Name: Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: למדו שיטה לגירוי פוטנציאלים סינפטיים באמצעות אור כחול בזחלי Drosophila. טכניקת Channelrhodopsin2 מציעה חלופה פשוטה ולא פולשנית למחקר פיזיולוגיה סינפטית במעבדות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים RO1GM-33205 ו MH-LC עד 067,284 גריפית על ידי מלגה לתואר ראשון באוניברסיטת ברנדייס בקיץ מחקר NJ הורנשטיין. ניסויים ראשוניים של טכניקה זו בוצעו בשלב המעבדה לביולוגיה ימית במסגרת מערכות עצביות 2008 ובקיץ התנהגות כמובן (NIMH מענק: R25 MH059472) ב וודס הול, מסצ&#39;וסטס.

חלק 1: טיפול בבעלי חיים וחוצה גנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור כטב&quot;מ-ChR2 ו-OK371 GAL4 קווי לטוס בבקבוקים נפרד המכיל התקשורת לטוס תקן 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בתולות OK371-GAL4 קווי לעוף הזכרים של כטב&quot;מים-ChR2 הקווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים הן זכרים ונקבות בבקבוקון המכיל התקשורת לטוס רגיל מעורבב עם 1 מ&quot;מ כל טרנס הרשתית (ATR). מזון ATR צריכה להיעשות על ידי הראשון קבוע ההיתוך התקשורת לטוס במיקרוגל למשך דקה 1 ~. לאחר מותך, להתקרר למשך כ 30 שניות עד דקה אחת ולאחר מכן להוסיף 100 μl של 100 mM ATR ב ETOH 100 מ&quot;ל 10% עבור כל התקשורת לעוף. צלוחיות מקום על הקרח, אז חנות באזור כהה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו להזדווג הזבובים להטיל את הביצים באזור חשוך בשעה 22-25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 3-4 ימים עד 3 instar הזחלים גלויים, בנקודה זו, תשליך זבובים בוגרים. </li></ol> חלק 2: הגדרת Rig <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף כל עין 10x לנתח היקף היצירה (במקרה שלנו, של Carl Zeiss Inc, www.zeiss.com, Thornwood, ניו יורק), אל מקור אור LED כחולות עם גוף הקירור (Thor מעבדות, www.thorlabs.com, ניוטון, NJ ). צרף בסיס מגנטי עם פירסום מהדק. כיסוי גוף הקירור עם מגן הארקה חשמלית כדי להפחית את הרעש החשמלי שנוצר על ידי מקור האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בסיס מגנטי עם מקור אור על שולחן אוויר של electrophysiology מעטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור מקור האור לשלוט מעגל ומתחברים מעגל בקרה למקור מתח חיצוני (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, קולורדו ספרינגס, CO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן 1-5 פולסים V לשלוט מעגל להפעיל אור כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם בסיס מגנטי מקור אור עד אלומת אור כחול הוא התמקד באזור להיות כבוש על ידי לנתיחה הזחל. </li></ol> חלק 3: Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Six פלייס 0.1 מ&quot;מ סיכות חרקים לתוך הרצפה של צלחת sylgard מרופד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 3 rd הזחלים instar מהתקשורת מזון ומקום לתוך כל צלחת פלסטיק-פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הזחלים עם מלח כדי להסיר את המזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום זחלים ב לנתח צלחת ליד סיכות משך ולהוסיף מלח לרמה ½. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט הזחלים, כך שאתה יכול לראות שני צינורות כסופים (קנה הנשימה) פועל על פני השטח הגבי של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס פין גדול ישירות לתוך הזנב בין צינורות לקנה הנשימה. החזק את הזחלים למטה במקום סיכה גדולה נוספת לתוך הראש שלה, להיות בטוח כדי למתוח את הגוף החוצה לאורכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן ליד הזנב, ולהמשיך אותו אורך הגוף. ודא טיפים של המספריים גדלים כדי לא בטעות לחתוך עצבים הגחון ו / או קיר שרירי הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ארבע סיכות על ארבע פינות של החיה עכשיו הבטן פתוחה. הגדר אותם לתוך התבשיל לנתח כדי פילה החי. הכנה פין לימד החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ומספריים, להסיר את האומץ של החיה, קנה הנשימה וגורמים שומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הכנה עם תמיסת מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את האונות הקדמיות (כפי שניתן לראות באיור) ו הגנגליון הגחון של הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרו מספריים, לחתוך בזהירות הגנגליון הגחון ממש מאחורי האונות הקדמיות. </li></ol> חלק 4: הקלטה שרירים וגירוי אור כחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודה 10-20 μω באמצעות אלקטרודה חולץ אלקטרוניים (סאטר מכשירים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את האלקטרודה משך עם 3M KCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מלא בעל אלקטרודה אלקטרודה אלקטרודה קצה לתמרן עם micromanipulator ליד הכנה הזחל תחת מיקרוסקופ לנתח על electrophysiology מעטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי שרירים 6 (M6) כל גוף במגזר הקיר (איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס אלקטרודה לתוך M6 ולצפות עבור hyperpolarization מהירה. מנוחה שרירים הפוטנציאלים הממברנה צריך להיות בכל מקום מ -30 mV ל -70 mV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את האור הכחול, כך הכנה גזור מרוכז קרן אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן 20-100 פעימות ms מתח לשלוט מעגל. בהדרגה להגדיל את מתח המסופק לשלוט מעגל. Watch עבור פוטנציאלים מעוררים צומת בתא השריר (איור 1 ב). </li></ol> נציג תוצאות: איור 1 א מראה סכימטי של הגדרת הקלטה הכנה נשלף. 1B איור מראה אופייני EJP עורר על ידי להבזקי האור קצר. משרעת EJP המוצג הוא סיכם משרעת משני הנוירונים המנוע ידוע כאחד innervate M6. לעוצמות אור תחתון בלבד מופעל יחידה מוטורית (מידע לא מוצג). <img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="איור 1" width="600" height="373" /> איור 1: סכמטית) כללי של המתקן הקלטה תאיים עם LED כחול. המוח (בר) מוסר לעכב פעילות קצבית ב הגנגליון הגחון (VG). ChR2 מתבטא הנוירונים המנוע באמצעות מערכת GAL4-כטב&quot;מ. ב) הקלטה תאיים מ שריר M6. 40 ms כחול להבזקי האור (ב 127 μW / מ&quot;מ 2) אמין לעורר פוטנציאלים סינפטיים גדול (כוכביות) ב M6.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

