שיטה פשוטה ויעילה לבדיקת חומרים אימונומודולטוריים ליצירת תאים דנדריטיים טולרוגניים ממונוציטים CD14⁺ אנושיים

אנו מבקשים להבין אילו טיפולים אימונומודולטוריים יכולים ליצור תאים דנדריטיים נסבלים מתאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים שכבר התמיינו, וזה בעל ערך רב למחקר אוטואימוני והשתלות. טיפולים עצמיים הופכים מעשיים יותר עקב התקדמות בייצור ותאים דנדריטיים טולרוגניים הראו הבטחה במחקרים פרה-קליניים. הם יכולים ליצור סובלנות ספציפית לאנטיגן. הנפוץ ביותר הוא עבור ציטומטריה. זה מספק דרך מהירה ונגישה גם לנתח תאים נסבלים. זה מאתגר לייצר תאים דנדריטיים טולרוגניים המתמידים בשניהם מתפקדים in vivo. זו הסיבה שאין טיפולים תאים דנדריטיים מאושרים קלינית לסבילות. זיהינו שילובים חדשים של תרכובות אימונומודולטוריות ממחקרי סקר גדולים המראים שיפור בתפקוד התאים הדנדריטיים הנסבלים. אנו גם מהנדסים ניסוחים של ננו-חלקיקים סובלניים.

[מדריך] כדי להתחיל, הניחו את צינורות ה-15 מיליליטר המכילים מונוציטים אנושיים מועשרים ועם תאי T בצנטריפוגה. לאחר השלמת הצנטריפוגה, השתמש בפיפטה כדי לשאוב את הסופרנטנט מהצינורות. הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית MODC לגלולת המונוציטים, מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאי T לצינור עם תאי ה-T וערבב היטב לפני ספירת התאים. לאחר מכן, הוסף תשעה מיליליטר של מדיום תרבית MODC חם למתלה המונוציטים כדי ליצור את הנפח הסופי של 10 מיליליטר. לאחר מכן פיפטה 100 מיקרוליטר כל אחד מפתרונות מלאי GM-CSF ו-IL-4. העבירו את המתלה לצלחת פטרי מסומנת, המסומנת כ-MODC, ודגרו. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום הקפאה של תאי T לתרחיף תאי T. מחלקים את התערובת לשני בקבוקוני קריו של שני מיליליטר. הנח את בקבוקוני הקריו האטומים בתא הקפאה עם צינורות איזון בבארות שאינן בשימוש. ביום הרביעי, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבית MODC טרי לצינור המונוציטים. לאחר מכן פיפטה 100 מיקרוליטר כל אחת מתמיסות מלאי GM-CSF ו-IL-4 שבע ודגירה עד היום השביעי. ביום השביעי, העבירו את התאים הדנדריטיים המובחנים שמקורם במונוציטים, או MDOCs, לתוך צינור של 50 מיליליטר וצנטריפוגה כמו קודם. הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית MODC חם לכדור התא ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. יש לדלל את התרחיף במדיום תרבית MODC חם המכיל GM-CSF ו-IL4 עד לקבלת ריכוז התאים הרצוי. הוצא 100 מיקרוליטר מהתרחיף המכיל 30,000 תאים לכל באר של צלחת תרבית רקמות עם תחתית שטוחה של 96 בארות. הוסף מיקרוליטר אחד של תרופות אימונומודולטוריות לבארות המיועדות ודגירה. למחרת, צנטריפוגה את צלחת ה- MODC ב -300 גרם למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט בעדינות, הוסף בעדינות 200 מיקרוליטר HBSS חם לצד הצלחת והצנטריפוגה. שוב, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית MODC חם המכיל GM-CSF ו-IL4 לאחר שאיבת סופרנטנט. אם נעשה שימוש בגירוי חיסוני, הוסף מיקרוליטר אחד של מלאי 100X של ליפופוליסכריד לבארות המיועדות ודגירה. ביום השמיני, יש להפשיר שני בקבוקוני קריו באמבט חרוזים חם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתוכן מתחיל להימס. לאחר הפשרה חלקית, העבירו את הבקבוקונים למכסה המנוע של תרבית תאים. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאי T חם כדי להפשיר את התאים במהירות. העבירו את התכולה לתוך שפופרת של 50 מיליליטר ושטפו את בקבוקוני הקריו עם מיליליטר נוסף של מדיום תרבית תאי T כדי לאסוף את כל התאים. מלאו את המתלים בתמיסת מכתים זרימה ל -15 מיליליטר וצנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של תמיסת צביעת זרימה וצנטריפוגה שוב, ואז השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאי T חמים לאחר הוצאת הסופרנטנט. הוסף תשעה מיליליטר של מדיום תרבית תאי T חם כדי ליצור נפח סופי של 10 מיליליטר. מעבירים את המתלה לצלחת פטרי המסומנת כתאי T מופשרים מחדש ומדגרים. ביום השמיני, צנטריפוגה את צלחת