Name: העכבר רקמת שומן איסוף ועיבוד לניתוח RNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: למד איסוף רקמת שומן לבנה מעכברים וחילוץ RNA באיכות גבוהה לחקר ביטוי גנים. שיטה זו מאפשרת מחקר מטבוליזם וביולוגיה מולקולרית בחיות מודיפיקציה גנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי סוכרת קנדה.

<ol><li>Guh, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incidence+of+co-morbidities+related+to+obesity+and+overweight%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis.</a> BMC. Public Health. 9, 88(2009).</li>
<li>Wronska, A., Kmiec, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characteristics+of+various+white+adipose+tissue+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots.</a> Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).</li>
<li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).</li>
<li>Ibrahim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue%3A+structural+and+functional+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Rev%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences.</a> Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+identification%2C+and+excision+of+murine+adipose+depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, identification, and excision of murine adipose depots.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/246759856_RNA_Isolation_from_Adipose_Tissue_An_Optimized_Procedure_for_High_RNA_Yield_and_Integrity">RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity.</a> Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).</li>
<li>Cirera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+method+for+isolation+of+total+RNA+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue.</a> BMC Res Notes. 6, 472(2013).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+protein+extraction%3A+the+past+and+the+present%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present.</a> J Biomed Biotechnol. 2009, 574398(2009).</li>
<li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnol. 14, 94(2014).</li>
<li>Tan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+prorenin%2Frenin+receptor+on+the+development+of+obesity+and+associated+cardiometabolic+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+%28Silver.+Spring%29%22%5BJournal%5D)">Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors.</a> Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), 1-5 (2010).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+a+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+increases+in+circulating+prorenin+are+not+associated+with+renal+or+cardiac+pathologies%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies.</a> Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).</li>
<li>Dusaulcy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-specific+disruption+of+autotaxin+enhances+nutritional+fattening+and+reduces+plasma+lysophosphatidic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid.</a> J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).</li>
<li>Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines%3A+a+link+between+obesity+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease.</a> J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+RT-quantitative+PCR%3A+firsthand+observations+of+implementation+of+minimum+information+for+the+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments+%28MIQE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE).</a> J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).</li>
<li>Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+solubilization+of+proteins+after+TRIzol+extraction+of+RNA+and+DNA+from+patient+material+following+prolonged+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage.</a> Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הבאים HF-דיאטה האכלה, העכברים המשמינים נמצאו הגדילו הגוף ועובי שומן לבן לעומת עכברים שקיבלו תזונה N. RNA חילוץ באמצעות פנול פתרון הניב דגימות עם טוהר טוב. לפטין adipokine המיוצר בעיקר על ידי רקמת שומן, ידוע כדי להתאים באופן חיובי עם מסת שומן16. כצפוי, לפטין mRNA הביטוי עלה בעכברים שמנים ב concomitance עם מסת שומן.
בשיטה זו יש מספר שלבים קריטיים. האחד העיקריים הוא זיהום של דיפו שומן לבן אחד עם השני, כפי שהיא מכונה רקמת שומן שונה מחסני שיש פונקציות שונות...

