Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

הליך זה מתחיל בגידול דרוזופילה. שלישית, רימות כוכב עם הגנוטיפ המתאים על מזון המכיל את כל הטראנס רטינול. כל רימה מוצמדת החוצה ראש וזנב.

ואז FLA שטוח. לאחר מכן חותכים את המוח והעצבים האחוריים כדי לעצור את הפעילות המוטורית הקצבית. לאחר מכן, מקור אור ה-LED הכחול עם תיבת הבקרה מותאם ומתמקד בהכנה.

לבסוף, השתמש באלקטרודה חדה כדי לפגוע בשריר שש. לאחר מכן ספק פולסי אור עם מקור מתח. היי, אני ניקולס מרשטיין מהמעבדה של ד"ר לסלי גריפית', המחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ברנדייס.

היי, אני סטפן פולבר, גם הוא ממעבדת גריפית'. היום נראה לך נוהל לעורר פוטנציאלים סינפטיים עם שורש ערוץ נעדר שניים בצומת העצבי-שרירי של זחל דרוזופילה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור פיזיולוגיה סינפטית ודרוזופילה.

אנו משתמשים בו גם כדי ללמד תלמידים פיזיולוגיה סינפטית ומעבדות הוראה. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל עם פרוטוקול זה, שמור על ערוץ UAS redsin שניים ובסדר, 3 7, 1 גל ארבעה קווי זבוב בבקבוקים נפרדים המכילים מדיה זבובים סטנדרטית.

אסוף בתולות מה, בסדר, 3 7, 1 גל, ארבעה קווי זבוב וזכרים מתעלת הכטב"מים רדסין. שתי שורות. לאחר מכן, הכינו מדיה זבובה מעורבבת עם מילימול אחד, כל הטראנס רטינול או TR.To עשו זאת להמיס מדיה זבובה רגילה במיקרוגל למשך כדקה אחת.

לאחר ההמסה, הניחו למדיה להתקרר במשך כ-30 עד 60 שניות, ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי ל-TR ב-100% אתנול לכל 10 מיליליטר של מדיה זבובה. כאשר הבקבוקונים המכילים מצע TR מוכנים, הכניסו את הזכרים והנקבות שנאספו לכל בקבוקון. הניחו את הבקבוקונים באזור חשוך בטמפרטורה של 22 עד 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לזבובים להזדווג ולהטיל ביצים, המתינו ארבעה עד חמישה ימים עד שנראה זחל כוכב שלישי.

בשלב זה תוכלו להיפטר מהזבובים הבוגרים. כעת אנו מוכנים להמשיך עם הקמת מתקן האלקטרופיזיולוגיה. חבר כל עינית היקף ניתוח למקור אור LED כחול עם גוף קירור.

השתמש בעמוד וב-clamp כדי לחבר בסיס מגנטי לעינית ולמקור אור LED. הנח את הבסיס המגנטי על שולחן האוויר של מתקן האלקטרופיזיולוגיה. לאחר מכן, חבר את מקור האור למעגל בקרה, ולאחר מכן חבר את מעגל הבקרה למקור מתח חיצוני.

אנו משתמשים בפלט המתח ממערכת רכישת הנתונים האלקטרופיזיולוגיים של מעבדת החשמל שנעשתה על ידי מכשירי פרסום. לאחר החיבור למקור המתח, תן פולסים של אחד עד חמישה וולט למעגל הבקרה על מנת להפעיל את האור הכחול, כוונן את הבסיס המגנטי ואת מקור האור עד שאלומת האור הכחול תתמקד באזור שיתפוס על ידי דיסקציה של הזחל. לאחר ביצוע ההתאמות המתאימות, אנו מוכנים לעבור לדיסקציה של הזחל.

כדי להתחיל בדיסקציה, הניחו שישה סיכות של 0.1 מילימטר ברצפת צלחת מרופדת בסוגאר. הסר שליש בזחלי כוכב מאמצעי המזון והניח אותו בכל צלחת פטרי מפלסטיק. שטפו את הזחלים במי מלח כדי להסיר כל מזון שמחובר לזחלים.

