Name: זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: למד לזהות אינטראקציות רגישות לדטרגנט בין חלבוני ממברנה באמצעות שיטת תיוג היסטידין ומייק. פרוטוקול זה מאפשר חקר אינטראקציות חלבוניות חלשות בין sortilin ל-GLUT4 בקלות ובמהירות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר DK52057 ו- DK107498 של NIH על K.V.K. X.P נתמכה על ידי 2T32DK007201 גרנט הדרכה מוסדית של NIH.

1. הטיפול פפטיד
<ol><li>עיצוב וסידור של פפטיד<ol>
<li>לבחור את רצף פפטיד הרצוי, וכן להוסיף תג, כגון myc epitope (EQKLISEED) בבית שלה או או C-אמיני.</li>
		<li>בדוק המסיסות החזוי פפטיד במים, באמצעות פפטיד מסיסות מחשבון http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. אם המסיסות נמוכה, נסה להוסיף תג אחר מסיסים במים כדי לשנות את האיזון תשלום. הערה: השתמשנו על פפטיד המתאים לתמונה luminal הראשון (fll) של GLUT4 המתויגת את epitope myc (גופן מודגש) התחנה הסופית N (Myc-fll-GLUT4): LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA EQKLISEEDשיש לו "טוב" החזוי מסיסות במים .</li>
		<li>להזמין את פפטיד מותאם אישית לפחות 75% טוהר אשר היא מספקת וזמינותו, לבקש את הספק מסיסות הבדיקה. הפרד את הסדר לתוך aliquots לפחות שני במקרה של בעיות בלתי צפויות עם המסת את פפטיד. הערה: Myc-fll-GLUT4 פקדו ב- aliquots שני. מסיסות שדווחה שלה במים הנדסה גנטית היא ≤10 מ"ג/מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המסת את פפטיד הערה: הנדסה גנטית מים הוא הממס הטוב ביותר. אם פפטיד אינו מופיע להיות מסיסים במים, עיין http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html לקבלת הוראות.<ol>
<li>הכן 100 x הפתרון עובד של פפטיד במים הנדסה גנטית או במאגר של בחירה, עם ריכוז μg/מ.</li>
		<li>להפריד את הפתרון לתוך 50-100 µL aliquots ואחסן אותם ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. טיפול של תאים
<ol><li>תרבית תאים<ol>
<li>השתמש פראי סוג (WT) תאים פקד שלילי, וכן תאים המבטאים את חלבון המטרה מתויג עם 6 histidines (HisP). הערה: השתמשנו 3T3 L1 טרום adipocytes stably transfected עם Sortilin-myc/שלו5.</li>
		<li>לגדל את התאים של Dulbecco בינוני נשר שונה (DMEM) גבוה סוכר, בתוספת 10% עגל שור סרום, פניצילין/סטרפטומיצין (5 μg/mL) ב 37 ° C ב- 10% CO2וגם גלוטמין (2 מ מ).</li>
		<li>שב ארבע המנות 10 ס מ של תאים, transfect שניים מהם עם HisP, transfect השניים האחרים עם שליטה פלסמיד (WT). 48 שעות לאחר תרביות תאים, התאים צריכים להגיע confluency 80-90%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת Lysates תא<ol>
<li>הכנת מאגר פירוק (10 מ מ Hepes, 30 מ מ NaCl, גליצרול 5%, 10 מ מ Imidazole, 0.5% טריטון X-100, פרוטאז מעכב קוקטייל ללא EDTA עבור הבידוד שלו מתויג חלבונים, pH 7.4) ולשמור אותו ב-4 ° c:</li>
		<li>לשטוף תאים שלוש פעמים עם 10 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 º C.</li>
		<li>תניחו את הכלים על קרח ולהוסיף 500 µL מאגר פירוק כל מנה. לקצור את lysates תא באמצעות המגרד של התא.</li>