השמנה היא מגפה עולמית אשר יכול להוביל לסיבוכים כגון סוג 2 סוכרת1. דיאטה-induced מהשמנת יתר, מהונדסים מודלים בעלי חיים משמשים לעתים קרובות למחקר, השמנת יתר, סיבוכים הקשורים. באופן מסורתי, שומן לבן המכונה בה תא אחסון אנרגיה עודפת, מורכב בעיקר שומנים בזמן רקמת שומן חום ממירה אנרגיה חום2,3. רקמת שומן הוא דינמי, להתרחב ולהתכווץ בהתאם לגורמים רבים כגון צריכת המזון ופעילות גופנית. לפיכך, כדי לקבוע את הגורמים התורמים לשינויים אלה, רקמת שומן מספקת אוסף וטיפול הם נדרשים4.
בין רקמות adipose לבן, זה מקובל כי המחסנים שומן תת עורית של הקרביים שיש לה מאפיינים שונים כגון לוקליזציה אנטומיים, לתפקד2,5. כתוצאה מכך, כדי למנוע תוצאות סותרות או השתנות גדולה, תשומת הלב צריך לקחת כדי למנוע זיהום צולב בין אלה המחסנים שומן שונה בעת איסוף שמן רפידות.
יתר על כן, ישנם שלושה אתגרים מרכזיים כאשר בידוד RNA או החלבון של רקמת שומן עכברים לבנים. ראשית, איסוף רפידות שומן בעכברים שמנים אינה משימה קלה כפי הגבול המפריד בין המחסנים שומן לבן שונה אינה חד משמעית, בניגוד לאיברים אחרים כגון הכליות, הלב6. שנית, בגלל התוכן שומנים גבוהה בדם של רקמת שומן, במהלך בידוד RNA או החלבון, שכבה של ליפידים צף למעלה, מונע גישה ישירה המדגם. שלישית, בניגוד רקמת שומן חום או רקמות אחרות, שומן לבן תוכן RNA וחלבונים נמוך משמעותית, זו הדאגה העיקרית בעת שימוש עכברים צעירים, עכברים האכיל דיאטה רגילה (N) ויש עכברים אשר צפויים ההמונים שומן נמוכה (קרי KO מודלים, טיפול עם תרופות, תרגיל אימונים, וכו '.) 7 , 8.
לכן, בחירת השיטה המתאימה כדי לבודד את הרנ א של רקמת שומן חיוני. שיטות אלטרנטיביות למניעת פנול/כלורופורם החילוץ הם ערכות מסחריות. הם מבוססים בדרך כלל על צעד החילוץ הראשוני פנול, ואחריו RNA טיהור על עמודה9. עם זאת, ערכות אלה בדרך כלל יקרים יותר, לתת דוגמאות תשואה נמוכה יותר, תוך איכות RNA יכול להיות משתנה אבל פחות זמן רב. עם זאת, אחד היתרונות הגדולים של פנול פתרון/כלורופורם החילוץ המתוארים כאן היא האפשרות של בידוד RNA DNA, חלבונים מן מדגם יחיד10. כיוון רפידות השמן עכברים קטנים בדרך כלל לתת כמות קטנה של RNA וחלבונים (במיוחד במודלים העכבר רזה), פרוטוקולים אלה למקסם את הנתונים אחד יכול לצאת מדגם קטן.
מטרת המאמר היא לתאר בפירוט שיטה כדי להבטיח מדגם נאותה מהאוסף מחסני רקמת שומן לבן שלושה עכברים וכן בכמות ובאיכות של RNA בידוד. RNA מושגת על ידי ביצוע פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מבחני ה-PCR בזמן אמת. פרוטוקול זה אינו מיועד לבידוד RNA מ adipocytes הראשית בתרבית.