אין לנו שום ניגודי עניינים לחשוף.

צעדים קריטיים לערב גם את לנתיחה הראשוני של הכניסה לתאי שריר. אם עצבים נחתכים או שריר פגום במהלך הניתוח הראשוני קשה כדי להמשיך את שאר הניסוי. במהלך הניתוח, יש להיזהר מאוד זווית לנתח מספריים כלפי מעלה ככל האפשר במהלך חתך הגבי. במהלך השלב המכריע השני, נכנסים לתא השריר, יש לצפות hyperpolarization עבר ~ 30 mV. ערכים מעל -30 mV עולה כי האלקטרודה היא גם לא נכונה בתוך תא שריר או תא בריא.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>סיכות מינוטנס (Minutens Pins)</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>צלחת נתיחה</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מגבר תוך-תאי וראש-במה של Neuroprobe</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;מערכת לרכישת נתונים Powerlab 4/30&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מעורר צמיחה לדשא</td><td>טכנולוגיות דשא</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מחשב שולחני</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ לדיסקציה</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מצע גידול לזבובים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>all-trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; זבובים</td><td>מרכז המאגרים של בלומינגטון (Bloomington Stock Center)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; זבובים</td><td>מעבדה של פיאלה, מעבדה של גריפית'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעגל בקר LED</td><td>נבנה במעבדת Griffith</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;מורכב מ: &lt;br/&gt;1. Buck Puck של 200 mA&lt;br/&gt;2. נורית LED כחולה&lt;br/&gt;3. חוט מבודד&lt;br/&gt;4. לוחבדיקות למעגלים (bread board)&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>גוף קירור ל-LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>שולחן אוויר</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>כלוב פראדיי</td><td>נבנה במעבדת Griffith</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור Leica Leitz M</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודה</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת אלקטרודות</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>HL 3.1 תמיסת מלחים עם 0.8mM Ca2+</td><td></td><td></td><td>תכנים (mM):&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;: 0.8&lt;br/&gt; MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;סוכרוז:4:115&lt;br/&gt;NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;10 טרהלוז: 5 HEPES</td></tr><tr><td>כלי מיקרו-דיסקציה</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים synaptic בבית תסיסנית neuromuscular כלאיים

