ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה של הפעלת תאים דנדריטיים באמצעות קומפלקסים חיסוניים

התחל עם תרחיף תאי גידול קבוע כימית.

הוסף ריכוז אופטימלי של אימונוגלובולין G קושר גידול שנקשר לאנטיגנים של פני תאי הגידול, ויוצר קומפלקסים חיסוניים או ICs.

העבירו את המעגלים המשולבים לצלחת תרבית המכילה תאים דנדריטיים דבוקים. דגירה.

התא הדנדריטי מזהה את ה-IC, מפנים אותו ומעבד אותו לשברי פפטיד.

השברים נטענים על מולקולות קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקריות מסוג II או MHC-II ומוצגים על פני התא, יחד עם המולקולה הקוסטימולטורית CD86.

הסר מדיה. הוסף מאגר דיסוציאציה של תאים ופיפטה במרץ כדי לנתק את התאים.

העבירו את התאים לצינור.

צנטריפוגה והשעיית התאים בתמיסה חוסמת כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות.

כיסוי עם קוקטייל נוגדנים עם תווית פלואורופור המכוון ל-MHC-II ו-CD86.

הוסיפו צבע קושר DNA ודגרו לזמן קצר כדי להכתים גרעיני תאים מתים.

באמצעות ציטומטריית זרימה, זהה את התאים החיים המבטאים במשותף MHC-II ו-CD86, המאשרים הפעלת תאים דנדריטיים בתיווך IC.

ראשית, יש לתקן את התאים ב-1.8% פרפורמלדהיד חוצץ למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. זרע את תרחיף התאים בכל באר של צלחת 96 בארות בצורת U. לאחר מכן, הוסף דילולים משתנים של נוגדנים קושרי גידול בכל באר. לאחר מכן, דגרו את התאים על הקרח למשך 15 עד 20 דקות.

לאחר הדגירה יש לשטוף את התאים עם 150 מיקרוליטר מי מלח עם פוספט, ואז צנטריפוגה ב -400 פעמים גרם למשך 5 עד 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, הוציאו את הסופרנטנט ושטפו את התאים פעמיים. ממיסים את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר FACS, המכיל נוגדן משני מצומד פלואורופור. לאחר מכן, דגרו את הצלחת על קרח למשך 15 עד 20 דקות.

לאחר 15 עד 20 דקות, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר FACS כדי לשטוף את התאים. צנטריפוגה את הצלחת ב -400 פעמים גרם למשך 5 עד 10 דקות. לשפוך את הסופרנטנט. לבצע זרימה ציטומטרית כדי לנתח את קשירת הגידול, ולקבוע את הריכוז המינימלי של אימונוגלובולין G הנדרש לציפוי התאים.

לאחר שהתאים מצופים בריכוז G מינימלי של אימונוגלובולין, הוסף את הקומפלקס החיסוני של הגידול המסומן ב-CFSE לתאים הדנדריטים שמקורם במונוציטים ביחס של 1:5. לאחר מכן, דגרו על התערובת למשך 12 עד 16 שעות למשך הלילה במדיום מלא. בצע ניתוח FACS של הפעלת התאים הדנדריטיים שמקורם במונוציטים.