<table><tbody><tr><td>סרינגים של 1 מ"ל תמיסת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE 1X (10 מ"מ Tris-HCl ו-1 מ"מ EDTA&bull; Na2. pH 8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 גרם מחטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 גרם מחטים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בלוק מחמם (אמבטיה יבשה)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>סיגמא</td><td>C2432-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>תרמו מדעי</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp; &nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 U/&micro; l)&nbsp;</td><td>תרמו-מדעי</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart אוניברסלי SYBR ירוק מאסטר (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart צבע פלואורסצנטי אוניברסלי SYBR ירוק מאסטר (Rox)&nbsp;</td><td>רוש</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>טיפים</td><td></td><td></td><td></td>מסוננים</tr><tr><td>מלקחיים&nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיאטת מכרסמים עשירה בשומן</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>פריימר PCR קדימה לפטין (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') פריימר PCR הפוך לפטין 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td><td></td>נוזלי</tr><tr><td>מקסימה טרנסקריפטאז הפוך (אנזים ומאגר 5x)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>מים ננו-טהורים (המכונים מים אולטרה-טהורים)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>כפפות</td><td></td><td></td><td></td>בדיקת</tr><tr><td>ניטריל כפפות</td><td></td><td></td><td></td>ניטריל</tr><tr><td>דיאטת מכרסמים רגילה</td><td>מעבדות הרלן, מדיסון, ויסקונסין</td><td>הרלן 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 פיפטמן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 פיפטמן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 פיפטמן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 פיפטמן</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פנול (TRIzol)&nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>רדיד</td><td></td><td></td><td></td>אלומיניום מזוהה מראש</tr><tr><td>ספקטרופוטומטר קוורץ קובטה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתלה לרצועות</td><td></td><td></td><td></td>צינור PCR</tr><tr><td>מתלים לרצועות</td><td></td><td></td><td></td>צינור RT-PCR</tr><tr><td>הקסמרים אקראיים&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>מערכת גנים של רוטור PCR בזמן אמת&nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td>מקוררת</tr><tr><td>RiboLock מעכב RNase&nbsp;</td><td>תרמו מדעי</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr>צינורות <td></td><td></td><td></td><td>אפנדורף 1.5 מ"ל ללא RNase</td></tr> צינורות <tr><td>מכסה</td><td></td><td></td><td></td>בורג 1.5 מ"ל ללא RNase</tr><tr><td>רצועות צינור PCR ללא RNase (0.2 מ"ל) וכובעים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ללא מים RNase&nbsp;</td><td>מכונת Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>רצועות צינור RT-PCR (0.1 מ"ל) וכובעים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 קדימה פריימר PCR (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 פריימר PCR הפוך (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>מרגמה ועלי</td><td></td><td></td><td></td>נירוסטה</tr><tr><td>רפידות כירורגיות</td><td>תוצרת בית לוח קצף עטוף במשטח</td><td></td><td></td>סופג חד פעמי</tr><tr><td>מספריים כירורגיים&nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>מחזור תרמי Thermal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cycler&nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת מערבל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרית</td><td></td><td></td><td></td> שקילה</tr></tbody></table>

העכבר רקמת שומן איסוף ועיבוד לניתוח rna

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

בהשוואה לרקמות אחרות, שומן לבן יש הרבה פחות RNA וחלבון תוכן עבור יישומים במורד הזרם כגון PCR בזמן אמת המערבי כתם, שכן הוא בעיקר מכיל שומנים. בידוד RNA מדגימות רקמת שומן הוא מאתגר גם צעדים נוספים נדרשים להימנע שומנים אלה. כאן, אנו מציגים את הליך איסוף שלוש רקמות adipose שונה מבחינה אנטומית לבן עכברים, לעבד את דגימות אלה ולבצע בידוד ה-RNA. בהמשך נתאר את הסינתזה של ניסויים ביטוי cDNA וג'ין באמצעות PCR בזמן אמת. הפרוטוקול המתואר בזאת מאפשר הפחתת זיהום מן הדם על רפידות השמן, כמו גם זיהום צולב בין פדים שמנים שונים במהלך איסוף רקמת והשיער של החיה. זה גם מוטבה כדי להבטיח ובאיכות של RNA חילוץ. פרוטוקול זה ניתן להחיל באופן נרחב על כל דגם העכבר בו דוגמאות רקמת שומן נדרשים לניסויים שגרתיות כגון PCR בזמן אמת, אך אינו מיועד לבידוד מתרבות תא adipocytes הראשי.

בעקבות ההליך necropsy, שלוש רקמות adipose לבן היו נאספים, משוקלל של שתי הקבוצות של עכברים (N ו- HF דיאטה-fed עכברים). כצפוי, עכברים על הדיאטה HF עלה במשקל הגוף הסופי ועודף משקל בהשוואה הארנבונים מאותה בדיאטה N (טבלה 1). תצפיות אלה היו מלוות יותר מאשר עלייה 2-fold במשקל של PGF, PRF, SCF בעכברים שמנים בהשוואה לאלו בדיאטה N.
לפני ביצוע ניסוי מדעי עם הרנ א מבודד, הטוהר שלו הוערך כפי שמתואר בשלב 4.9. עבור כל שומן לבן...

