זיהוי של תרופות בסביבה המימית באמצעות HPLC-ESI-Q-תוף-MS וחיסול של אריתרומיצין דרך צילום-Induced השפלה
1 באוגוסט 2018
אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שאינן ממוקדות באמצעות שעת הטיסה ספקטרומטר מסה כמו הכלי המושלם כדי לזהות תרופות במים. נדגים את היישום של הקרנת UV לחיסול שלהם. ניתוח מעורבים הקרנה, מתחם בידוד, זיהוי, דגמי קינטי של הפרופילים השפלה מודגם.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהגנה על הסביבה, כגון מודעות לאנטיביוטיקה בסביבה הימית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לזהות מזהמים פרמצבטיים בריכוזים נמוכים מאוד ולזהות אותם בו זמנית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תרופות והשפעת שפכים ומי נהרות, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון חומרי הדברה או חומרים דמויי הורמונים בסביבה המימית.
כדי להתחיל בהליך זה, אספו כליטר מים להכנת הדגימות. סנן את הדגימה מעל מסנן פס כחול כדי להסיר חלקיקי מסלול. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר מתנול למחסנית מיצוי הפאזה המוצקה כדי לאזן אותה.
המתן עד שהמתנול יעזוב את המחסנית, ולאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר מים טהורים במיוחד. לאחר שהמים עזבו את המחסנית, יש למרוח את המסנן ולהשתמש במשאבת דיאפרגמה, או בוואקום מתון אחר, כדי להגביר את מהירות הזרימה. אז ריכוז מוקדם הוא מאוד חשוב.
הקפד להשתמש במחסנית חילוץ פאזה מוצקה עם הפאזה המוצקה הנכונה. שוטפים את הדגימה בשלושה מיליליטר מים טהורים במיוחד. לאחר מכן השתמש בשלושה מיליליטר אתנול כדי לסלק את האנליטים מהסורבט של המחסנית.
בעזרת מאייד סיבובי יש לרכז ולייבש את האנליטים המנופחים. ממיסים את השאריות המתקבלות במיליליטר אחד של מים טהורים במיוחד. לאחר מכן, סנן את התמיסה דרך פילטר מזרק.
אחסן אותם בבקבוקון עד שהם מוכנים לבצע ניתוח לא ממוקד על ידי HPLC-ESI-QTOF-MS. כדי להתחיל בניסויי הקרנת UV, יש להמיס את התרכובת האנטיביוטית המעניינת במים אולטרה-טהורים כדי להגיע לריכוז סופי של 20 מיליגרם לליטר. העבר 750 מיליליטר מתמיסה זו לכור הפוטו-ריאקטור של ליטר אחד.
לאחר מכן, הוסף מערבל מגנטי והכניס מנורת UV של 15 וואט לכור. התחל לערבב ב -500 סל"ד. בעזרת תוספת טיפתית של חומצה הידרוכלורית או אמוניה, התאם את ה-pH לערך הרצוי.
השתמש במזרק כדי להעביר שני מיליליטר מתמיסת התגובה לבקבוקון זכוכית של שני מיליליטר. סמן את הבקבוקון הזה כמדגם בזמן אפס. לאחר מכן, הפעל את מנורת ה-UV והתחל לעקוב אחר הזמן שחלף.
צייר דגימה של שני מיליליטר כל 30 שניות במהלך חמש הדקות הראשונות. לאחר מכן, קחו דגימה כל 60 שניות למשך שארית הניסוי. אחסן את הבקבוקונים בארבע מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לניתוח.
כדי להתחיל LC MS, העבר את הבקבוקון לדגימה האוטומטית. הגדר את כל הפרמטרים הרלוונטיים כמפורט בטבלה הראשונה של פרוטוקול הטקסט, והתחל את המדידה. שימוש ב-MS ברזולוציה גבוהה וקו רוחב MS/MS הוא הטכניקה המבטיחה ביותר לניתוח לא ממוקד של תרופות במים.
