זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה
March 7th, 2018
אנו מתארים פרוטוקול גילוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה איגוד של הקולטן מיון, sortilin, כדי luminal הלולאה הראשונה של החלבון טרנספורטר גלוקוז, GLUT4, כדוגמא.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות אינטראקציות רגישות לחומר ניקוי בין חלבוני ממברנה או חלבונים אחרים. הליך זה דורש שחלבון אחד יהיה מתויג על ידי היסטידינים ומתבטא יתר על המידה בתאים, בעוד שהשני הוא פפטיד מתויג myc. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחום הביוכימיה מחקרי אינטראקציה חשובים בין חלבונים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לזהות את האינטראקציה בין חלבוני הממברנה בצורה רגישה לחומר ניקוי. ההליך מהיר וקל. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות חלבון ממברנה, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור אינטראקציות חלבון חלשות.
הרעיון של שיטה זו עלה לראשונה כשרצינו לבדוק את האינטראקציה בין חלבוני הממברנה, Saltilin ו-GLUT4, אך ניסיונות לזרז אותם במשותף מהליזה של היונקים נותרו ללא הצלחה. כדי לבצע סדר עבור הפפטיד, בחר את רצף היעד של הפפטיד הקריטי לאינטראקציה והוסף אפיטופ myc בסוף או בקצה C של הרצף. לאחר שהפפטיד הגיע, פפפר 100 מיקרוגרם למיליליטר של תמיסת עבודה של הפפטיד במים טהורים במיוחד.
זרעו שלושה תאי קדם-אדיפוציטים 3T3-L1 בארבע צלחות תרבית של 10 סנטימטר ושמרו בחממה. לאחר מכן, העבירו שתי מנות תרבית עם חלבון המטרה המתויג בהיסטודין 6X ותווית כ-HISP בשתי המנות האחרות עם שני פלסמידים בקרה ותווית כ-WT. לאחר הטרנספקציה, השאירו את התאים בחממה למשך 48 שעות כדי להגיע למפגש של 80 עד 90%. כדי להכין את הליזאט של התא, שטפו את התאים על קרח שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של מי מלח 1X מקוררים בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל אחד מהם. לאחר מכן, נתק את התאים מהכלים באמצעות מגרד תאים להכנת הליזאט. העבירו את ליזט התאים שהוכן מכל צלחת תרבית לארבעה צינורות נפרדים של 1.5 מילימטר וסמנו את כל הצינורות.
לאחר מכן, העבירו את ליזאט התא דרך מזרק עם מחט 26 מד למעלה ולמטה במשך חמש פעמים לליזה תאית כוללת. לאחר מכן, צנטריפוגה של הליזאטים התאיים ב-16000xg למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנטים לארבעה צינורות חדשים בעלי תווית זהה.
לניסויי פתרון בעיות ובקרה עתידיים, יש לאחסן 20 מיקרוליטר מהתא ולאחסן אותו 20 מעלות צלזיוס. לשימוש מאוחר יותר, טיטר את מאגר הכביסה ב-PH8 עם חומצה הידרוכלורית כדי להשיג PH6 ולאחסן את המאגר בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להכנת מתלה הומוגני של חרוזי הקובלט, סובבו בזהירות את הבקבוק.
לאחר מכן, העבירו 40 מיקרוליטר של תרחיף חרוזי קובלט לכל ארבעת הצינורות המסומנים בנפרד. לאחר הוספת חרוזי הקובלט, הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה לצינורות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב-1000xg למשך חמש שניות.
השליכו את הסופרנטנט ופיפטה 40 מיקרוליטר של מאגר ליזה לחרוזים המיושבים. לאחר מכן, העבירו את הליזאט של התא לצינורות המתאימים ודגרו בארבע מעלות צלזיוס למשך 90 דקות על מסובב צינור. לאחר 90 דקות, צנטריפוגה את הדגימות ב-1000xg למשך חמש שניות.
לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט שכותרתו Flowthrough-1 ואחסנו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר הכביסה עם PH8 לצינורות הבודדים ותלה מחדש את החרוזים בעדינות. צנטריפוגה של הצינורות ב-1000xg למשך חמש שניות והוציאו את הסופרנטנטים.
לאחר מכן, הוסף מאגר כביסה עם PH8 עם או שישה לצינורות, על פי התוויות והשעיה מחדש את החרוזים היטב. צנטריפוגה של הצינורות ב-1000xg למשך חמש שניות והוציאו את הסופרנטנטים. הכן מיקרוגרם אחד למיליליטר תמיסת עבודה של הפפטיד ומאגר המים עם PH6 או שמונה.
לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד לחרוזים השטופים המתאימים ל- PH דומה. לאחר מכן, דגרו את החרוזים בארבע מעלות צלזיוס על מסובב צינור למשך 30 דקות. לאחר מכן, קחו ארבעה מיקרו-עמודים, סמנו אותם והניחו את העמודות בצינורות איסוף המסומנים Flowthrough-2. לאחר סיום הדגירה מוסיפים את תערובת הדגירה לעמודים.
תן לתמיסה לעבור בכוח הכבידה ואסוף את הדגימה מהזרימה. הניחו את העמודים בצינורות איסוף חדשים ואחסנו בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה עם PH6 או שמונה על ידי זרימת כבידה דרך העמודות הבודדות והשליכו את הזרימה.
חזור על שלב זה ארבע פעמים. צנטריפוגה את הצינורות ב-1000xg למשך חמש שניות. הנח את העמודה בצינור האיסוף החדש שכותרתו Elution.
חשוב לשטוף את החרוזים בכל הצינורות בזהירות רבה ובאותה מידה כדי להיפטר מהפפטיד הלא קשור. לחרוזים השטופים מוסיפים 40 מיקרוליטר של מאגר דגימת טריצין עם בטא מרקפטואתנול. תן לזה לשבת 20 דקות בטמפרטורת החדר.
צנטריפוגה את העמוד ב-8000xg למשך שתי דקות. השליכו את העמודים וחממו את צינורות האיסוף בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז, צנטריפוגה ב-1000xg למשך חמש שניות.
לחלופין, הוסיפו 40 מיקרוליטר של מאגר Elution Imidazole לחרוזים השטופים ודגרו בחדר ממוזג למשך 20 דקות. לאחר סיום הדגירה, צנטריפוגה את הצינורות ב-8000xg למשך שתי דקות. השליכו את העמודות והוסיפו דגימת טריצין של 40 מיקרוליטר.
מחממים את צינורות האיסוף בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה של 1000xg למשך חמש שניות. השתמש בג'לים הזמינים מסחרית של 10-20% טריקין. השתמש במאגר ריצה Tris/Tricine/SDS, ולאחר מכן טען 20 מיקרוליטר כל אחת מהדגימות המוחלפות וסך הליזטים על הג'ל והתחל להפעיל את יחידת האלקטרופורזה.
לאחר סיום האלקטרופורזה, השתמש במאגר העברה בתוספת 20% מתנול כדי להעביר את החומר מהג'ל לקרום ניטרוצלולוזה של 0.45 מיקרומטר. לאחר חסימת הממברנה, חותכים אותה אופקית. לאחר מכן, בדוק את החלק העליון של הממברנה עם נוגדן Anti His P בחצי התחתון של הממברנה עם אנטי myc.
כדי לחקור את האינטראקציה בין סורטילין משותק על חרוזי קובלט ב-GLUT4, בוצע ניתוח אימונובלוט. ליזטים ואלואטים סלולריים התקבלו מסוג פרא ותאי 3T3-L1 מתויגים Sortilin-myc/His-tagged ולאחר מכן נטענו בדף SDS. הכתם נבדק עם נוגדן אנטי-myc.
הכתם מראה לולאה לומינלית של 110 קילודוטין Sortili-myc/His-tagged וחמישה קילוטין myc-GLUT4 מהאלואטים הטרנספטיים. לאחר מכן, כדי לחקור את חשיבות ה-PH והאינטראקציה בין סורטילין המשותק על חרוזי קובלט ו-GLUT4, בוצע ניתוח אימונובלוט. בבדיקה זו, לולאה לומינלית ראשונה של Myc GLUT4 הודגרה עם חרוזים משותקים עם חלבונים מתויגים Sortilin-myc/His, הן ב-PH6 והן ב-PH6 ובשמונה.
הכתם מראה אינטראקציה ברורה בין Sortilin-myc/His לבין לולאה לומינלית ראשונה GLUT4 הן ב-PH6 והן שמונה מהאלואטים המתקבלים מתאי 3T3-L1 המתויגים של Sortilin-myc/His. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות עד שהדגימות מוכנות לניתוח דם מערבי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתכנן פפטיד מסיס, רצוי במים.
כדי לחזק את התוצאות שלך, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו משקעים חיסוניים בעקבות קישור צולב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות חלבון ממברנה, אינטראקציות חלבון בהליך רגיש לחומר ניקוי. זה גם מאפשר לחקור אינטראקציה בין שברי חלבון.
ג'אז קצבי רך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות רגישות לדטרגנט בין חלבוני ממברנה, תוך שימוש בקישור של קולטן המיון, סורטילין, לחלבון הובלת הגלוקוז, GLUT4, כדוגמה. השיטה נועדה להקל על מחקרים של אינטראקציות חלבון בהקשר ביוכימי רלוונטי.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- אינטראקציות חלבון ממברנה
- טכניקות תיוג חלבון
רקע
- הבנת אינטראקציות חלבון היא קריטית בביוכימיה.