מטרת מאמר זה היא להציג הליך שלב אחר שלב כדי לאסוף רקמות adipose לבן שונים של עכברים, לעבד את דגימות השמן ולחלץ את ה-RNA.

העכבר רקמת שומן איסוף ועיבוד לניתוח RNA

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להבטיח איסוף דגימות הולם של מחסני רקמת שומן לבנה מעכברים שונים, ולבודד כמות גבוהה של RNA באיכות טובה מהרקמה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומי חילוף החומרים, הביוכימיה והביולוגיה המולקולרית, הנוגעות, למשל, לביטוי גנים ברקמת שומן מעכברים שטופלו או מהונדסים גנטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת בידוד של כמויות גבוהות של RNA באיכות טובה מרקמת שומן שבדרך כלל בעלת תכולת RNA נמוכה.מי שתדגים את ההליך תהיה אמילי פפין, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. לאחר המתת חסד של עכבר, חותכים את העור מעל הלינאה אלבה לפי פרוטוקול הטקסט, ואז מבצעים שני חתכים של כשני סנטימטרים מאמצע כלוב הצלעות לכיוון הזרוע הימנית וקרוב לאיברי המין מעל הגפה האחורית הימנית. מתחו פינה אחת של העור הפתוח והשתמשו במחט בקוטר 22 כדי להצמיד אותה לרפידה.לאחר מכן, הצמד את הפינה השנייה. בעזרת מספריים כירורגיים הממוקמים על העור שטוח ככל האפשר, בצע דיסקציה קהה של השומן התת עורי בבטן, או SCF, ואז העביר אותו לחתיכת נייר אלומיניום חתוכה מראש. חזור על הדיסקציה עבור הצד השמאלי של החיה.לאחר מכן, משוך את רפידות השומן השמאלית והימנית שנאספו בנייר האלומיניום והשתמש בחנקן נוזלי כדי להקפיא את הדגימה. כדי לקבל גישה לרקמת השומן הקרביים, חתוך את שריר הבטן לאורך הלינאה אלבה. לאחר מכן, בצע חתך בשרירי הבטן מאיברי המין לכיוון החלק האחורי של העכבר משני הצדדים.השומן סביב איברי הרבייה הוא השומן הפריגונדאלי, או PGF. נתק את רפידות השומן השמאלית והימנית מהאפידידימיס, האשכים והדוקטוס דפרנס והעביר אותו לרדיד האלומיניום המסומן מראש. לאחר מכן, הקפיאו את הדגימה בחנקן נוזלי.החל מהצד השמאלי, חשוף את הכליות על ידי הרחקת המעיים מחלל הבטן לצד ימין. רקמת השומן הנראית כאן המקיפה את הכליה ובלוטות יותרת הכליה היא השומן הפרי-כלייתי, או PRF. בודד והסר את בלוטות יותרת הכליה לפני איסוף ה-PRF.זה יכול להיות מייגע מכיוון שהם רק קצת יותר ורודים מרקמת השומן. כעת, בודדו את ה-PRF מדופן השרירים האחורית וחתכו את השופכן, עורק הכליה והווריד המפריד בין ה-PRF והכליה לשאר הגוף. לאחר מכן, בודד את ה-PRF מהכליה על ידי חיתוך והסרה של קפסולת הכליה.לאחר בידוד ה-PRF הימני, העבירו את הדגימה לרדיד האלומיניום עם הרקמה מצד שמאל והשתמשו בחנקן נוזלי כדי להקפיא את הדגימות. מצננים צינורות חרוטיים נטולי RNase בנפח 1.5 מיליליטר, מרגמה ועלי ומרית בחנקן נוזלי על פי פרוטוקול הטקסט. הכניסו את דגימת רקמת השומן למכתש ואז השתמשו בכמה שכבות של נייר חום כדי להרים את העלי מהחנקן הנוזלי ולהכניס אותו למרגמה.תוך כדי החזקת העלי עם הנייר, השתמש בפטיש כדי להכות בחלק העליון של העלי פעם או פעמיים. לאחר מכן, טוחנים את הדגימה בתנועה סיבובית עד לקבלת אבקה דקה. לאחר מכן, הסר את העלי, שלף את המרית מהחנקן הנוזלי והשתמש בה כדי להעביר את הדגימה לצינור החרוטי המתאים של 1.5 מיליליטר מקורר מראש.טובלים את המרית בחזרה לחנקן נוזלי מדי פעם כדי למנוע מהדגימה להימס. כמו כן, שמור את הצינור החרוטי על קרח יבש כדי למנוע את הפשרת הדגימה. מלאו את הצינור החרוטי לקיבולת של כ-2/3 עם דגימת קרקע לתפוקת RNA נאותה.לאחר מכן, הכינו את הדגימות הנותרות לפי פרוטוקול הטקסט. מתחת למכסה מנוע כימי ותוך כדי לבישת חלוק מעבדה, כפפות ומשקפי בטיחות, הסר דגימת קרקע מחנקן נוזלי. פתח לאט את הצינור והוסף 500 מיקרוליטר תמיסת פנול.סגור את מכסה הצינור והמערבולת במהירות מקסימלית למשך כחמש שניות, ואז פתח לאט ובזהירות את הצינור כדי לשחרר את הלחץ מהחנקן. יישמע צליל האוויר היוצא מהצינור. הכניסו 500 מיקרוליטר נוספים של תמיסת פנול לתוך הצינור.