		<li>מקם את התא lysate של כל מנה לתוך צינור שונה mL 1.5. תווית הצינורות כמו HisP-pH8 HisP-pH6, WT-pH8, WT-pH6.</li>
		<li>עוברים את lysates תא מזרק עם מחט 26 גרם חמש פעמים למעלה ולמטה, פירוק השלם.</li>
		<li>Centrifuge את lysates תא ב g 16,000 x 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>להעביר את supernatants צינורות שכותרתו זהה חדש.</li>
		<li>לנתח את ריכוז חלבון באמצעות ערכת Assay BCA חלבון או ערכת אחרים.</li>
		<li>באמצעות מאגר פירוק, איזון חלבונים ריכוז של כל lysates 4.</li>
		<li>נפרדים aliquot קטן (ca. 20 µL) של כל אחד lysate ולשמור אותו ב-20 ° C אפשרי ניסויים שליטה ו/או פתרון בעיות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. איגוד של חלבונים שלו מתויג החרוזים קובלט HisPur
<ol><li>השתמש שטיפת זמינים מסחרית מאגר או להכין אחד (50 מ מ נה2HPO4/NaH2PO4, 300 מ"מ NaCl, 20 מ מ imidazole, pH 8) ולשמור אותו ב 4 º C.</li>
	<li>להכין שטיפת מאגר עם pH 6 מאת באיטליה שטיפת מאגר pH 8 עם HCl. לשמור אותו ב 4 º C.</li>
	<li>מערבולת בעדינות את הבקבוק של חרוזים קובלט כדי לגרום להשעיית הומוגנית.</li>
	<li>לוותר על µL 40 של ההשעיה חרוזים קובלט לתוך 4 1.5 mL שפופרות מסומן לעיל (שלב 2.2.4).</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של פירוק מאגר כל שפופרת, ו centrifuge הצינורות ב 1000 x g עבור 5 ס' לשאוב תגובת שיקוע, ומוסיפים μL 40 פירוק מאגר שיוחסו חרוזים.</li>
	<li>הוסף את lysates תא הצינורות המתאימים.</li>
	<li>דגירה הצינורות במשך 90 דקות ב 4 ° C-מסובב שפופרת-סל ד 20.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות-1000 x g עבור 5 s ולאסוף תגובת שיקוע. לשמור את תגובת שיקוע ב 4 º C.</li>
	<li>להוסיף 500 µL של pH 8 או מאגר שטיפת pH 6 צינורות המתאימים, מחדש להשעות את החרוזים בעדינות.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות-g 1000 x עבור 5 s ו להשליך supernatants.</li>
	<li>חזור על הצעדים ציונים של 3.10 ארבע פעמים.</li>
</ol>4. עקדת פפטיד לחלבון שלו מתויג ותשמרו על חרוזים
<ol><li>באמצעות הפתרון עובד x 100 של פפטיד (שלב 1.2.1), להכין 1 x פתרונות עבודה ב- pH 6 או מאגר שטיפת pH 8 (100 שני µL aliquots עבור כל אחד, µg 1/mL).</li>
	<li>להוסיף 100 μL של פתרון פפטיד x 1 החרוזים שטוף עם ה-pH המתאים.</li>
	<li>דגירה החרוזים למשך 30 דקות ב 4 ° C-מסובב שפופרת-סל ד 20.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות-1000 g x עבור 5 s, לאסוף את תגובת שיקוע ולשמור אותו ב-20 ° C.</li>
	<li>חזור על הצעדים ציונים של 3.10 ארבע פעמים. הערה: כדי להפחית רקע אפשרי, השלבים הבאים יכול להחליף צעדים 4.4 & 4.5.</li>
	<li>לקחת ארבע עמודות מיקרו עם נקבוביות μm 30, לתייג אותם כמו שלב 2.2.4, ולמקם את העמודות אוסף צינורות.</li>
	<li>לאחר השלמת שלב 4.3, להעביר את התערובת הדגירה לתוך העמודות, לאפשר את הפתרון לעבור על ידי הכבידה. להמשיך את הזרימה ב-20 ° C.</li>
	<li>עוברים µL 500 מאגר לשטוף עם pH 6 או pH 8 דרך שלחצנו על ידי הכבידה. למחוק את הזרימה.</li>
