שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה, היא לפתח שיטה בעלת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה ליצירת תאים דנדריטיים או DCs, המשקפים באופן גורלי את הסטייה הפנוטיפית והתפקודית שלהם. תאים דנדריטיים קיימים כאוכלוסיות גדולות באיברי לימפה. לכן, אנו משתמשים בליגנד מסנן כדי להגדיל את התדירות של תאים חיוניים אלה ברקמות התורם כדי להקל על הבידוד הזה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסירה את הדור של כל תת-קבוצות ה-DC במספרים מתאימים לניתוח באמצעות הסוכנים הזמינים מסחרית בלבד. כדי לקצור ליגנד flt-3 המבטא תאי מלנומה B16 מתרבית משולבת של 90%, יש לשטוף תחילה את התאים עם PBS ולדגור את התרבית עם 05% טריפסין ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר 5 דקות, הרוו את פעילות הפרוטאז עם 20 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס מדיום דימה שלם ונתקו את שכבת דגם התא הדבק עם הקשה קלה ופיפטינג עדין.

אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה וסופרים אותם. לאחר מכן, השעו מחדש את תרחיף התא הבודד ל-1 פעמים לריכוז 8 תאים למיליליטר ב-PBS להזרקתם התת עורית לעכברי C57 שחורים 6. כאשר הגידול מגיע לקוטר של שניים עד עשרה מיליליטר, קצרו את הטחול מבעלי החיים הנושאים את הגידול והניחו את הטחול בצלחת פטרי המכילה מדיום RPMI טרי.

בעזרת אזמל חותכים את הרקמות לחתיכות של 0.2 סנטימטרים רבועים, ואז דוגרים את השברים בעשרה מיליליטר קולגנאז ודנאז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 30 דקות, שפכו את תמיסת הרקמה המעוכלת חלקית על מסננת תאים של 70 מיקרון, והשתמשו בבוכנה של מזרק של חמישה מיליליטר כדי ללחוץ את שברי הרקמה הנותרים דרך רשת המסננת. שטפו את המסנן עם 10 מיליליטר של מדיום טרי, איגדו את הכביסה עם שאר מתלה התא היחיד וגלולו את התאים.

אנו משעים את כדור התא ב-2 מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של מדיום RPMI טרי, והשעו אותם מחדש ב-1 פעמים 10 עד 8 תאים למיליליטר במאגר מיון תאים המכיל בלוק FC. כדי לבודד את DCs של ציטוד הפלזמה, יש לערבב היטב 300 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים עם תווית ביוטין מתוך ערכת בידוד DC של ציטוד פלזמה עם 200 מיקרוליטר של תרחיף התא הבודד הטחול.

הניחו את התאים באמבט מי קרח למשך 15 דקות, עם הקשה עדינה כל שלוש דקות. לאחר מכן שטפו את התאים עם 12 מיליליטר של מאגר מיון תאים, והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר מיון טרי. לאחר מכן, דגרו את התאים ב-300 מיקרוליטר של חרוזים מצומדים אנטי-ביוטין, נוגדנים למשך 15 דקות נוספות במי הקרח עם הקשה רגילה.

לאחר שטיפת התאים במאגר מיון טרי, השעו מחדש את המזרן ב-2 מיליליטר של מאגר מיון תאים, וטענו עמודה מגנטית בגודל מתאים על המגנט המתאים לו. אזן את העמודה עם חמישה מיליליטר של מאגר מיון תאים טרי של 4 מעלות צלזיוס. כאשר כל המאגר התנקז מראש העמודה, הוסף בזהירות את התאים למרכז פני השטח של ראש העמוד, ואסוף את הזרימה.