לאחר מכן בצע ניתוח קינטי והתאמת עקומה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, דגימות מי נהר ומים טהורים במיוחד מנותחות כדי לזהות ולזהות מזהמים פרמצבטיים. לאחר מיצוי שלב מוצק, כל דגימת מי נהר נראית בצבע צהבהב או ירוק כהה, המעיד על נוכחות של חומרים המכילים כלורופיל.
דגימות מים אולטרה-טהורים נותרו צלולות, כצפוי. כרומטוגרמה של שיא בסיס עבור דגימות מי הנהר המייצגות הכילה יותר מ-25 פסגות, כל אחת משקפת תרכובת אחרת. חומרים אלה מזוהים לאחר מכן על ידי גזירת הנוסחאות המולקולריות והשוואתם לתקני הייחוס הזמינים.
השוואה זו חושפת את נוכחותן של מספר תרופות הנמצאות במים עיליים בגרמניה, כולל חוסם הבטא מטופרולול, משכך הכאבים קרבמזפין, כמו גם האנטיביוטיקה המקרוליד אריתרומיצין A, והנגזרת שלה אנדרואריתרומיצין A.UVC ניסויי הקרנה מבוצעים לאחר מכן בערכי pH שונים כדי לקבוע תנאי סילוק יעילים באמצעות אריתרומיצין כדוגמה. דיאגרמות זמן ריכוז מראות כי הפירוק המהיר ביותר מתרחש ב-pH 7, בעוד שהאיטי ביותר נראה ב-pH 3, מה שמצביע על כך שפירוק המושרה על ידי פוטו עבור אנטיביוטיקה זו צריך להתבצע ב-pH ניטרלי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו SESP-NMR arbitrip MS-OTUC על מנת לענות על שאלות נוספות כמו חמצון של degradates ו-tip-off ollization.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח תרופות בגופי מים מלאכותיים וסביבתיים וכיצד לחקור את החיסול המושרה על ידי הקרנת אור. אל תשכח שעבודה עם כימיקלים, תרופות ומי נהר או שפכים עלולה להיות מסוכנת ואמצעי זהירות, כגון ביגוד מגן אישי, ציוד חיצוני, ובמקרה של שפכים, יש לקחת חיסונים תמיד בזמן או לפני ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לניתוח לא מכוון (non-targeted analysis) של תרופות במים באמצעות ספקטרומטריית מסות מסוג זמן מעוף (time of flight mass spectrometry). הוא מדגיש את היישום של הקרנת UV לצורך סילוק מזהמים אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי הסביבה
- כימיה אנליטית
- ניתוח תרופתי
רקע
- מזהמים פרמצבטיים מהווים סיכון לסביבות מימיות.
- שיטות קיימות יכולות לזהות מזהמים אלו בריכוזים נמוכים.
- הבנת הפירוק של חומרים אלו חיונית להגנה על הסביבה.
- הקרה בעזרת UV נבחנת כשיטה לסילוק תרופות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לזיהוי תרופות במים.
- הערכת היעילות של הקרנת UV בפירוק תרכובות אלו.
- מתן תובנות לגבי ההשפעה הסביבתית של תרופות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות וסינון של מים.
- מיצוי פאזה מוצקה (Solid phase extraction) עבור ריכוז מוקדם של אנליטים.
- ניתוח לא מכוון (Non-targeted analysis) באמצעות HPLC-ESI-QTOF-MS.
- ניסויי הקרה ב-UV להערכת קינטיקה של פירוק.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של מספר תרופות בדגימות מי נהר.
- הפירוק המהיר ביותר של erythromycin נצפה ב-pH ניטרלי.
- נוכחות של כלורופיל זוהתה בדגימות מי נהר.
- השוואת נוסחאות מולקולריות עם סטנדרטים לרפרנס אישרה את הממצאים.
מסקנות
- הפרוטוקול מזהה ומכמת ביעילות מזהמים פרמצבטיים.