	<li>חזור על שלב 4.8 ארבע פעמים.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה centrifuge את העמודות ב 1000 g x 15 s.</li>
</ol>5. • תנאי של קובלט חרוזים
<ol><li>שימוש מסחרי Tricine דוגמת המאגר (200 מ"מ טריס-HCl, 40% גליצרול, 2% מרחביות, 0.04% Coomassie כחול, pH 6.8) ולהוסיף β-mercaptoethanol הריכוז הסופי של 2%.</li>
	<li>להוסיף 40 µL Tricine דוגמת המאגר (עם β-mercaptoethanol) חרוזים שטף של מערבולת המדגם.</li>
	<li>מחממים את הדגימות 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס, מערבולת הדגימות שוב, ו centrifuge הצינורות-1000 g x עבור 5 s. הערה: על מנת להקטין את הכריכה לא ספציפית אפשרי ב • תנאי, השלבים הבאים יכול להחליף צעדים 5.1-5.3.</li>
	<li>להוסיף 40 μL • תנאי Imidazole מאגר (50 מ מ נה2HPO4/NaH2PO4, 300 מ"מ NaCl, 0.25 מ' imidazole) נסחפה חרוזים, מערבולת, דגירה הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב 3000 g x עבור 30 s, לאסוף את תגובת שיקוע (דוגמאות eluted) ולהעביר אותו ל צינורות שכותרתו החדש.</li>
	<li>להוסיף 40 μL Tricine מדגם מאגר כל שפופרת, מחממים את הדגימות 10 דקות-100 ° C, מערבולת, צנטריפוגה הצינורות-1000 g x עבור 5 s. הערה: אם העמודות מיקרו משמשים, להוסיף החרוזים שטף, המאגר • תנאי תקופת דגירה של 20 דקות, לאסוף את • תנאי על ידי צנטריפוגה ב 8000 g x למשך 2 דקות. הערה: דוגמאות ניתן לשמור ב-20 ° C עד אלקטרופורזה מבוצעת.</li>
</ol>6. אלקטרופורזה החיוורים ומכתים המערבי
הערה: הדגימות מוכנים לצורך הקמת מכשול ההפרדה על ידי עמודים מרחביות סופג המערבי עוקבות. פעלתי לפי הנהלים של בג'ל (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) עם השינויים הבאים
<ol><li>השתמש זמינים מסחרית 10-20% Tricine ג'לים הדרגתיות.</li>
	<li>על הג'ל, טען µL 20 של הדגימות eluted ו- µL 20 של lysates (שלב 2.2.10). לירי צרות, מומלץ כדי לטעון µL 20 של חומר לא מאוגדים (שלב 3.8) ו- 10 ng של פפטיד; לפני הטעינה, מוסיפים כמות שווה של מאגר מדגם Tricine הדוגמיות הללו.</li>
	<li>לבצע אלקטרופורזה ב מסחרי טריס/Tricine/מרחביות הפעלת מאגר (100 מ מ טריס, 100 מ מ Tricine, ו- 0.1% מרחביות, pH 8.3).</li>
	<li>להעביר את החומר הג'ל על גבי קרום ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.45 באמצעות מאגר העברה (בסיס טריס 25 מ מ, מ מ 192 גליצין, pH 8.4) בתוספת 20% מתנול.</li>
	<li>לחסום את הקרום עם 3% שור אלבומין (BSA) לשעה בטמפרטורת החדר. באמצעות סמנים משקל מולקולרי מראש מוכתם כקווי עזר, לחתוך את הקרום אופקית למחוק את החלק העליון עם נוגדן נגד HisP, כתם החלק התחתון עם נוגדן נגד epitope myc כדי לזהות את פפטיד myc מתויגת. הערה: במקרה שלנו, חיתוך של הקרום לא נדרש מאחר HisP והן Myc-fll-GLUT4 יכול להתגלות עם נוגדן אנטי-myc.</li>
</ol>7. ניתוח של תוצאות
<ol><li>לכמת את עוצמת כל הסימנים תספיג באמצעות תוכנית תחנת תמונה או ImageJ.</li>
	<li>לנרמל את האות פפטיד מתויג myc נגד האיתות HisP-שני ערכי ה-pH.</li>
</ol>

