ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

שיטה זו יכולה לסייע בהבנת שאלות חשובות בתחום תאי הבטא. כגון הפונקציה הטרוגנית IT בין תאי בטא בודדים בתוך אי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הרזולוציה המרחבית והזמנית המסופקת על ידי הדמיה חיה של תאי הבטא.

אנו יכולים ללכוד את תנודות הסידן בתוך תאי בטא בודדים. לאחר המתת חסד של דג על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו אותו לצלחת פטרי המכילה תמיסת HBSS עם סידן ומגנזיום. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו המצויד במנורת פלואורסצנטי וקוביית פילטר אדומה, השתמש במלקחיים חדים כדי לחתוך את העור מהפה לסנפיר פי הטבעת.

קלף את העור החתוך בצד ימין כדי לחשוף את הבטן, שתחשוף את האיברים הפנימיים. לאחר מכן באמצעות הקרינה האדומה כדי לזהות ביטוי mKO2 בתאי בטא, אתר את האיים. נקה את האי הראשוני על ידי הסרה זהירה של הרקמה שמסביב, כגון כבד ותאדיפוציטים.

נקוט באמצעי זהירות כדי לא לפצוע או לתקוע את האי. לאחר מכן פיפטה טיפה של 30 מיקרוליטר של HBSS על מרכז צלחת עם תחתית זכוכית. ואז העבירו את האי המנותח לטיפה.

עם HBSS, שטפו בזהירות את האי פעם אחת ואז השתמשו ב-30 מיקרוליטר של תמיסת עבודה פיברינוגן כדי לשטוף אותו פעם אחת. הימנע מייבוש האי במהלך שלבי הכביסה שעלול לגרום למוות של תאים. הוסיפו לאט ובעדינות 10 מיקרוליטר של 10 יחידות למיליליטר תמיסת תרומבין לאי.

השאירו את האי ואת המנה ללא מגע למשך 15 עד 20 דקות. שימו לב כי טיפת תרומבין הפיברינוגן תהפוך לצמיגה ויציבה. יש לתת מספיק זמן כדי שהתרומבין יתפלמר בתמיסת הפיברינוגן.

אחרת התבנית לא תספק יציבות במהלך סשן ההדמיה. כדי לבצע הדמיה חיה ex vivo של פלואורסצנטי GCaMP, הוסף 200 מיקרוליטר של HBSS על גבי התבנית והנח בזהירות את המנה על מחזיק הצלחת של המיקרוסקופ הקונפוקלי. לאחר מכן עם מטרת שגיאה 20X 0.8 NA ואפשרות השדה הבהיר, אתר את האי.

שימוש במסנן לפלואורסצנטיות אדומה כדי להציג את הקרינה הגרעינית mKO2 בתאי בטא מתמקד באי. גרעינים בודדים צריכים להיות גלויים בבירור. אתר מישור הדמיה ברור על ידי תנועה ידנית בעובי האי לאורך ציר ה-Z שלו.

ודא שמישור ההדמיה מכיל 50 עד 100 תאי בטא להדמיה והבהירות של הקרינה הגרעינית mKO2 אחידה, במיוחד במרכז האי. לאחר מכן בתפריט ההגדרות החכמות, הגדר רכישה רציפה עבור פלואורסצנטי GCaMP6 ו-mKO2 באמצעות ההגדרות הבאות. עבור GCaMP6 בחר עירור של 488 ננומטר ופליטה משוערת של 500 עד 555 ננומטר.

תחת צבע כוזב בחר GFP. עבור mKO2 בחר עירור של 561 ננומטר ופליטה של 570 עד 630 ננומטר. עבור הצבע השגוי בחר mCherry.

במצב רכישה, קבעו את רזולוציית התמונה ל- 1, 024 על 1, 024 פיקסלים, את המהירות ל- 10 ואת הממוצע ל- 1. התחל הקלטה רציפה על ידי בחירה באפשרות עבור סדרת זמן והגדרת משך הזמן ל-500 מחזורים עם זמן רכישה של כשתי שניות לכל פריים. עקוב אחר מחזור ההדמיה.

