מיקרוסקופ אור גיליונות עבור ויזואליזציה תלת מימדי של תאים חיסוניים אנושי

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד בדיוק תאי חיסון מתנהגים בהקשר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, כמו כיצד לחפש תאי מטרה ביעילות בסביבה תלת מימדית. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא יצירת יריעת אור דקה מאוד כדי להאיר רק את מישור המוקד מבלי להשפיע על תאי המישור החיצוני. זה מאפשר מהירות רכישה מהירה מאוד עם הפחתה בולטת של הלבנה ופוטוציטוטוקסיות.

שידגים את ההליך הזה יהיה ד"ר רנפינג ז'או, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים, העבירו 400 מיקרוליטר של תמיסת מלאי קולגן צוננת לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר. הוסף לאט לאט 50 מיקרוליטר PBS 10X צונן.

לאחר מכן מערבבים את התמיסה על ידי הטיה עדינה של הצינור. הוסף 48 מיקרוליטר של 0.1 נתרן הידרוקסיד מולרי לתמיסת הקולגן כדי להתאים את ה-pH ל-7.2 עד 7.6. השתמש ברצועות בדיקת pH כדי לקבוע את ערך ה-pH של התערובת.

הוסף שני מיקרוליטר של מים מזוקקים סטריליים כדי להביא את הנפח הסופי ל-500 מיקרוליטר. מערבבים היטב ומאחסנים את תמיסת הקולגן על קרח או על ארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לאחר תיוג פלואורסצנטי של תאים חיים על פי פרוטוקול הטקסט, מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים, העבירו פעם אחת 10 עד התאים השישיים לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הצינור ב -200 פעמים גרם למשך שמונה דקות. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט והשתמשו ב -200 מיקרוליטר של מדיום תרבית כדי להשעות מחדש את הגלולה. מוסיפים 85.9 מיקרוליטר מתמיסת הקולגן המנוטרלת לתרחיף התאים ומערבבים כראוי כדי להגיע לריכוז קולגן של 2.5 מיליגרם למיליליטר.

השאירו את תערובת קולגן התאים על קרח במכסה המנוע. לאחר מכן, הכנס בוכנה לנימים התואמים עד שהבוכנה בולטת מילימטר אחד מהנימים. לאחר מכן הרטיבו את הבוכנה על ידי טבילה במדיום תרבותי.

דילוג על שלב זה עלול לגרום להחדרה לא רצויה של בועות אוויר בין הבוכנה למטריצת הקולגן. טבלו את הנימים בתערובת הקולגן של התאים ומשכו לאט את הבוכנה לאחור 10 עד 20 מילימטרים. לאחר מכן עם בקבוק ריסוס של 70% אתנול, הרטיבו מגבת נייר והשתמשו בה כדי לנגב את הקיר החיצוני של הנימים כדי להסיר את תמיסת הקולגן שנותרה.

כעת השתמש בחימר דוגמנות כדי להרכיב את הנימים לדופן הפנימית של צינור של חמישה מיליליטר. דחף את תערובת הקולגן של התאים לקצה הנימים. לאחר מכן דגרו את הצינור עם הנימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שעה אחת כדי לפלמר את הקולגן.

לאחר הדגירה, הוסף לצינור מיליליטר עד שניים של מדיום תרבית. לאחר מכן הוציאו בזהירות את מוט הקולגן הפולימרי החוצה לתוך המדיום עד שכמחצית מהקולגן תלוי במדיום. דגרו על הנימים למשך 30 דקות נוספות.

לביצוע מיקרוסקופיה של גיליון קל, הרכיבו את תא הדגימה על פי הוראות היצרן. לאחר הפעלת המיקרוסקופ והחממה אם מבצעים הדמיה חיה, הנח את הנימים בתא הדגימה, אתר את הדגימה ומצא את אזור העניין לרכישת תמונה. הפעל את הלייזרים המתאימים.

