מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מוטגנזה שעתוק כגון אילו יחידות משנה של RNA פולימראז או תהליכים ביולוגיים שולטים בנאמנות השעתוק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת מדידה של שגיאות שעתוק אנדוגניות בתעתיקים של אורגניזמים אוקריוטיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בפרוטוקול זה יתקשו בגלל האורך והמורכבות של הבדיקה והצורך בביואינפורמטיקה מתקדמת על מנת לפרש את הנתונים.

כדי להתחיל בפרוטוקול, הקיפו את שברי ה-RNA על ידי דנטורציה בחום של 20 מיקרוליטר מהדגימה שהוכנה קודם לכן ב-65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, הניחו מיד את הדגימה על קרח למשך שתי דקות. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיקרוליטר של 10x T4 RNA ligase buffer, ארבעה מיקרוליטר של 10 מילי-מולר ATP, מיקרוליטר אחד של מעכב RNase, מיקרוליטר אחד של מים ללא נוקלאז ושמונה מיקרוליטר של 50% פוליאתילן גליקול, או PEG.

לאחר מכן מערבבים היטב את הדגימה על ידי מערבולת. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של 10 יחידות למיקרוליטר של T4 RNA ligase אחד. מערבבים שוב את הדגימה על ידי פיפטינג ומדגרים אותה בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים בתרמוסייקלר כאשר טמפרטורת המכסה מוגדרת על 30 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה של שעתיים, הוסף לדגימה 10 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ונקה את הדגימה עם ערכת ניקוי וריכוז אוליגו. יש להוציא את הדגימה ב-20 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. כדי לתמלל לאחור את מולקולות ה-RNA המעגליות, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של 10 מילי-מולר dNTPs, ארבעה מיקרוליטרים של 50 ננוגרם לכל מיקרוליטר הקסמרים אקראיים, ותשעה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז לתשעה מיקרוליטרים של RNA.

מערבבים היטב על ידי פיפטינג ומנטרלים את הדגימה ב-65 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. לאחר דנטורציה של הדגימה, הניחו אותה על קרח למשך שתי דקות. הוסף לדגימה שמונה מיקרוליטר של מאגר סינתזת גדיל ראשון פי 5, שני מיקרוליטר של 0.1 מילי-מולר DTT, וארבעה מיקרוליטר של 200 יחידות למיקרוליטר טרנסקריפטאז הפוך וערבב על ידי פיפטינג.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כשהמכסה מוגדר בחמש מעלות צלזיוס גבוה מטמפרטורת הדגירה. לאחר מכן דגרו את הדגימה למשך 20 דקות בחום של 42 מעלות צלזיוס כשהמכסה מוגדר על 47 מעלות צלזיוס. יש להוציא את הדגימה ב-42 מיקרוליטר של תמיסת פליטה לאחר הניקוי עם ערכת הניקוי והריכוז.

השתמש בערכת סינתזת הגדיל השני כדי ליצור ספריית cDNA דו-גדילית. הניחו את הדגימות על קרח והוסיפו 30 מיקרוליטר של מי NF ל-38 מיקרוליטר מהדגימה שלכם. לאחר מכן, הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של מאגר גדיל שני פי 10 וארבעה מיקרוליטרים של אנזים גדיל שני וערבבו את הדגימה על ידי פיפטינג עדין לפני הדגירה ב-16 מעלות צלזיוס למשך שעתיים וחצי.

נקו את הדגימות עם ערכת הניקוי והריכוז של האוליגו לתגובות של 100 מיקרוליטר והשליכו את הדגימות ב-38 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. מערבבים את תגובת תיקון הקצה על ידי פיפטינג ודוגרים אותה בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. עקוב אחר הדגירה של 20 מעלות צלזיוס עם דגירה של 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס.

ראשית, יש לדלל את המתאמים לריצוף הדור הבא פי עשרה ב-10 מילי-מולר טריס HCl לריכוז סופי של 1.5 מיקרו-מולר. לאחר מכן הוסף 2.5 מיקרוליטר של מתאם מדולל ומיקרוליטר אחד של משפר קשירה לכל דגימה וערבב אותם על ידי מערבולת. לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטר של תערובת מאסטר TA ליגאז בוטה.

פיפטו את הדגימה למעלה ולמטה כדי לערבב ולדגור אותה בחום של 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסף שלושה מיקרוליטרים של אנזים ריאגנט כריתה ספציפי לאורציל ודגר את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר השלמת הקשירה, הוסף לדגימה 13.5 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לנפח כולל של 100 מיקרוליטר והמשך לבחירת הגודל.