- הקרנה ב-UV היא שיטה יעילה לפירוק מזהמים אלו.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון מזהמים אחרים ושיטות פירוק נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת זיהוי של מזהמים תרופתיים בריכוזים נמוכים במטריצות סביבתיות מורכבות, ובכך תומכת בהערכת סיכונים סביבתיים בשלב מוקדם. באמצעות שילוב של סריקה לא-מכוונת (non-targeted screening) עם קינטיקה של פירוק, היא מספקת תובנות מנגנוניות לגבי עמידות המזהמים ומסייעת באופטימיזציה של טיפול בשפכים. הגישה מסייעת בתעדוף תרכובות להערכה טוקסיקולוגית נוספת ולבחינה רגולטורית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר זיהוי של תרכובות ביו-אקטיביות בדגימות סביבתיות, ובכך תומך בניסוח השערות לגבי פעילויות ביולוגיות בלתי מכוונות.
- ערך תפעולי: מספק זיהוי ברגישות גבוהה של חומרים הניתנים ליינון ללא צורך בבחירה מוקדמת של תרכובות, ובכך מרחיב את כיסוי המרחב הכימי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של ריכוז-זמן עבור תרכובות אם ותוצרי פירוק, המאפשרים מחקרי קשר מבנה-פעילות.
- ערך תפעולי: מספק תבניות פרגמנטציה של MS/MS הניתנות לשחזור, המקלות על זיהוי תרכובות בין מעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין נתוני חשיפה סביבתית לבין השפעות פרמקולוגיות פוטנציאליות, ובכך תומך בהפחתת סיכונים בהערכות של חשיפה לאתרים שאינם המטרה (off-target liability).
- ערך תפעולי: מבסס מודלים של קינטיקת פירוק המנבאים את זמן מחצית החיים של תרכובות תחת תנאי טיפול מדומים.
שילוב תהליכי עבודה ושרשראות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי מתן אפשרות לניטור סביבתי של תרכובים ביולוגיים פעילים, ובכך היא מספקת מידע לבחירת תרכובים מובילים (lead selection) ולאפיון בטיחות.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות בנוגע למזהמים סביבתיים כחלקיקים ביו-אקטיביים פוטנציאליים בסריקות פנוטיפיות.
- סריקה: מספקת הכנה סטנדרטית של דגימות ופלט אנליטי לזיהוי עקבי של תרכובות בין סדרות שונות.
- אנליזה: מספקת מדידות מסה ברזולוציה גבוהה וספקטרא של MS/MS המאפשרים זיהוי בטוח של תרכובות ובירור מבני.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני גורל סביבתי להערכות בטיחות פרה-קליניות על ידי כימות ריכוזים רלוונטיים לחשיפה.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה גמישה לניטור מחלקות כימיות מגוונות במערכות מים מעבר לתרופות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בזיהוי תכשירים פרמצבטיים בריכוזים נמוכים, ובכך מפחית את מספר התוצאות השליליות השגויות בניטור סביבתי.
- ערך תפעולי: מאפשר תהליכי עבודה סטנדרטיים עבור ריכוז מקדים, הפרדה וזיהוי, ובכך משפר את השחזוריות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לתיעדוף תרכובים לצורך חקירה מעמיקה יותר על בסיס ניתוח סיכונים, בהתבסס על פרופילי עמידות ופירוק.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בקבלת החלטות מבוססות נתונים לגבי קידום תרכובים על ידי זיהוי מוקדם של חומרים עמידים בסביבה.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות בפיתוח שיטות HPLC-MS ובטיפול בדגימות סביבתיות.
- תלוי בגישה למכשור Q-TOF-MS ובאופטימיזציה של מיצוי מוצק (solid phase extraction).
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לניסויי הקרנה ב-UV ולמידול קינטי.
- כולל התחשבות בהשפעות מטריצה בעת השוואת דגימות סביבתיות מורכבות לבקרי מים אולטרא-טהורים.
- מוגבל על ידי הצורך בתקני ייחוס כדי לאשר זהויות של תרכובות שהתגלו באמצעות התאמת MS/MS.
