת חדשה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף לדגימה 180 מיקרוליטר מתערובת תגובת RNase.

לאחר מכן, דגרו את הצינור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף לדגימה 2.3 מיקרוליטר של 10% נפח לכל נפח SDS, ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו לדגימה שני מיקרוליטרים של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K, ודגרו למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כעת, הוסף 205 מיקרוליטר של חומצה פנול-כלורופורם לדגימה. לאחר ערבוב וצנטריפוגה כמו קודם, העבירו את השלב המימי לצינור חדש. הוסף שלושה נתרן אצטט מולארי, נושא משקעים ואתנול לשלב הימי, ולאחר מכן ערבוב, צנטריפוגה ושטיפת הגלולה כפי שבוצע קודם לכן.

מוצגות כאן שלוש תוצאות מייצגות של בדיקת IP-RdRP בתאי HeLa שטופלו בנוקודאזול או DMSO עבור תאים לא מניפולטיביים. RNA של 34 נוקלאוטידים מסונתז כימית שימש כתבנית. לאחר חשיפה למשך הלילה, ניתן לראות תוצרי RdRP בין 20 ל-30 נוקלאוטידים, במיוחד בתאי HeLa בשלב המיטוטי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לזהות את פעילות ה-RdRP של TERT אנושי.