<ol><li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li>
<li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+is+sIRVed%3A+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li>
<li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li>
<li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li>
<li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li>
<li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shortcut+to+the+lysosome%3A+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95%2Fsortilin%2C+a+non-G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li>
<li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li>
<li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li>
<li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Sortilin הוא קולטן אבולוציונית שנשמרת ליגנד רב חלבון שמעורב הן איתות על קרום פלזמה, תאיים מיון אירועים6,7. עם זאת, החיפוש אחר ליגנדים של sortilin אותנטי (שחלקם הם חלבוני ממברנה luminal או אינטגרלי) הוא מסובך כפי האינטראקציה של sortilin עם חלק משותפיה הכריכה מופיע יהיה רגיש דטרגנטים. לכן, קל וגישה נרחבת ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון, co-immunoprecipitation, לא ניתן ליישם בקלות. כמה קבוצות מחקר השתמשו co-immunoprecipitation כדי להדגים את האינטראקציה בין sortilin לב...

GLUT4 הוא חלבון נשא גלוקוז הבאה לידי ביטוי בעיקר תאי שריר השלד ונטייה איפה זה שמתווכת ההשפעה של אינסולין על דם מים אחרונים גלוקוז סיווג1. להיות חלבון יציב מאוד, GLUT4 מוסדר ברמה post-translational. בהעדר אינסולין, GLUT4 הוא נשלל במידה רבה של קרום פלזמה (ומכאן נמוכה חדירות הבזליים של גלוקוז), הוא מקומי בעיקר בתוך התא שלפוחית קטנה מגיב לאינסולין (IRVs) ורשת הטרנס-גולג'י (TGN) סביר לייצג תא תורם אירב. על ניהול אינסולין, IRVs הפתיל עם קרום פלזמה ולספק GLUT4 לאתר של תפקודו. פעולה זו מגדילה את החדירות של קרום פלזמה על גלוקוז, אז את ספיגת הגלוקוז מהדם לתוך adipocytes של תאי שריר השלד עולה 10 כדי 40-fold. לאחר נסיגת אינסולין, GLUT4 הפנימו לתוך endosomes/מיון מוקדם, ואז שאוחזרו כדי TGN איפה IRVs מחדש נוצרו. מיון שני השלבים מסלול GLUT4 קרי לאחזור בלבד endosomes מוקדמת היקפיים כדי perinuclear TGN, היווצרות IRVs על התורם TGN ממברנות מופעלות על ידי בן משפחה Vps10p, sortilin, אשר מייצג את סוג אני חלבון טראנסממברנלי, קולטן המיון. על פי מודל אחד, sortilin עובד כמו חלבון transmembrane לגרדום: זה נקשר GLUT4 ב לומן של endosomes, TGN, ומגייסת מתאמים retromer או clathrin cytoplasmic לצד התורם ממברנה ויה שלה קרבוקסילי2, 3. זה מקל על ההתפלגות של GLUT4 לתוך לחברות התעופה vesicular translocate GLUT4 בין תאים תאיים.
האינטראקציה של זנב cytoplasmic של sortilin עם retromer, חלבונים שונים מתאם תועד היטב. עם זאת, הכריכה של sortilin GLUT4 (וכדי מספר שלה ליגנדים חלבונים אחרים) מאתגרת כדי להוכיח. בפרט, ניסיונות co-immunoprecipitate sortilin של GLUT4 לא היו מוצלחות כנראה בגלל מהות האינטראקציה בין שני חלבונים אלה הרגישים דטרגנט. בנוסף, כמו חלבון טיפוסי טרנספורטר, GLUT4 יש תחומים transmembrane 12 לולאות luminal 6 כל שילוב של אשר ייצגו שעשויות להיות אתר איגוד sortilin. במקביל, גוף גדול של ראיות נסיבתיות, כגון לוקליזציה שותף משמעותי בתא, cross-linking עם DSP קרום חדיר, האינטראקציה במערכת היברידית שני שמרים להציע את sortilin יכולים לאגד GLUT4. יתר על כן, באמצעות גישה האחרון בשילוב עם אלנין סריקה מוטגנזה מכוונת, אנחנו קודם לכן קבעו כי תחום Vps10p של sortilin נקשר בעיקר הלולאה luminal הראשון של GLUT4. עם זאת, ההוכחה של אינטראקציה כזו בתאים בתרבית של נעדר. כאן, יש בודדנו שלו מתויג sortilin מ transfected 3T3-L1 בתאים באמצעות שרף קובלט והפגינו זה יכול לקיים אינטראקציה עם פפטיד מסונתז כימית המתאים לתמונה luminal הראשון של GLUT4 ב- pH 6 ו- pH 8 הדומות לרקע חומצי, endosomal לומן, סביבה נייטרלית לומן של הממברנות TGN. אין איגוד פפטיד התגלה בניסויים שליטה בו תמצית מקריסטלים של תאים שאינם transfected הוטען על החרוזים באותו.

