העכבר רקמת שומן איסוף ועיבוד לניתוח RNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבטיח איסוף דגימות הולם של מחסני רקמת שומן לבנה מעכברים שונים, ולבודד כמות גבוהה של RNA באיכות טובה מהרקמה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומי חילוף החומרים, הביוכימיה והביולוגיה המולקולרית, הנוגעות, למשל, לביטוי גנים ברקמת שומן מעכברים שטופלו או מהונדסים גנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בידוד של כמויות גבוהות של RNA באיכות טובה מרקמת שומן שבדרך כלל בעלת תכולת RNA נמוכה.

מי שתדגים את ההליך תהיה אמילי פפין, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. לאחר המתת חסד של עכבר, חותכים את העור מעל הלינאה אלבה לפי פרוטוקול הטקסט, ואז מבצעים שני חתכים של כשני סנטימטרים מאמצע כלוב הצלעות לכיוון הזרוע הימנית וקרוב לאיברי המין מעל הגפה האחורית הימנית. מתחו פינה אחת של העור הפתוח והשתמשו במחט בקוטר 22 כדי להצמיד אותה לרפידה.

לאחר מכן, הצמד את הפינה השנייה. בעזרת מספריים כירורגיים הממוקמים על העור שטוח ככל האפשר, בצע דיסקציה קהה של השומן התת עורי בבטן, או SCF, ואז העביר אותו לחתיכת נייר אלומיניום חתוכה מראש. חזור על הדיסקציה עבור הצד השמאלי של החיה.

לאחר מכן, משוך את רפידות השומן השמאלית והימנית שנאספו בנייר האלומיניום והשתמש בחנקן נוזלי כדי להקפיא את הדגימה. כדי לקבל גישה לרקמת השומן הקרביים, חתוך את שריר הבטן לאורך הלינאה אלבה. לאחר מכן, בצע חתך בשרירי הבטן מאיברי המין לכיוון החלק האחורי של העכבר משני הצדדים.

השומן סביב איברי הרבייה הוא השומן הפריגונדאלי, או PGF. נתק את רפידות השומן השמאלית והימנית מהאפידידימיס, האשכים והדוקטוס דפרנס והעביר אותו לרדיד האלומיניום המסומן מראש. לאחר מכן, הקפיאו את הדגימה בחנקן נוזלי.

החל מהצד השמאלי, חשוף את הכליות על ידי הרחקת המעיים מחלל הבטן לצד ימין. רקמת השומן הנראית כאן המקיפה את הכליה ובלוטות יותרת הכליה היא השומן הפרי-כלייתי, או PRF. בודד והסר את בלוטות יותרת הכליה לפני איסוף ה-PRF.

זה יכול להיות מייגע מכיוון שהם רק קצת יותר ורודים מרקמת השומן. כעת, בודדו את ה-PRF מדופן השרירים האחורית וחתכו את השופכן, עורק הכליה והווריד המפריד בין ה-PRF והכליה לשאר הגוף. לאחר מכן, בודד את ה-PRF מהכליה על ידי חיתוך והסרה של קפסולת הכליה.

לאחר בידוד ה-PRF הימני, העבירו את הדגימה לרדיד האלומיניום עם הרקמה מצד שמאל והשתמשו בחנקן נוזלי כדי להקפיא את הדגימות. מצננים צינורות חרוטיים נטולי RNase בנפח 1.5 מיליליטר, מרגמה ועלי ומרית בחנקן נוזלי על פי פרוטוקול הטקסט. הכניסו את דגימת רקמת השומן למכתש ואז השתמשו בכמה שכבות של נייר חום כדי להרים את העלי מהחנקן הנוזלי ולהכניס אותו למרגמה.

תוך כדי החזקת העלי עם הנייר, השתמש בפטיש כדי להכות בחלק העליון של העלי פעם או פעמיים. לאחר מכן, טוחנים את הדגימה בתנועה סיבובית עד לקבלת אבקה דקה. לאחר מכן, הסר את העלי, שלף את המרית מהחנקן הנוזלי והשתמש בה כדי להעביר את הדגימה לצינור החרוטי המתאים של 1.5 מיליליטר מקורר מראש.

טובלים את המרית בחזרה לחנקן נוזלי מדי פעם כדי למנוע מהדגימה להימס. כמו כן, שמור את הצינור החרוטי על קרח יבש כדי למנוע את הפשרת הדגימה. מלאו את הצינור החרוטי לקיבולת של כ-2/3 עם דגימת קרקע לתפוקת RNA נאותה.

לאחר מכן, הכינו את הדגימות הנותרות לפי פרוטוקול הטקסט. מתחת למכסה מנוע כימי ותוך כדי לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי בטיחות, הסר דגימת קרקע מחנקן נוזלי. פתח לאט את הצינור והוסף 500 מיקרוליטר תמיסת פנול.