אקלום חרוזים מגנטיים לטמפרטורת החדר. הוסף 30 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מתואמים ותלויים לכל דגימה וערבב על ידי פיפטינג. העבירו את הדגימה לצינור של 1.5 מיליליטר ודגרו אותה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

הניחו את הדגימה על מעמד מגנטי למשך חמש דקות כדי להפריד את החרוזים מהסופרנטנט. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר והשליכו את החרוזים המגנטיים. הוסף אליקוט טרי של 15 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים לכל דגימה.

מערבבים היטב על ידי פיפטינג ודוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את הדגימות על מתלה מגנטי ודגרו אותן במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר בזהירות והשליך את הסופרנטנטים, והקפד לא להפריע לחרוזים.

הוסף 200 מיקרוליטר של 80% אתנול טרי שהוכן לכל אחת מהדגימות מבלי להפריע לחרוזים המגנטיים הגלולים ודגירה למשך 30 שניות. לאחר מכן, הסר לחלוטין כל זכר לאתנול מהדגימות וייבש את החרוזים באוויר למשך חמש דקות, אך היזהר לא לייבש יתר על המידה את החרוזים. כדי להוציא את הדגימות מהחרוזים, הסר את הצינורות מהמעמד המגנטי.

הוסף 19 מיקרוליטר של 10 מילי-מולר טריס HCl. פיפט את התערובת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להשהות מחדש את החרוזים ולדגור את הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הניחו את הדגימות בחזרה על המעמד המגנטי ודגרו אותן למשך חמש דקות כדי להפריד את החרוזים מהסופרנטנט.

הסר בזהירות 15 מיקרוליטר של הסופרנטנט המכיל את ספריות ה-cDNA המטוהרות שנבחרו בגודל מהצינורות והעביר אותו לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. הוסף חמישה מיקרוליטר של פריימר אוניברסלי וחמישה מיקרוליטר של פריימר אינדקס ייחודי לכל ספריית cDNA מטוהרת וערבב אותם היטב על ידי פיפטינג. בדוק בזהירות את תערובת המאסטר פולימראז לאיתור גבישים ומשקעים אחרים וחמם את תערובת המאסטר ביד עד שהמשקעים נמסים.

הוסף לדגימה 25 מיקרוליטר מתערובת המאסטר פולימראז. מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג ופועלים לפי תנאי הרכיבה המפורטים בפרוטוקול הטקסט הנלווה להגברת ה-PCR. נקה את הספריות הסופיות על ידי הוספת 45 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים תלויים ישירות לתגובת ה-PCR.

מערבבים אותם על ידי פיפטינג ודוגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. העבירו את הדגימה לצינור של 1.5 מיליליטר והניחו אותה במעמד מגנטי למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, יש להשליך את הסופרנטנט ולשטוף אותו פעמיים עם אתנול 80% טרי שהוכן למשך 30 שניות.

לאחר הכביסה השנייה, הסר לחלוטין את האתנול מהדגימה וייבש באוויר את כדור החרוזים למשך חמש דקות. לאחר מכן יש לשטוף אותו ב-35 מיקרוליטר של 0.1x TE. השעו מחדש את החרוזים על ידי פיפטינג שלהם ודגרו אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר שהשפופרת הייתה על המעמד המגנטי במשך חמש דקות, העבירו 30 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר.

אחסן את הספריות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר בידוד ה-RNA, שני שיאי rRNA נפרדים נראים באלקטרופורטוגרמה. פיצול של ה-RNA יביא ל-50 עד 70 מקטעי RNA של זוגות בסיסים.

שעתוק הפוך של מעגל מתגלגל שימש ליצירת מולקולות cDNA המורכבות מלפחות שלוש חזרות טנדם של תבניות ה-RNA המעגליות. בחירת גודל עם חרוזים מגנטיים מאפשרת לטהר ספריות בגודל המתאים. מידע רצף של ספריית C-seq בודדת מראה שרוב החזרות נוטות להיות באורך של 45 עד 80 בסיסים.

כ-50% מהבסיסים שרוצפו הם חלק מהחזרות הללו. מכיוון שרוב הבסיסים הללו קיימים בקצבים המכילים שלוש חזרות או יותר, מספר הבסיסים הייחודיים המרוצפים הוא כשליש מהמספר הכולל של הבסיסים המרוצפים. לאחר ששולטים בה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים-שלושה אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור תמיד על סביבת עבודה סטרילית, נקייה מ-RNAs שעלולים להפריע לעבודה שלך. כמו כן, חשוב לעקוב בקפידה אחר כל שלב כדי להבטיח שלא נעשות טעויות במהלך ההליך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד שגיאות תמלול באיקריוטים באמצעות מבחן C-seq.