<table><tbody><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>לשימוש בטיהור חלבון תג היסטידין</td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט חומצית&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק אינסולין U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>פירס</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>מאגר כביסה</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td><td>לטיהור חלבון His-tag</td></tr><tr><td>HisPur שרף קובלט</td><td>Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דגימת טריצ'ין</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0739</td><td>עם SDS, יש להוסיף bMercaptaethanol</td></tr><tr><td>Elution&nbsp; Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-236</td><td>לטיהור חלבון His-tag עם 250 מ"מ Imidazole</td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Tricine ג'לים טרומיים 10-20%&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>להפרדת פפטיד וחלבון קטן</td></tr><tr><td>Tris/tricine/SDS running buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>מאגר העברה</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td><td>הוסף 20% מתנול</td></tr><tr><td>ניטרוצלולוז ממברנה&nbsp; 0.45 מ"מ</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>אנטי Myc נוגדן</td><td>איתות תאים</td><td>2272</td><td></td></tr><tr><td>פפטיד</td><td>ארנב Genscipt</td><td></td><td>התאמה אישית של הזמנת</td></tr><tr><td>חלבון דיוק פלוס צבע כפול Standarts</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

היכולת שלנו לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון הוא המפתח להבנת חיבורים רגולטוריות בתא. עם זאת, זיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון במקרים רבים מזוהה עם אתגרים משמעותיים ניסיוני. בפרט, קולטנים המיון אינטראקציה עם שלהם מטען החלבון בלומן של ממברנות התאים לעיתים קרובות באופן רגיש דטרגנט, ביצוע co-immunoprecipitation של חלבונים אלה לבלתי שמיש. עקדת sortilin קולטן המיון כדי נשא גלוקוז ש-glut4 עשוי לשמש דוגמה חלש luminal אינטראקציות בין חלבונים ממברנה. כאן, אנו מתארים assay מהירה, פשוטה וזולה כדי לאמת את האינטראקציה בין sortilin לבין GLUT4. בשביל זה יש תוכנן ואנו מסונתז כימית פפטיד מתויג myc התואם epitope sortilin מחייב פוטנציאליים בחלק luminal של GLUT4. מתויג עם שש histidines Sortilin הייתה הביע בתאים בתרבית של, מבודד lysates תא באמצעות קובלט חרוזים. Sortilin ותשמרו על החרוזים, נדגרה עם הפתרון פפטיד-ערכי pH שונים, החומר eluted נותחה על ידי סופג המערבי. Assay זו ניתן להתאים בקלות ללמוד אינטראקציות רגיש אבקת חלבון אחרים.