לאחר מכן, מערבולת ופתח אותה לאט כמו קודם. מערבל את הדגימה עד להמסה מלאה. לאחר מכן, פתח את הצינור כדי לשחרר לחץ לפני עיבוד דגימות נוספות.לאחר שכל הדגימות עובדו, מערבל אותן לזמן קצר במהירות המרבית ודגר אותן בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 12, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, החזירו את הצינורות לטמפרטורת החדר.כדי למנוע זיהום, עבור כל דגימה, השתמש בפיפטה P1000 עם קצה מסונן כדי לבודד כמה שיותר RNA מהשכבה הוורודה האמצעית על ידי ניקוב שלב השומנים ליד צד הצינור. הוצא את ה-RNA לתוך הצינורות החרוטיים החדשים מבלי לגעת בצידי הצינורות כדי למנוע העברת שומנים הקיימים בחלק החיצוני של הקצה. הוסף 200 מיקרוליטר של כלורופורם טהור לכל דגימה וערבב את הצינורות בהיפוך למשך 15 שניות.לאחר מכן, לאחר דגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 12,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות והחזירו את הצינורות לטמפרטורת החדר. עבור כל דגימה, השתמש בפיפטה P1000 ובקצות מסוננים כדי להעביר כמה שיותר שלב עליון מימי שקוף המכיל RNA לסט השני של צינורות חרוטיים מתאימים. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של 100% איזופרופנול לכל דגימה וערבב את הצינורות בהיפוך למשך 15 שניות.לאחר מכן, דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה של הצינורות בטמפרטורה של 12,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני החזרת הצינורות לטמפרטורת החדר. השלך את האיזופרופנול על ידי שפיכתו מכל צינור.כעת, הוסף מיליליטר אחד של אתנול 75% לכל דגימה ומערבב לזמן קצר את הצינורות במהירות המרבית. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 7, 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר סיבוב הדגימות והבאתם לטמפרטורת החדר, השליכו את האתנול 75% על ידי היפוך כל צינור והדלקת הקשה על נייר חום כדי להסיר שאריות אתנול.השאירו את המכסה פתוח וייבשו את כדור ה-RNA באוויר למשך כ-15 עד 20 דקות. לאחר הערכת גודל כדורי ה-RNA, הוסף 10 עד 25 מיקרוליטר של מים נטולי RNase לכל דגימה. דגרו את הדגימות בבלוק חום בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר מכן, מערבול לזמן קצר את הצינורות. דגרו את הדגימות באותו גוש חום למשך חמש דקות נוספות. לאחר מכן, סובב במהירות את כל הדגימות והניח אותן מיד על קרח.לבצע RT-PCR לביטוי גנים ברקמת שומן על פי פרוטוקול הטקסט. כצפוי, עכברים בדיאטה עתירת שומן הגדילו את משקל הגוף ואת העלייה במשקל בהשוואה לחברים להמלטה בדיאטה הרגילה. תצפיות אלו לוו בעלייה של יותר מפי שניים במשקל ה-PGF, PRF ו-SCF בעכברים שמנים בהשוואה לאלו בתזונה רגילה.טבלה זו מראה כי עבור כל רקמת שומן לבנה, בידוד RNA על ידי תמיסת פנול ייצר דגימות עם OD260 על OD280 של כ-2.0 הנחשב טהור עבור RNA. כפי שניתן לראות בגרף עמודות זה, נתוני PCR בזמן אמת הראו כי ביטוי mRNA לפטין היה גבוה משמעותית ב-PGF, PRF ו-SCF של עכברים שמנים בהשוואה לאלה בדיאטה רגילה. ההבדלים שנצפו בביטוי mRNA לפטין לא נבעו משונות של s16, גן הייחוס המשמש לנרמול התוצאות בין שתי קבוצות העכברים מכיוון שערכי ה-CT לא השתנו.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בסביבה נטולת RNase במהלך הליך מיצוי ה-RNA. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הגברת PCR בזמן אמת על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שינויים בביטוי גנים.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חילוף החומרים לחקור מודולציות של רקמות שומן הקשורות להשמנת יתר וסוכרת במכרסמים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד רפידות שומן שונות ולבודד מהן RNA. אל תשכח שעבודה עם תמיסת הפנול עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת מעיל מעבדה וכפפות בעת ביצוע הליך זה.