לאחר מכן הגדר את עוצמת הלייזר וזמן החשיפה. הגדר גם את גודל הצעד של מחסנית Z, את מיקומי ההתחלה והסיום של מחסנית Z ואת מרווח הזמן להדמיית תאים חיים. לאחר מכן התחל ברכישת התמונה.

העבירו מיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS לתוך צינור של חמישה מיליליטר מתחת למכסה המנוע הכימי. לאחר מכן טבלו את הנימים עם הקולגן הפולימרי בתמיסת הפרפורמלדהיד והשתמשו בחימר דוגמנות כדי להרכיב את הנימים על הדופן הפנימית של הצינור. לחץ בעדינות על הבוכנה עד שמחצית ממוט הקולגן תלוי בתמיסת הפרפורמלדהיד.

לאחר מכן משוך את הבוכנה לאחור כדי להחזיר את מוט הקולגן לנימים. הסר את הנימים מהצינור והשליך את הפרפורמלדהיד. הרכיבו את הנימים לצינור טרי והוסיפו מיליליטר אחד של PBS.

ודא שהנימים שקועים ב-PBS. לחצו בעדינות על הבוכנה עד שמחצית ממוט הקולגן תלוי בתמיסה ודגרו במשך חמש דקות. משוך לאחור את הבוכנה כדי להרים את מוט הקולגן בנימים.

לאחר מכן החלף את ה-PBS ב-PBS טרי והוציא את מוט הקולגן לתמיסה. לאחר הכביסה השלישית, הוסף מיליליטר אחד עד שניים של מאגר חדירות חוסם לתוך הצינור. הוצא את מוט הקולגן לתמיסה ודגר את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות.

החלף את מאגר החדירות החוסם ב-200 עד 500 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים במאגר חדירות חוסם ודגר את מוט הקולגן השקוע בתמיסה למשך שעה. לאחר השימוש ב-PBST לשטיפת מוט הקולגן שלוש פעמים, דגרו את המוט בנוגדנים משניים בחסימת מאגר חדירות בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שלוש שטיפות נוספות ב-PBS, משוך את מוט הקולגן בחזרה לתוך הנימים ושמור את הדגימה ב-PBS עד להדמיה.

כפי שניתן לראות בסרט זה, במהלך הנדידה תאי CTL שהועברו עם חלבון היתוך אקטין EGFP יצרו בליטות גדולות בצורת לימון, מוקפות במבנים עדינים דמויי ציר. המסלולים של CTLs מומחשים כאן עם מהירות והתמדה או התזוזה חלקי אורך המסלול הכולל כפרמטרים הנמדדים. המהירויות נעות בין 0.01 ל-0.19 מיקרון לשנייה עם הבדל של כמעט פי 20 וההתמדה נעה בין אפס ל-0.7.

איור זה מציג תאי CTL קבועים בג'ל קולגן תלת מימדי צבוע לפרפורין-1 אנדוגני ואקטין. הדגימה הוארה מצד אחד או משני הצדדים. ממצבי Z שונים, התאים מוכתמים באופן שווה ומעידים על חדירה טובה של נוגדנים לג'ל הקולגן.

CTL קבוע הראה את אותה מורפולוגיה כמו תאים חיים, מה שמצביע על כך שהמורפולוגיה נשמרת היטב עם פרוטוקול זה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור להימנע מבועות אוויר ולהתאים את ערך ה-pH כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעת תאים חיים עם מולקולות משטח מסוימות כדי לענות על שאלות נוספות כמו כיצד לתאם התנהגות תאים עם התמיינות או עם תת-סוגים שונים של תאים או לחקור אינטראקציה בין תאים וגורל התא.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא, אימונולוגיה וחקר הסרטן לחקור את התנהגות התא, גורל התא, התמיינות ואינטראקציה בין תאים במערכת הרלוונטית ביותר מבחינה פיזיולוגית במבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין דגימות עם תאים המשובצים במטריצת קולגן תלת מימדית, כיצד לדמיין דגימות באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור, חי או קבוע, וכיצד לעקוב אחר נדידת תאים בתלת מימד.