Lysates הוכנו מ 3T3 L1 בתאים stably transfected עם Sortilin-myc/שלו5 , מתאי L1 3T3 WT, משמש פקד שלילי. Lysates שניהם היו מודגרות עם חרוזים קובלט-pH 6 או pH 8 ושטף ביסודיות. חרוזים עם חלבונים קיבוע היו אז מודגרות בפתרון של Myc-fll-Glut4. לאחר שוטף זהיר, חלבונים מאוגדים החרוזים היו eluted עם 0.25 M Imidazole. הדגימות היו נתונים, יחד עם lysates המקורי, מרחביות עמודים ב- Tricine 10-20% ג'ל הדרגתיות ואחריו סופג המערבי עם נוגדן אנטי-Myc שמותר איתור של שני sortilin-myc/של...

אנו מתארים פרוטוקול גילוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה איגוד של הקולטן מיון, sortilin, כדי luminal הלולאה הראשונה של החלבון טרנספורטר גלוקוז, GLUT4, כדוגמא.

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אינטראקציות רגישות לחומר ניקוי בין חלבוני ממברנה או חלבונים אחרים. הליך זה דורש שחלבון אחד יהיה מתויג על ידי היסטידינים ומתבטא יתר על המידה בתאים, בעוד שהשני הוא פפטיד מתויג myc. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום הביוכימיה מחקרי אינטראקציה חשובים בין חלבונים.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לזהות את האינטראקציה בין חלבוני הממברנה בצורה רגישה לחומר ניקוי. ההליך מהיר וקל. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות חלבון ממברנה, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור אינטראקציות חלבון חלשות.הרעיון של שיטה זו עלה לראשונה כשרצינו לבדוק את האינטראקציה בין חלבוני הממברנה, Saltilin ו-GLUT4, אך ניסיונות לזרז אותם במשותף מהליזה של היונקים נותרו ללא הצלחה. כדי לבצע סדר עבור הפפטיד, בחר את רצף היעד של הפפטיד הקריטי לאינטראקציה והוסף אפיטופ myc בסוף או בקצה C של הרצף. לאחר שהפפטיד הגיע, פפפר 100 מיקרוגרם למיליליטר של תמיסת עבודה של הפפטיד במים טהורים במיוחד.זרעו שלושה תאי קדם-אדיפוציטים 3T3-L1 בארבע צלחות תרבית של 10 סנטימטר ושמרו בחממה. לאחר מכן, העבירו שתי מנות תרבית עם חלבון המטרה המתויג בהיסטודין 6X ותווית כ-HISP בשתי המנות האחרות עם שני פלסמידים בקרה ותווית כ-WT. לאחר הטרנספקציה, השאירו את התאים בחממה למשך 48 שעות כדי להגיע למפגש של 80 עד 90%. כדי להכין את הליזאט של התא, שטפו את התאים על קרח שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של מי מלח 1X מקוררים בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל אחד מהם. לאחר מכן, נתק את התאים מהכלים באמצעות מגרד תאים להכנת הליזאט. העבירו את ליזט התאים שהוכן מכל צלחת תרבית לארבעה צינורות נפרדים של 1.5 מילימטר וסמנו את כל הצינורות.לאחר מכן, העבירו את ליזאט התא דרך מזרק עם מחט 26 מד למעלה ולמטה במשך חמש פעמים לליזה תאית כוללת. לאחר מכן, צנטריפוגה של הליזאטים התאיים ב-16000xg למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנטים לארבעה צינורות חדשים בעלי תווית זהה.לניסויי פתרון בעיות ובקרה עתידיים, יש לאחסן 20 מיקרוליטר מהתא ולאחסן אותו 20 מעלות צלזיוס. לשימוש מאוחר יותר, טיטר את מאגר הכביסה ב-PH8 עם חומצה הידרוכלורית כדי להשיג PH6 ולאחסן את המאגר בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להכנת מתלה הומוגני של חרוזי הקובלט, סובבו בזהירות את הבקבוק.לאחר מכן, העבירו 40 מיקרוליטר של תרחיף חרוזי קובלט לכל ארבעת הצינורות המסומנים בנפרד. לאחר הוספת חרוזי הקובלט, הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה לצינורות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב-1000xg למשך חמש שניות.השליכו את הסופרנטנט ופיפטה 40 מיקרוליטר של מאגר ליזה לחרוזים המיושבים. לאחר מכן, העבירו את הליזאט של התא לצינורות המתאימים ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך 90 דקות על מסובב צינור. לאחר 90 דקות, צנטריפוגה את הדגימות ב-1000xg למשך חמש שניות.לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט שכותרתו Flowthrough-1 ואחסנו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הכביסה עם PH8 לצינורות הבודדים ותלה מחדש את החרוזים בעדינות. צנטריפוגה של הצינורות ב-1000xg למשך חמש שניות והוציאו את הסופרנטנטים.לאחר מכן, הוסף מאגר כביסה עם PH8 עם או שישה לצינורות, על פי התוויות והשעיה מחדש את החרוזים היטב. צנטריפוגה של הצינורות ב-1000xg למשך חמש שניות והוציאו את הסופרנטנטים. הכן מיקרוגרם אחד למיליליטר תמיסת עבודה של הפפטיד ומאגר המים עם PH6 או שמונה.לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד לחרוזים השטופים המתאימים ל- PH דומה. לאחר מכן, דגרו את החרוזים בארבע מעלות צלזיוס על מסובב צינור למשך 30 דקות. לאחר מכן, קחו ארבעה מיקרו-עמודים, סמנו אותם והניחו את העמודות בצינורות איסוף המסומנים Flowthrough-2. לאחר סיום הדגירה מוסיפים את תערובת הדגירה לעמודים.תן לתמיסה לעבור בכוח הכבידה ואסוף את הדגימה מהזרימה. הניחו את העמודים בצינורות איסוף חדשים ואחסנו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה עם PH6 או שמונה על ידי זרימת כבידה דרך העמודות הבודדות והשליכו את הזרימה.חזור על שלב זה ארבע פעמים. צנטריפוגה את הצינורות ב-1000xg למשך חמש שניות. הנח את העמודה בצינור האיסוף החדש שכותרתו Elution.חשוב לשטוף את החרוזים בכל הצינורות בזהירות רבה ובאותה מידה כדי להיפטר מהפפטיד הלא קשור. לחרוזים השטופים מוסיפים 40 מיקרוליטר של מאגר דגימת טריצין עם בטא מרקפטואתנול. תן לזה לשבת 20 דקות בטמפרטורת החדר.צנטריפוגה את העמוד ב-8000xg למשך שתי דקות. השליכו את העמודים וחממו את צינורות האיסוף בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז, צנטריפוגה ב-1000xg למשך חמש שניות.לחלופין, הוסיפו 40 מיקרוליטר של מאגר Elution Imidazole לחרוזים השטופים ודגרו בחדר ממוזג למשך 20 דקות. לאחר סיום הדגירה, צנטריפוגה את הצינורות ב-8000xg למשך שתי דקות. השליכו את העמודות והוסיפו דגימת טריצין של 40 מיקרוליטר.מחממים את צינורות האיסוף בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה של 1000xg למשך חמש שניות. השתמש בג'לים הזמינים מסחרית של 10-20% טריקין. השתמש במאגר ריצה Tris/Tricine/SDS, ולאחר מכן טען 20 מיקרוליטר כל אחת מהדגימות המוחלפות וסך הליזטים על הג'ל והתחל להפעיל את יחידת האלקטרופורזה.לאחר סיום האלקטרופורזה, השתמש במאגר העברה בתוספת 20% מתנול כדי להעביר את החומר מהג'ל לקרום ניטרוצלולוזה של 0.45 מיקרומטר. לאחר חסימת הממברנה, חותכים אותה אופקית. לאחר מכן, בדוק את החלק העליון של הממברנה עם נוגדן Anti His P בחצי התחתון של הממברנה עם אנטי myc.כדי לחקור את האינטראקציה בין סורטילין משותק על חרוזי קובלט ב-GLUT4, בוצע ניתוח אימונובלוט. ליזטים ואלואטים סלולריים התקבלו מסוג פרא ותאי 3T3-L1 מתויגים Sortilin-myc/His-tagged ולאחר מכן נטענו בדף SDS. הכתם נבדק עם נוגדן אנטי-myc.הכתם מראה לולאה לומינלית של 110 קילודוטין Sortili-myc/His-tagged וחמישה קילוטין myc-GLUT4 מהאלואטים הטרנספטיים. לאחר מכן, כדי לחקור את חשיבות ה-PH והאינטראקציה בין סורטילין המשותק על חרוזי קובלט ו-GLUT4, בוצע ניתוח אימונובלוט. בבדיקה זו, לולאה לומינלית ראשונה של Myc GLUT4 הודגרה עם חרוזים משותקים עם חלבונים מתויגים Sortilin-myc/His, הן ב-PH6 והן ב-PH6 ובשמונה.הכתם מראה אינטראקציה ברורה בין Sortilin-myc/His לבין לולאה לומינלית ראשונה GLUT4 הן ב-PH6 והן שמונה מהאלואטים המתקבלים מתאי 3T3-L1 המתויגים של Sortilin-myc/His. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות עד שהדגימות מוכנות לניתוח דם מערבי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתכנן פפטיד מסיס, רצוי במים.כדי לחזק את התוצאות שלך, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו משקעים חיסוניים בעקבות קישור צולב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות חלבון ממברנה, אינטראקציות חלבון בהליך רגיש לחומר ניקוי. זה גם מאפשר לחקור אינטראקציה בין שברי חלבון.ג'אז קצבי רך.