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

<em&gt; תסיסנית</em&gt; הכנה הזחל neuromuscular הוכיחה להיות כלי שימושי לחקר הפיזיולוגיה הסינפטי<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. נכון לעכשיו, רק את האמצעים לעורר junctional פוטנציאלים מעוררים (EJPs) בהכנה זו כרוכה בשימוש אלקטרודות יניקה. הן במחקר והן מעבדות ההוראה, התלמידים מתקשים לעיתים קרובות תמרונים וטיפול זה סוג של אלקטרודה מגרה. בעבודה הנוכחית, אנו מראים כיצד מרחוק לעורר פוטנציאלים סינפטיים ב NMJ הזחל ללא שימוש אלקטרודות יניקה. על ידי הבעת channelrhodopsin2 (ChR2)<sup&gt; 4,5,6</sup&gt; ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; מנוע הנוירונים באמצעות<em&gt; GAL4-כטב&quot;מ</em&gt; מערכת<sup&gt; 7</sup&gt;, וביצוע שינויים קלים לבוש electrophysiology בסיסיים, הצלחנו לעורר אמין EJPs עם פולסים של אור כחול. טכניקה זו יכולה להיות שימוש מסוים במעבדות הוראה הנוירופיזיולוגיה שם תלבושת תלמיד לתרגל זמן ומשאבים מוגבלים.

פרוצדורה זו משתמשת ערוץ תכלת המופעל אצות תא ספציפי כלי הביטוי הגנטי לעורר פוטנציאלים סינפטיים עם להבזקי האור בצומת neuromuscular (NMJ) ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחלים. טכניקה זו היא זולה וקלה לשימוש חלופה גירוי יניקה אלקטרודה ללימודי פיזיולוגיה הסינפטי מחקר ומעבדות הוראה.

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

ההכנה הנוירו-שרירית של זחלי ה-Drosophila הוכחה ככלי שימושי לחקר פיזיולוגיה סינפטית1,2,3. נכון להיום, האמצעי היחיד הזמין...