ה- MODC ב -300 גרם למשך חמש דקות. לאחר הוצאת הסופרנטנט, הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת מכתים זרימה לכל באר ודגרו. לאחר מכן פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר תאים מחוברים ואת מתלה התאים לצלחת תחתונה חדשה של 96 באר V לפני הצנטריפוגה שוב. פיפטה 50 מיקרוליטר של נוגדן מעכב קושר קולטן FC לכל באר לאחר שאיבת הסופרנטנט כדי לחסום קשירה לא ספציפית. לאחר דגירה של הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, הוסיפו 50 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים של לוח האימות המוכן לכל באר. מערבבים 50 מיקרוליטר של חרוזי פיצוי עם 50 מיקרוליטר מכל נוגדן מדולל בצינורות של 1.5 מיליליטר ודוגרים. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 300 גרם למשך חמש דקות. השעו מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של תמיסת צביעת זרימה כדי לשטוף את התאים. לאחר הכביסה והצנטריפוגה הסופית, השעו מחדש את התאים ב-110 מיקרוליטר של תמיסת צביעת זרימה לניתוח זרימה ציטומטרי. עבור ה-MODCs הטולרוגניים, החלף את קוקטייל הנוגדנים בקוקטייל פאנל הסובלנות. ביום התשיעי, העבירו את צלחת הפטרי של תאי T שהופשרו מחדש לתוך צינור של 50 מיליליטר ומלאו את הצינור בתמיסת צביעת זרימה. השתמש בצינור השני המכיל תא T לא מוכתם לניתוח טריג. סובב את הצינורות בחום של 250 גרם למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים במצע תרבית תאים חם. ספור את תא ה-T וודא שמתקבל מינימום של 4 מיליון תאים. צנטריפוגה את צלחת ה- MODC ב -300 גרם למשך חמש דקות. לאחר שאיבת הסופרנטנטים, הוסף 200 מיקרוליטר של תאי T לכל באר. הוסף תאי T לא מוכתמים עבור לוחות ניתוח טריג. הוסף 25 מיקרוליטר למיליליטר של קוקטייל נוגדנים נגד CD3/CD28 לכל הקבוצות למעט בארות בקרה שליליות כדי לעורר תאי T ולדגור עד היום ה-12. לאחר מכן, העבירו את כל מתלי התאים מלוח תרבית 96 הבאר לצלחת תחתית V עם תמיסת צביעת זרימה. שוטפים את התאים פעמיים ב -200 מיקרוליטר של תמיסת מכתים זרימה. הקצו כמה תאים לבקרות פיצוי. לאחר הכביסה השנייה, צנטריפוגה את הצלחת. לאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של נוגדן מעכב קושר קולטן FC מדולל לכל באר ודגרו. בסיום הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר מקוקטייל הנוגדנים המוכן של טריג פאנל לכל באר. לבקרות פיצוי, ערבבו 50 מיקרוליטר של תאי פיצוי לא מוכתמים עם 50 מיקרוליטר מכל נוגדן מוכתם. דגרו את בקרות הצלחת והפיצוי בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן שטפו בתמיסת מכתים זרימה לפני הצנטריפוגה. כעת צבעו את התאים בצבע Live/Dead Near-IR מדולל ב-HBSS ב-200 מיקרוליטר לבאר לפני הדגירה הקרה. שטפו וצנטריפוגה את הצלחת לפני הצביעה בעזרת Fox P3 וניתוח ציטומטרי זרימה. ביום הראשון, מונוציטים לא ממוינים היו בעיקר HLA-DR-מינוס עם CD14 מינוס קטן, בעוד שמונוציטים מובחנים ביום השביעי הראו את רוב התאים כ-HLA-DR-plus CD14 מינוס, CD1c-plus, CD141 פלוס. טיפול ברפמיצין עם ובלי ליפופוליסכריד, הפחית משמעותית את אוכלוסיות DC-SIGN-plus CD1c-plus ועיכב את הוויסות של סמני CD86 ו-CD40 שנצפו בטיפול LPS בלבד. אוכלוסיות התאים המווסתים של FOX P3-plus T גדלו כאשר MDCs היו בתרבית משותפת עם תאי T. אך לא נצפו הבדלים משמעותיים בין ארבע קבוצות הטיפול ב-MODC. התפשטות תאי T הופחתה הן באוכלוסיות תאי T CD4 פלוס והן באוכלוסיות CD8 פלוס לאחר תרבית משותפת עם MDOCs שטופלו בראפה. דגימות שטופלו באינטרלוקין-10 הגדילו משמעותית את ייצור האינטרלוקין-10 תוך 24 שעות. MDOCs שטופלו ב-Dex הגדילו משמעותית את ייצור האינטרלוקין-10, אך רק לאחר מנוחה של 72 שעות. טיפול מקדים בדקסמתזון הפחית את הייצור הממוצע של TNF אלפא לאחר טיפול LPS לאחר 24 שעות. עלייה משמעותית ב-PDL1-plus MDOCs נצפו בקבוצות שטופלו ב-Dex plus LPS ו-Rapa לאחר 72 שעות. דיכוי ביטוי CD86 נצפה מכל הקבוצות שטופלו באימונומודולטור הן ב-24 והן ב-72 שעות. MDOCs שטופלו על ידי אימונומודולטור לא הגדילו את התפשטות תאי ה-T של CD4 פלוס.