detection-detergent-sensitive-interactions-between-membrane

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של זיהוי גודל פלואורסצנטי כדי לסנן יציבות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-התיך חלבון ממברנה ב- Escherichia coli לאחר מסיסות חומרי ניקוי. חלבונים המציגים שיא סימטרי בפרופיל אי הכללת הגודל עם מעט או ללא GFP חופשי מצביעים על חלבונים מטוהרים עם מינימום פירוק וצבירה, אשר לאחר מכן ניתן לבחור אותם לניתוח מבנה-פונקציה.

כרומטוגרפיה של זיהוי פלואורסצנטיות של אי הכללת גודל: טכניקה לזיהוי שלמות חלבוני הממברנה הפלואורסצנטית בעת מסיסות חומרי ניקוי

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג דגם ברזולוציה נמוכה ab initio ופרטים מבנית של חלבון הממברנה solubilized-חומרי ניקוי בתמיסה באמצעות פיזור ניוטרון זווית קטנה עם התאמת ניגודיות של הנוזל.

התאמת ניגודיות דטרגנט בניסויים פיזור ניוטרון זווית קטנה עבור ניתוח מבנה של חלבון ממברנה ומודלים Initio אלב

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

תרמופורזה מיקרומטרית מקבלת קבועי כריכה במהירות בעלות חומר נמוכה. תרמופורזה מיקרו-קשקשית ללא תווית או תווית זמינה מסחרית; עם זאת, תווית תרמופורזה חינם אינו מסוגל מגוון של מדידות אינטראקציה שניתן לבצע באמצעות תוויות פלואורסצנטיות. אנו מספקים פרוטוקול למדידות תרמופורזה מתויגות.

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

אנו מציגים שיטה המשלבת טיהור חלבון ממברנה והחוקה לתוך peptidiscs בצעד כרומטוגרפי יחיד. מקפלים ביולוגיים משמשים להחזקה ישירה של פני השטח ולמדידה של מדידת חלבונים ואינטראקציות באמצעות האינטרפרומטריה.

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

למד לזהות אינטראקציות רגישות לדטרגנט בין חלבוני ממברנה באמצעות שיטת תיוג היסטידין ומייק. פרוטוקול זה מאפשר חקר אינטראקציות חלבוניות חלשות בין sortilin ל-GLUT4 בקלות ובמהירות.

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

גלה סרטונים נוספים