סגור את מכסה הצינור והמערבולת במהירות מקסימלית למשך כחמש שניות, ואז פתח לאט ובזהירות את הצינור כדי לשחרר את הלחץ מהחנקן. יישמע צליל האוויר היוצא מהצינור. הכניסו 500 מיקרוליטר נוספים של תמיסת פנול לתוך הצינור.

לאחר מכן, מערבולת ופתח אותה לאט כמו קודם. מערבל את הדגימה עד להמסה מלאה. לאחר מכן, פתח את הצינור כדי לשחרר לחץ לפני עיבוד דגימות נוספות.

לאחר שכל הדגימות עובדו, מערבל אותן לזמן קצר במהירות המרבית ודגר אותן בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, החזירו את הצינורות לטמפרטורת החדר.

כדי למנוע זיהום, עבור כל דגימה, השתמש בפיפטה P1000 עם קצה מסונן כדי לבודד כמה שיותר RNA מהשכבה הוורודה האמצעית על ידי ניקוב שלב השומנים ליד צד הצינור. הוצא את ה-RNA לתוך הצינורות החרוטיים החדשים מבלי לגעת בצידי הצינורות כדי למנוע העברת שומנים הקיימים בחלק החיצוני של הקצה. הוסף 200 מיקרוליטר של כלורופורם טהור לכל דגימה וערבב את הצינורות בהיפוך למשך 15 שניות.

לאחר מכן, לאחר דגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 12,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות והחזירו את הצינורות לטמפרטורת החדר. עבור כל דגימה, השתמש בפיפטה P1000 ובקצות מסוננים כדי להעביר כמה שיותר שלב עליון מימי שקוף המכיל RNA לסט השני של צינורות חרוטיים מתאימים. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של 100% איזופרופנול לכל דגימה וערבב את הצינורות בהיפוך למשך 15 שניות.

לאחר מכן, דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה של הצינורות בטמפרטורה של 12,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני החזרת הצינורות לטמפרטורת החדר. השלך את האיזופרופנול על ידי שפיכתו מכל צינור.

כעת, הוסף מיליליטר אחד של אתנול 75% לכל דגימה ומערבב לזמן קצר את הצינורות במהירות המרבית. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 7, 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר סיבוב הדגימות והבאתם לטמפרטורת החדר, השליכו את האתנול 75% על ידי היפוך כל צינור והדלקת הקשה על נייר חום כדי להסיר שאריות אתנול.

השאירו את המכסה פתוח וייבשו את כדור ה-RNA באוויר למשך כ-15 עד 20 דקות. לאחר הערכת גודל כדורי ה-RNA, הוסף 10 עד 25 מיקרוליטר של מים נטולי RNase לכל דגימה. דגרו את הדגימות בבלוק חום בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר מכן, מערבול לזמן קצר את הצינורות. דגרו את הדגימות באותו גוש חום למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, סובב במהירות את כל הדגימות והניח אותן מיד על קרח.

לבצע RT-PCR לביטוי גנים ברקמת שומן על פי פרוטוקול הטקסט. כצפוי, עכברים בדיאטה עתירת שומן הגדילו את משקל הגוף ואת העלייה במשקל בהשוואה לחברים להמלטה בדיאטה הרגילה. תצפיות אלו לוו בעלייה של יותר מפי שניים במשקל ה-PGF, PRF ו-SCF בעכברים שמנים בהשוואה לאלו בתזונה רגילה.

טבלה זו מראה כי עבור כל רקמת שומן לבנה, בידוד RNA על ידי תמיסת פנול ייצר דגימות עם OD260 על OD280 של כ-2.0 הנחשב טהור עבור RNA. כפי שניתן לראות בגרף עמודות זה, נתוני PCR בזמן אמת הראו כי ביטוי mRNA לפטין היה גבוה משמעותית ב-PGF, PRF ו-SCF של עכברים שמנים בהשוואה לאלה בדיאטה רגילה. ההבדלים שנצפו בביטוי mRNA לפטין לא נבעו משונות של s16, גן הייחוס המשמש לנרמול התוצאות בין שתי קבוצות העכברים מכיוון שערכי ה-CT לא השתנו.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בסביבה נטולת RNase במהלך הליך מיצוי ה-RNA. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הגברת PCR בזמן אמת על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שינויים בביטוי גנים.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חילוף החומרים לחקור מודולציות של רקמות שומן הקשורות להשמנת יתר וסוכרת במכרסמים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד רפידות שומן שונות ולבודד מהן RNA. אל תשכח שעבודה עם תמיסת הפנול עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מעיל מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.