הדמיה תלת מימדית של רקמה נושאת גידול באמצעות הלבנה איטרטיבית מרחיבה את גישת המולטיפלקסיות

מחקר זה מתמקד בזיהוי מטרות לתרופות אימונומודולטוריות וגידולים מוצקים מורכבים במערכת העיכול. ניתוח הנוף התאי של מיקרו-סביבת הגידול הוא חיוני לחלוטין להבנת הרגישות לטיפולים כמו אימונותרפיה. ריצוף תאים בודדים וזרימה ציטומטרית עוזרים לאפיין את המיקרו-סביבה של הגידול, אך חסרים הקשר מרחבי. לאחרונה צצו פלטפורמות הדמיה ותעתיק מולטיפלקס כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול בהקשר ה-in-vivo שלה.

טכנולוגיות מולטיפלקס זמינות לניתוח מיקרו-סביבת הגידול, בין אם איטרטיבית או הכל באחד, מוגבלות לשני ממדים. פרוטוקול זה מרחיב את האפיון לממד העומק, ומספק תובנות מעבר ל-FFPE בודד או מקטעים קפואים.

[קריין] כדי להתחיל, העבירו את יריעות הטישו לכוס דגימה המכילה מדיום קציר חם והניחו אותה על צלחת חימום בשולחן ההכנה. הרכיבו את הרקמה על פלטפורמות בצלחת של 15 ס"מ המכילה מדיום קציר. עטפו בזהירות את הרקמה הנושאת את הגידול כשהצד המזותלי פונה כלפי מעלה מעל צד הפתח הקטן של הפלטפורמה ואבטחו אותה עם תפר משי 2-0. הנח את פלטפורמת הרקמות המוכנה שקועה במלואה בצלחת של 24 בארות המכילה מדיום קציר. לקיבוע, הוסף 10 מיליליטר של מלאי קיבוע לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר PBS קר להכנת 40 מיליליטר של מאגר קיבוע. בעזרת מלקחיים, העבירו את הרקמה המותקנת על פלטפורמות למאגר הקיבוע. ולדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לשפוך את הקיבוע. החלף אותו ב -40 מיליליטר PBS קר. ודוגרים במשך 10 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. לצביעה, הוסף 1 מיליליטר של מאגר חוסם לבאר והכנס את פלטפורמת הרקמות. חסום לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר על נדנדה המוגדרת למהירות נמוכה של 30 סל"ד. הכן 0.8 מיליליטר תמיסת צבע נוגדנים בצינור מיקרוצנטריפוגה וצנטריפוגה ב -10,000 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. העבירו 0.75 מיליליטר של הסופרנטנט לבאר נקייה של צלחת דגירה בת 9 בארות. והכנס פלטפורמה שטופה. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום. ולדגור לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר על נדנדה המוגדרת למהירות נמוכה של 30 סל"ד. שטפו את הפלטפורמה בצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 40 מיליליטר PBS למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הוסף 0.1 מיליליטר PBS למרכז תחתית הזכוכית של צלחת הדמיה של 3.5 סנטימטר, והנח אותה בצד. הברג את טבעת כוונון הגובה באופן רופף בכיוון השעון לתוך המכסה החיצוני. והתקן את הפלטפורמה במחזיק הפלסטיק הפנימי, תוך הבטחת יישור חריץ החריץ. אבטח את הפלטפורמה באמצעות המחוון. הנח את מתאם ההדמיה המורכב על צלחת הזכוכית התחתונה והורד בזהירות את טבעת כוונון הגובה עד שהרקמה נוגעת במאגר. לאחר שמגיעים למרחק האופטימלי מהזכוכית, הוסף 0.2 מיליליטר PBS על הרקמה כשהצד התחתון כלפי מעלה כדי למנוע התייבשות רקמות במהלך ההדמיה. הפעל את התוכנה לרכישת תמונות. בחר את המטרה המתאימה, כגון 20X או 40X, והוסף את מדיום הטבילה המתאים. בחר את הפרמטרים לרכישת תמונה, כגון מהירות סריקה של 600 הרץ, רזולוציית XY של 1024 על 1024 פיקסלים, ממוצעים של שלוש שורות וסריקה דו-כיוונית. בחר את קווי הלייזר המתאימים או התאם את לייזר האור הלבן כך שיתאים לספקטרום העירור והפליטה של הפלואורופורים המשמשים לצביעה. הנח את צלחת ההדמיה המורכבת לתוך מחזיק הדגימה על המיקרוסקופ stage. מרכז את הדגימה באמצעות פקד XY, העלה את המטרה לזכוכית הכיסוי והתחל ברכישת תמונה. לאחר כל סבב הדמיה, בצע שלב הלבנה. הכינו 5 מיליליטר של 1.5 מיליגרם לתמיסת ליתיום בורוהידריד מיליליטר במים מזוקקים, ודגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו 1 מיליליטר מתמיסת הליתיום בורוהידריד לבאר נקייה של צלחת הדגירה בת 9 הבארות והכניסו את הפלטפורמה השטופה למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו בקצרה את הפלטפורמה ב -20 מיליליטר PBS בתוך צינור חרוטי. בדוק את האות הפלואורסצנטי שנותר באמצעות הגדרת הלייזר הגבוהה ביותר עבור פיצוי Z. דגימת צפקית נושאת גידול המוכתמת בסיבוב הראשון של הלבנה איטרטיבית מרחיבה את המולטיפלקסיות, או IBEX 1, פאנל להדמיה מוצג כאן. נגעי גידול זוהו כמבנים דמויי שושנה שהיו חיוביים כפולים ל-CD44 ופודופלנין עם סידורים גרעיניים האופייניים למזותליומה פפילרית. תמונות אימונופלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה של אזורים נבחרים מדגימת הצפק הנושאת את הגידול מוצגות כאן. תמונות אלה חושפות אזורי גידול וממשקי מבנה לימפה שלישוני של הגידול, ומדגישות חדירת תאים חיסוניים עקבית עם צפיפות גבוהה של תאים חיוביים ל-CD45. איור זה מציג את הצביעה האימונופלואורסצנטית האיטרטיבית על פני מחזורי IBEX 1 עד 6, וממחיש את ההתפלגות המרחבית של סמנים חיסוניים ומבניים בתוך נגע הגידול וממשק מבנה הלימפה השלישוני של הגידול. ההקרנות המקסימליות של קטעים אופטיים שונים מוצגות כאן. הדמיה תלת מימדית זו אישרה כי נגעי גידול ומבנים לימפואידים שלישוניים שוכנים בעומקי Z שונים, מה שמדגים את המגבלות של הדמיה דו-ממדית בלכידת ארכיטקטורת רקמות מורכבת.