לאחר 50 הפריימים הראשונים מבלי להפריע לרכישת התמונה, פיפטה בעדינות חמישה מיקרוליטרים של תמיסת D-גלוקוז של 200 מילי-מולרית על גבי הג'ל המחזיק את האי. לאחר מכן רכוש 150 פריימים בגלוקוז של 10 מילימולרי. 50 המסגרות הראשונות של סדרת הזמן תואמות לפעילות תאי בטא בגלוקוז של חמישה מילי-מולריות.

זוהי הפעילות הבסיסית. תא בטא מגיב יראה שעווה ודעיכה של הקרינה הירוקה עם הזמן. ב-200 פריימים, הגדל את ריכוז הגלוקוז ל-20 מילי-מולרי על ידי הוספה עדינה של 10 מיקרוליטר של 200 מילי-מולרי D-גלוקוז.

לאחר מכן רכוש 150 פריימים בריכוז של 20 מילי-מולרי. כדי לפתוח את קובץ התמונה ב-FIJI, בחר תוסף, ארגז כלים של LSM, הצג ארגז כלים של LSM. בארגז הכלים של LSM לחץ על פתח LSM ובחר את קובץ התמונה.

תחת כלים בתפריט ניתוח, פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה. עם כלי בחירת המצולע הממוקם בסרגל הכלים, צייר ידנית את ההחזר על ההשקעה. צייר את ה-ROI בערוץ האדום כך שיכסה שטח גדול יותר מגרעין כדי לכלול חלק מהציטופלזמה של התא.

ודא שמיקום ההחזר על ההשקעה עקבי בין מסגרות והתאם את המיקום במידת הצורך. הוסף את החזר ה-ROI שנבחר למנהל ה-ROI על ידי לחיצה על כפתור הוסף. בחר והוסף מספר החזר ROI כדי להשיג נתונים על תאים מרובים.

לאחר מכן, מתפריט Analyze, בחר Set Measurements. לאחר מכן בחר צפיפות משולבת לציון מיצוי של עוצמת הקרינה הכוללת באזור. עברו לערוץ הירוק המכיל את הקרינה GCaMP ובמנהל ההחזר על ההשקעה בחרו Multi Measure.

זה יספק את מדידות העוצמה עבור התאים לאורך סדרת הזמן. שמור את פלט פיג'י כקובץ טקסט מופרד בפסיקים. מארגז הכלים של LSM, השג את חותמות הזמן של מסגרות התמונה.

השתמש בהחלת חותמות, החל חותמות t, שם קובץ, Dump לקובץ טקסט, כדי להשיג את חותמות הזמן. שמור את חותמות הזמן באמצעות האפשרות שמור בשם או העתק אותן לגיליון האלקטרוני. לאחר עריכת ערכי העוצמה עבור כל התאים, בצע את הניתוח תא אחד בכל פעם או באופן אוטומטי.

עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים. בניסוי זה, תאי בטא בודדים של איים ראשוניים מקו טרנסגני של 45 DPF המבטאים mKO2 ו-GCaMP6 גרעיני במיוחד בתאי בטא, עוררו עם רמפת גלוקוז ולאחר מכן דה-פולריזציה עם אשלגן כלורי. פעילות התאים נותחה.

באמצעות FIJI ותוכנת ניתוח נתונים, עוצמת הקרינה GCaMP6 של תאי בטא בודדים חולצה ונורמלה. כפי שניתן לראות מעקבות אלה של עוצמת הקרינה, תאי בטא בודדים מציגים תנודות בפלואורסצנטיות GCaMP6 כאשר הם מגורים עם גלוקוז, ותוספת של אשלגן כלורי מייצבת את הקרינה. הטכניקה מספקת רזולוציה תאית של תגובת הגלוקוז של תאי הבטא וחלון לפונקציונליות שלהם.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 45 דקות אם היא נעשית כהלכה. בעת ביצוע הליך זה חשוב לוודא את כדאיות תאי הבטא. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מניפולציות גנטיות, כדי להבין את תפקידם של גנים ספציפיים על תפקוד תאי בטא.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את תגובת הגלוקוז בתוך תאי בטא בודדים.