הליך זה מתחיל בגידול זבובים מסוג drosophila. זחלים בשלב ה-Third instar בעלי הגנוטיפ המתאים גודלים על מזון המכיל all trans retinol. כל זחל מקובע באמצעות סיכות בראשו ובזנבו.לאחר מכן פושט ה-FLA. המוח והעצבים האחוריים נחתכים כדי להפסיק את הפעילות המוטורית הקצבית. לאחר מכן, מקור אור ה-LED הכחול עם תיבת הבקרה מכוון וממוקד על הדגימה.לבסוף, השתמש באלקטרודה חדה כדי לדקור את שריר שש. לאחר מכן, העבר פולסי אור באמצעות מקור מתח. שלום, אני ניקולס מרסטיין מהמעבדה של ד"ר לסלי גריפית', המחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ברנדייס.שלום, אני סטפן פולבר, גם אני ממעבדת Griffith. היום נראה לכם את הפרוצדורה לעירור פוטנציאלים סינפטיים בהיעדר channel root absent two בצומת העצבי-שרירי של זחלי drosophila. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור פיזיולוגיה סינפטית ב-drosophila.אנו משתמשים בשיטה זו גם כדי ללמד סטודנטים פיזיולוגיה סינפטית ובמעבדות הוראה. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, תחזיקו זני זבובים של UAS channel redsin two ו-3 7, 1 gal four בבקבוקים נפרדים המכילים מצע גידול סטנדרטי לזבובים.אספו זבובים בתולים מ-3 7, 1 gal, ארבעה קווי זבובים וזכרים מערוץ UAS channel redsin. שני קווים. לאחר מכן, הכינו מצע מזון לזבובים המעורבב עם 1 mM all trans retinol או ATR. כדי לעשות זאת, המיסו מצע מזון רגיל לזבובים במיקרוגל למשך כדקה אחת.לאחר ההמסה, יש להמתין שתווך הצמיחה יתקרר למשך כ-30 עד 60 שניות, ולאחר מכן להוסיף 100 µL של a TR בריכוז 100 mM ב-100% ethanol עבור כל 10 mL של מצע מזון לזבובים. כאשר המבחנות המכילות את מצע ה-a TR מוכנות, יש להעביר את הזכרים והנקבות שנאספו לכל מבחנה. יש להניח את המבחנות במקום חשוך בטמפרטורה של 22 עד 25 °C כדי לאפשר לזבובים להזדווג ולהטיל ביצים; המתינו ארבעה עד חמישה ימים עד להופעת לרוקים בשלב instar השלישי.בשלב זה, ניתן להשליץ את הזבובים הבוגרים. כעת אנו מוכנים להמשיך בהקמת מערך האלקטרופיזיולוגיה. חברו כל עדשה של מיקרוסקופ דיסקציה למקור אור LED כחול עם גוף קירור.השתמשו במוט ובסרט להידוק בסיס מגנטי לעינית ולמקור אור LED. הניחו את הבסיס המגנטי על שולחן האוויר של מערכת האלקטרופיזיולוגיה. לאחר מכן, חברו את מקור האור למעגל בקרה, ואת מעגל הבקרה למקור מתח חיצוני.אנו משתמשים ביציאת המתח ממערכת רכישת נתוני אלקטרופיזיולוגיה מסוג PowerLab המיוצרת על ידי AD Instruments. לאחר החיבור למקור המתח, יש להעביר פולסים של 1 עד 5 וולט למעגל הבקרה כדי להפעיל את האור הכחול, ולאחר מכן יש לכוון את הבסיס המגנטי ואת מקור האור עד שקרן האור הכחול תהיה ממוקדת באזור שבו תבוצע נתיחת הזחלים. לאחר ביצוע הכיוונונים המתאימים, ניתן לעבור לשלב נתיחת הזחלים.כדי להתחיל בנתיחה, מקמים שישה סיכות במידה של 0.1 מילימטר לתחתית של צלחת המרופדת ב-sogar. מוציאים זחלים בשלב שלישי של star מהמצע המזון ומניחים אותם בכל צלחת פטרי מפלסטיק. שוטפים את הזחלים בתמיסת סליין כדי להסיר שאריות מזון הדבקות אליהם.לאחר מכן, הניחו את הזחלים בצלחת הניתוח בקרבת הנעצים שpulled ומלאו את הצלחת עד מחציתה בתמיסת סלין. כעת, כווןו את הזחלים כך שתוכלו לראות שני צינורות כסופים העוברים לאורך הגב של בעל החיים. צינורות כסופים אלו הם הטרכאה (trachea).החדירו סיכה גדולה ישירות לזנב, בין צינורות הנשימה (tracheal tubes). החזיקו את הזחלים כלפי מטה והחדירו סיכה גדולה שנייה לראשם. ודאו כי הגוף נמתח לאורכו בעת החדרת הסיכה.השתמש במספריים כדי לבצע חתך קטן ליד הזנב. המשך את החתך לאורך הגוף. וודא שקצות המספריים מורמים כדי למנוע פגיעה בעצבים הוונטרליים ו/או בשרירי דופן הגוף.מקם ארבעה סיכות בארבעת הפינות של בעלי החיים. כעת פתח את החלק המרכזי. תקע את הסיכות לתוך צלחת הנתיחה כדי להכין את בעל החיים כפילה.בנוסף, מקבעו את הדגימה כך שניתן יהיה להשתמש בפינצטה ובמספריים. הסירו את איברי העיכול של בעל החיים, את הקנה ואת גופי השומן. שטפו את הדגימה בתמיסת סלין.לאחר השטיפה, אתרו את האונות הפרונטליות ואת הגנגליון הוונטרלי של הדגימה באמצעות מספרי מיקרו. גזרו בזהירות דרך הגנגליון הוונטרלי, מיד מאחורי האונות הפרונטליות. עם השלמת הדיסקציה, המשיכו לגירוי באור כחול ולהקלטת שרירים.לביצוע רישום השריר, משוך אלקטרודה בעלת התנגדות של 10 עד 20 mega ohm. בעזרת מכשיר למשיכת אלקטרודות אלקטרוני, מלא את האלקטרודה שנמשחה ב-KCL בריכוז three molar. מקם את האלקטרודה המלאה במחזיק האלקטרודות.כעת הניחו את תכשיר הזחלים תחת מיקרוסקופ דיסקציה על גבי המתקן. כווננו את האור הכחול כך שתכשיר הדיסקציה יהיה ממורכז בקרן האור. זהו את שריר 6 או M6 בכל מקטע של דופן הגוף של הזחל; בעזרת מיקרו-מניפולטור, הכניסו בזהירות אלקטרודה לתוך M6 ועקבו אחר היפר-פולריזציה מהירה של השריר.פוטנציאלי ממברנה במצב מנוחה צריכים להיות בטווח שבין 30- ל-70- millivolts. לאחר שהאלקטרודה הוחדרה כראוי, יש להעביר פולסי מתח של 20 עד 100 millisecond למעגל הבקרה. העלה באופן הדרגתי את המתח המסופק למעגל הבקרה.חפשו פוטנציאלי צומת מעוררים בתא השריר. להלן תוצאה מייצגת המראה פוטנציאל צומת מעורר שנוצר על ידי פולסי אור קצרים. אמפליטודת פוטנציאל הצומת המעורר המוצגת כאן היא סכום האמפליטודות של שני נוירונים מוטוריים ששניהם ידועים ככאלה המפעילים את התא.M six. עוצמות נמוכות יותר או משכי אור קצרים יותר עשויים לחשוף את פוטנציאל הצומת המעורר בעל האמפליטודה הקטנה יותר מנוירון מוטורי בודד. הרגע הדגמנו כיצד לבצע סטימולציה של פוטנציאלים סינפטיים בצומת העצבי-שרירי של ה-oph באמצעות channel road absent two.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע מפגיעה בדופן הגוף של הדגימה במהלך הניתוח. כמו כן, חשוב לזכור שלמרות שהדגימה עשויה להיות במצב של גירוי-יתר מיד לאחר הניתוח, היא תירגע עם הזמן ותאפשר הקלטות תקינות. בעת דקירת השרירים, יש להיזהר לא לחדור מתחת לשכבת השרירים הראשונה אל תוך דופן הגוף.כאשר האלקטרודה שלכם תקועה בדופן הגוף, תוכלו לעיתים לקבל פוטנציאלים בהיפר-פולריזציה (hyperpolarized potentials) למרות שאינכם נמצאים בפועל בתוך תא שריר. זהו ההסבר לכך.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