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מדווחים על הליך לבידוד RNA עם שלמות גבוהה מלבלב העכבר העשיר בריבונוקלאז.

בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור microdissection לכידה לייזר לשחזור (LCM) לבידוד meshwork trabecular (TM) לניתוח RNA במורד הזרם. היכולת לנתח שינויים בביטוי הגנים ב ה-TM יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מחלות עינית הקשורות TM.

לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

שיטה מתישה קריוגניים כדי לעבד כפות מורתיות באמצעות טחנת חנקן נוזלי המקפיא פותחה כדי לשפר את התשואה והאיכות של RNA או חלבון שחולצו מן הרקמות ולאפשר ניתוח של פרופילים מולקולריים הקשורים דלקתיות תגובות.

פרוטוקול הקפאה-מתישה לעיבוד כפות העכבר כדי להעריך מסלולים מולקולריים של דלקת רקמות במודל דלקת מפרקים קולגן המושרה

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

פרוטוקול זה מספק שיטת עיכול יעילה של collagenase לבידוד של אדיפוציטים בני קיימא ותאי SVF של מקטע כלי דם סטרומה משומן בטני אנושי בתהליך יחיד, כולל מתודולוגיה להשגת RNA באיכות גבוהה מאדיפוציטים ופנוטיפפיקציה של SVF-מקרופאגים באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לממברנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

כאן, אנו מספקים הליך מעשי לניתוח וביצוע ניתוחים היסטולוגיים וביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית.

דיסקציה, עיבוד היסטולוגי וניתוח ביטוי גנים של רקמת שומן חומה סופרקלאביקולרית מורין

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.

מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

למד איסוף רקמת שומן לבנה מעכברים וחילוץ RNA באיכות גבוהה לחקר ביטוי גנים. שיטה זו מאפשרת מחקר מטבוליזם וביולוגיה מולקולרית בחיות מודיפיקציה גנטית.

העכבר רקמת שומן איסוף ועיבוד לניתוח RNA

גלה סרטונים נוספים