- חלבוני ממברנה דורשים לעיתים קרובות תנאים ספציפיים כדי לחקור את האינטראקציות שלהם.
- שיטות רגישות לדטרגנט מספקות תובנות לגבי הדינמיקה של האינטראקציות הללו.
- תיוג היסטידין ו-myc הן טכניקות נפוצות המשמשות לזיהוי חלבונים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לזיהוי אינטראקציות בין חלבוני ממברנה.
- להדגיש את היתרונות של שימוש בטכניקות רגישות לדטרגנט.
- לספק פרוטוקול מהיר וקל לחוקרים בתחום.
שיטות בשימוש
- בליטת חלבון מתויג היסטידין בתאים.
- שימוש בפפטיד מתויג myc למחקרי אינטראקציה.
- יישום של מבחנים רגישים לדטרגנט כדי לזהות אינטראקציות חלבון.
- ניתוח של אינטראקציות קישור בין סורטילין ל-GLUT4.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מצליח לזהות אינטראקציות בין חלבוני ממברנה.
- הרגישות לדטרגנט מאפשרת לחקור אינטראקציות חלבון חלשות.
- התוצאות מדגימות את יעילות שיטת התיוג.
- הנוהל יעיל וניתן לשחזור עבור חוקרים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת תובנות חשובות לגבי אינטראקציות חלבון ממברנה.
- ניתן ליישם אותה במחקרים שונים של אינטראקציות חלבון.
- מחקר עתידי יכול לבנות על טכניקה זו להבנה עמוקה יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Detecting weak, detergent-sensitive protein-protein interactions remains a critical challenge in early-stage target validation, particularly for membrane protein complexes. This assay enables rapid, cost-effective interrogation of luminal domain interactions that are refractory to conventional co-immunoprecipitation, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. By providing a scalable, tag-based approach, it enhances predictive confidence in target engagement studies prior to lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of weak luminal interactions between membrane proteins such as sortilin and GLUT4.
- Operational Value: Uses histidine-tagged protein capture and myc-tagged peptide detection to bypass detergent-sensitive limitations of standard co-IP.
- Scientific Value: Supports target hypothesis testing by confirming pH-dependent binding relevant to intracellular trafficking pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative elution profiles across pH conditions to assess interaction strength and specificity.
- Operational Value: Employs cobalt bead-based purification and Western blot readout for reproducible, adaptable interaction screening.
- Operational Value: Requires only peptide synthesis and standard transfection, enabling rapid assay setup for other membrane protein pairs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maps interaction dependencies on microenvironmental variables like pH, informing physiological relevance in adipocyte models.
- Operational Value: Uses 3T3-L1 pre-adipocyte lysates to maintain disease-relevant context for metabolic target studies.
- Scientific Value: Facilitates de-risking of targets involved in glucose transporter regulation, a key mechanism in metabolic disease.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target engagement must be confirmed before progressing to hit identification or lead optimization, especially for membrane protein targets with weak or conditional interactions.
- Discovery Biology: Tests direct binding between overexpressed histidine-tagged receptor and synthetic peptide representing the putative interaction epitope.
- Screening: Enables dose- and condition-dependent interaction screening via elution analysis under varying buffer pH.
- Analytics: Relies on Western blot detection of eluted myc-tagged peptide to quantify interaction strength and specificity.
- Translational Research: Connects in vitro binding data to cellular localization and function in glucose transport pathways.
- Enterprise Reuse: Platform can be redeployed for any histidine-tagged protein and corresponding myc-tagged peptide pair.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces false negatives in interaction screening by preserving native-like binding conditions for detergent-sensitive complexes.
- Operational Value: Completes in 3–4 hours using standard lab equipment, minimizing resource investment per interaction test.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions on target feasibility based on direct biochemical evidence of interaction.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of targets with validated interaction mechanisms, reducing downstream attrition due to mechanistic uncertainty.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, lysis, and affinity purification using metal chelate resins.
- Dependent on access to peptide synthesis services for myc-tagged epitope production.
- Necessitates standardization of lysis, wash, and elution buffers across laboratories for reproducible results.
- Adaptation to other systems requires validation of peptide solubility and target expression levels.
- Limited to interactions where one partner can be overexpressed and tagged, and the interacting domain can be synthesized as a peptide.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Handling of the Peptide and Cells
3:02
Binding of His-tagged Proteins to the HisPur Cobalt Beads
4:39
Binding of the Peptide to the His-tagged Protein Immobilized on the Beads
5:59
Elution from Cobalt Beads
7:07
Electrophoresis, Western Blotting, and Analysis of Results
7:58
Results: Use of Immunoblot Assay to Study the Interaction between Sortilin Immobilized on Cobalt Beads and myc-tagged Peptide
9:18
Conclusion