channelrhodopsin2-mediated-stimulation-synaptic-potentials-at

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

סרטון זה מדגים את הטכניקה להקלטת זרמים סינפטיים מבוטון סינפטי בצומת העצבית-שרירית של זחל דרוזופילה. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפעילות של בוטון סינפטי יחיד, החשוב לחקר קווי זבובים מוטנטיים בעלי פעילות סינפטית ספונטנית או אסינכרונית מוגברת.

הקלטת זרמים סינפטיים בצומת הנוירומוסקולרית של זחל דרוזופילה

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא...

הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים בתנועה

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

מאמר זה כולל שיטה לבדוק את החיבורים monosynaptic בין נוירונים בהחלת טטרודוטוקסין וערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac.

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .

צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin

מיפוי מעגל בסיוע (CRACM) הוא טכניקה מדויקת עבור מיפוי פונקציונלי של הקרנות נוירואליות ארוכת טווח בין קבוצות מבחינה אנטומית ו/או גנטית מזוהה של נוירונים. כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש CRACM כדי למפות את הקשרים שמיעתי גזע המוח, כולל השימוש של opsin העביר אדום, ChrimsonR.

מתקשר לטווח ארוך-מיפוי מעגל בסיוע של היפוקולוס נוירונים בצבע כחול ואדום הוזז

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

פרוטוקול זה מעריך פעילות סינפטית פונקציונלית בין שותפים נוירונליים מוגדרים במערכת העצבים המרכזית של זחלי דרוזופילה מלנגסטר באמצעות כלים מקודדים גנטית. גירוי אופטוגנטי בתיווך CsChrimson של נוירונים סנסוריים פרה-סינפטיים cIVda מעורר פוטוקונברנסציה תלויה בסידן של CaMPARI באינטרנוירונים פוסט-סינפטיים של Basin-4.

אפיון פונקציונלי של שותפים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית של זחל הדרוזופילה באמצעות CaMPARI

למדו שיטה לגירוי פוטנציאלים סינפטיים באמצעות אור כחול בזחלי Drosophila. טכניקת Channelrhodopsin2 מציעה חלופה פשוטה ולא פולשנית למחקר פיזיולוגיה סינפטית במעבדות.

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

גלה סרטונים נוספים