לאחר מכן הניחו את הזחלים בכלי החיתוך ליד הסיכות המשוכות ומילאו את המנה בחצי הדרך במי מלח. כעת כוונו את הזחלים כך שתוכלו לראות שני צינורות כסופים העוברים לאורך פני הגב של החיה. צינורות כסופים אלה הם קנה הנשימה.

הכנס סיכה גדולה ישירות לזנב בין צינורות קנה הנשימה. החזיקו את הזחלים למטה והניחו סיכה גדולה שנייה לראשו. הקפד למתוח את הגוף לאורכו בזמן הכנסת הסיכה.

השתמש במספריים כדי לבצע חתך קטן ליד הזנב. המשך את החתך לאורך הגוף. וודאו כי קצות המספריים מורמים כדי למנוע חיתוך של עצבי הגחון ו/או שרירי דופן הגוף.

הניחו ארבע סיכות על ארבע פינות החיות. עכשיו פתח את החלק האמצעי. הכניסו את הסיכות לכלי החיתוך כדי פילט את החיה.

הצמידו גם את התכשיר כך שהוא יילמד באמצעות מלקחיים ומספריים. הסר את החיה, איברי העיכול, קנה הנשימה וגופי השומן. שוטפים את התכשיר במי מלח.

לאחר השטיפה, אתר את האונות הקדמיות ואת הגנגליון הגחוני של ההכנה באמצעות מספריים מיקרו. חותכים בזהירות את הגנגליון הגחוני ממש מאחורי האונות הקדמיות. לאחר השלמת הדיסקציה, המשך בגירוי האור הכחול והקלטת השרירים.

כדי לבצע את הקלטת השרירים, משוך אלקטרודת התנגדות של 10 עד 20 מגה אוהם. בעזרת מושך אלקטרודות אלקטרוני, מלאו את האלקטרודה הנמשכת בשלוש KCL טוחנות. הנח את האלקטרודה המלאה במחזיק האלקטרודה.

כעת הניחו את הכנת הזחל מתחת למיקרוסקופ מנתח על האסדה. כוונן את האור הכחול כך שההכנה המנותחת תהיה מרוכזת בקרן האור. זהה את שריר 6 או M 6 בכל קטע דופן גוף של הזחל באמצעות מניפולטור מיקרו, הכנס בזהירות אלקטרודה ל-M 6 וצפה בשריר היפרפולריזציה מהירה.

פוטנציאל הממברנה במנוחה צריך להיות בכל מקום בין 30 מילי-וולט שלילי ל-70 מילי-וולט שלילי. לאחר שהאלקטרודה מוכנסת כהלכה, תן פולסי מתח של 20 עד 100 אלפיות השנייה למעגל הבקרה. הגדל בהדרגה את המתח המסופק למעגל הבקרה.

שימו לב לפוטנציאלים של צומת אקסי בתא השריר. הנה תוצאה מייצגת המציגה פוטנציאל צומת אקסי המעורר על ידי פולסי אור קצרים. משרעת פוטנציאל צומת האקסי המוצגת כאן היא המשרעת המסוכמת משני נוירונים מוטוריים ששניהם ידועים כאוכלים.

מ שש. עוצמות נמוכות יותר או משכי אור קצרים יותר יכולים לחשוף את פוטנציאל הצומת המעורר של המשרעת הקטנה יותר מנוירון מוטורי יחיד. זה עתה הראינו לך כיצד לבצע כביש ערוץ בהיעדר שני גירויים מתווכים של פוטנציאלים סינפטיים בצומת העצבי-שרירי של OPH.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לא לפגוע בדופן הגוף של ההכנה במהלך הדיסקציה. חשוב גם לזכור שלמרות שהכנה עשויה להיות נרגשת יתר על המידה רק לאחר נתיחה, היא תירגע עם הזמן ותאפשר הקלטות טובות. בעת החדרת שרירים, היזהר לא לרדת מתחת לשכבת השרירים הראשונה לתוך דופן הגוף.

כאשר האלקטרודה שלך תקועה בדופן הגוף. לפעמים אתה יכול להשיג פוטנציאלים היפר-פולריים אבל לא להיות בפועל בתא שריר. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.