לאחר מכן שטפו את העמוד עם 10 מיליליטר של מאגר מיון טרי של 4 מעלות צלזיוס ואספו את הזרימה באותו צינור. לאחר מעבר דרך עמודה מגנטית שנייה, ניתן לצפות לאוכלוסיית תאים דנדריטיים של ציטוד פלזמה עם טוהר של יותר מ-94%. כדי לבודד את CD8aplha+ ו-CD8alpha-DCs, ערבבו את שאר תרחיף תאי הטחול עם 100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים מצומדים ביוטיים מערכת בידוד תאים דנדריטיים CD8alpha+, למשך 15 דקות על קרח עם הקשה עדינה, כפי שהודגם זה עתה.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים ב-12 מיליליטר של מאגר מיון תאים של 4 מעלות צלזיוס, ולהשעות מחדש את הגלולה ב-150 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים טרי של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ערבבו את התאים עם 100 מיקרוליטר של ערכת בידוד התאים הדנדריטית CD8alpha+Dendritic חרוזי אנטי-ביוטין. לאחר 15 דקות על קרח עם הקשה עדינה, שטפו את התאים ב-10 מיליליטר של מאגר מיון תאים של 4 מעלות צלזיוס, והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מיליליטר של מאגר מיון טרי של 4 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, מיין את התאים לפי הפרדת חרוזים מגנטית, כפי שהודגם זה עתה, איסוף הזרימה והשטיפה הראשונה. לאחר מכן, סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מאגר מיון תאים טרי של 4 מעלות צלזיוס. כעת סמנו את התאים ב-200 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים נגד CD8aplha מהערכה, והעבירו את התאים דרך עמודה חדשה, ואספו את זרימת התא הדנדריטי CD8alpha.

כדי לאסוף את ה-CD8alpha+DCs, העבירו את העמודה לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר, וצללו 5 מיליליטר של מאגר מיון תאים טרי של 4 מעלות צלזיוס דרך העמודה. לאחר הרצת התאים בעמודה שנייה, ניתן לצפות לאוכלוסיית תאים דנדריטיים גדולה מ- 96%CD8alpha+dendritic. כדי לבודד את תאי CD8alpha, סובב את תרחיף התאים CD8alpha-flow-through.

לאחר מכן סמן את התאים ב-100 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים נגד CD11 ואסוף את אוכלוסיית התאים החיוביים של החרוזים המגנטיים, כפי שהודגם זה עתה, כדי להשיג אוכלוסיית תת-קבוצה של תאים דנדריטיים של יותר מ-97%CD8alpha-dendritic. לבסוף, קבע את מספר התאים החיים, על ידי אי הכללה של טריפאן כחול. ברגע שהגידול הופך מוחשי, העכברים הנושאים את הגידול B16 flt-3 מציגים באופן עקבי עלייה דרמטית בתאי הטחול המתואמת עם התרחבות תת-הקבוצות של התאים הדנדריטיים הטחוליים.

מעניין לציין שבעוד שנצפתה עלייה של פי 15 עד פי 20 במספר התאים המוחלט עבור ה-DCs הקונבנציונליים בבעלי חיים אלה, נצפתה רק עלייה של פי 4 עבור תת-קבוצת DC ציטוד הפלזמה. תת-קבוצות התאים הדנדריטיים השונות מאופיינות על פי ביטוי B220, CD11b, CD11c ו-CD8alpha שלהם. אוכלוסיות התאים מציגות גם סמני תת-קבוצה ייחודיים אחרים, עם זאת, כאשר mPDCA1 מתבטא אך ורק ב-DCs של ציטוד הפלזמה DEC205 המתבטא מאוד ב-CD8alpa+DCs, ו-CD11b ו-33D1 זוהו באופן הבולט ביותר ב-CD8alpha-DCs.

באמצעות שיטה זו, הוכחנו ש-CD8alpa+DCs הם היעילים ביותר בהצגת אנטיגנים על ידי מולקולות קשירה CD לאוכלוסיית תאי T מיוחדת הידועה כתאי NKT קבועים. המאפיין הקריטי ביותר של בידוד DC הוא שמירה על סטריליות קפדנית ותנאים נטולי נוגדי דוקסנט. במהלך ההליכים, תאי T אלה מגיבים מאוד לנוגדי דוקסן.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בתאים בעדינות, שכן גירוי מכני חוזר עלול לשנות את מצב ההתבגרות של תאים דנטטריטיים. לאחר השליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לבודד מספר גבוה של כל תת-קבוצות ה-DC העיקריות מטחול יחיד. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.