הערכה של נדידת תאי גזע סרטני באמצעות מכשירי microfluidic מידור והדמית תא חייה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבדוק ולאפיין חזותית את נדידת התאים הסרטניים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. זה מושג על ידי ניתוק ראשון של תאי גזע של גידולי מוח הגדלים במדיום נטול סרום. השלב השני הוא לייצר מאסטר SU שמונה דו-שכבתי ושימוש בתבנית ליתוגרפיה רכה חותמת A-P-D-M-S בעלת עיצוב מידור.

לאחר מכן, הרכיבו את המכשיר המיקרופלואידי וטענו אותו בתאי גזע של גידול במוח. לבסוף, הדמיה ארוכת טווח של נדידת תאי גזע של גידול מוח מתבצעת באמצעות מערכת מיקרוסקופית הכל-באחד. בסופו של דבר, התוצאות מראות שתאי גזע של גידול מוח מציגים רצף מסתובב של שלבים מורפולוגיים במהלך נדידתם דרך חלל אולטרה-מצומצם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני מסות קיימות כמו Transwell Boyton Chamber, הוא שמכשיר מיקרו מאפשר בדיקה ויזואלית של תהליך הנדידה, מיקום מבוקר של תאים והעברה מדויקת של גורמים. לכן, לטכנולוגיית מיקרו פוריק יש תכונות של בחירה וניווט של תא יחיד אמין, יעיל וחסכוני. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בגרורות סרטניות והישנות מכיוון שניתוח תאים בודדים של תאים נודדים מאוד עשוי לזהות מטרות כימותרפיות פוטנציאליות עתידיות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התנהגות הנדידה של מערכת הסרטן, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון התפתחות עוברית, תגובות חיסוניות, ריפוי פצעים והתחדשות איברים. החל מהשעיית התאים של חניתות נוירוס שמקורן ב-BTSC. אסוף את התאים בצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותם ב-900 סל"ד למשך חמש דקות, אך לא מהר יותר.

שאפו את הסופר נאטין. לאחר מכן אפשר לנוירוספרות להשתחרר על ידי דגירה שלהן ב-0.5 מיליליטר של אקוטן טרום חם למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, יש לשבש מכנית את התאים עם 10 עד 20 משיכות עדינות של פיפטה P 100.

לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיליליטר של מדיום תאי גזע כדי לנטרל את צנטריפוגת האקוטן, תרחיף התאים ב-1300 סל"ד למשך חמש דקות והשעיה מחדש של התאים במיליליטר אחד של מדיום תאי גזע. בדוק את צפיפות התאים בעזרת ציטומטר המו והתאם את הצפיפות ל -20, 000 תאים למיקרוליטר. כדי להתחיל בייצור ה-SU 8 master, הכינו שתי מסכות צילום באמצעות Adobe Illustrator והדפסת לייזר של סרט שקיפות עם Image Setter משולב.

מסכת הצילום בשכבה הראשונה מורכבת משני סמנים פידוציאליים ומערך של ערוצי מיקרו, והשכבה השנייה של מסכת הצילום כוללת את תאי הישיבה והקבלה. נקו את שתי שכבות המסכה עם איזופרופנול והניחו להן להתייבש באוויר. כעת ציפוי ספין פרוסת ידית עם התנגדות צילום SU שמונה בעובי שלושה מיקרון, ואחריה אפייה רכה.

לאחר מכן, עם מסכת הצילום של השכבה הראשונה במגע קרוב עם UV, חשפו את התמונה, התנגדו ואפשרו לה להתרפא. לאחר האפייה ופיתוח הוופל הנרפא. מכסים את אזורי הסמן הנאמנות של פרוסת הידית בסקוטש.

לאחר מכן סובב את הוופל בהתנגדות צילום בעובי 250 מיקרון. לאחר מכן, קלף את הסרט כדי לחשוף את הסמנים למטרת יישור. הנח את השכבה השנייה של התנגדות הצילום ויישר את הסמנים הנאמנים.

לאחר מכן UV חושפים ומרפאים את מסכת הצילום של השכבה השנייה ואחריה לאחר אפייה ופיתוח. כעת השתמש ב-SU 8 master באמצעות שקיעת אדים כדי להפחית את דביקות פני השטח. מניחים את הוופלים לתוך חומר ייבוש עם כמה טיפות של תמיסת Tri Chloro cline תחת ואקום למשך שעה לפחות.

לאחר מכן המאסטר יהיה מוכן לשימוש כדי לעצב PDMS עם המאסטר. התחל בערבוב יסודי של בסיס הפולימר המקדים עם ריפוי ביחס של 10 לאחד. לאחר מכן מניחים את התערובת בחומר ייבוש להסרת גז בוואקום עד שלא נראית בועת אוויר.

יוצקים את התערובת על המסכה ודגים שוב. אם מכניסים בועות אוויר חדשות, יש לרפא את התבנית על פלטה חמה ישרה למשך שעתיים בחום של 90 מעלות צלזיוס. לאחר שהוא מתקרר לטמפרטורת החדר, שחרר בעדינות את חותמת ה-PDMS.

לפיכך, תעלות התרבות חרוטות ב-PDMS ומוכנות להרכבה של המכשיר המיקרופלואידי. המאסטר ניתן לשימוש חוזר ליציקה עד שהוא נסדק או נשחק. כאשר המאסטר הופך לדביק, ניתן למרוח מחדש את ציפוי האנטי סטיק.

התחל ביצירת כניסות ויציאות במכשיר המיקרופלואידית דרך חותמת ה-PDMS. בעזרת ניקוב חור ביופסיה, נקו את חותמת ה-PDMS על ידי השרייתו באתנול 70% למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטפו אותו במים נטולי יונים למשך 10 דקות. לעקר ולהשלים את תגובות הקישורים הצולבות של חותמת ה-PDMS באמצעות חיטוי.

כעת הניחו את חותמת ה- PDMS על פתק כיסוי זכוכית מצופה פולי L ליזין. לאחר מכן המכשיר מצופה בלמינציה על ידי מילוי התאים בתמיסת למינציה דרך כניסות המאגר ומודגר למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו את הלמינציה מהמכשיר.

לאחר מכן שטפו את המכשיר על ידי הצפתו פעמיים במדיום תאי גזע. כעת טען 11 מיקרוליטר של תאים מנותקים לאחד ממאגרי הזריעה במידת הצורך, השתמש בשאיבת ואקום כדי לאלץ את התאים לתא. לאחר מכן טען שבעה מיקרוליטרים נוספים של תאים למאגר הישיבה הסמוך.

לאחר חמש דקות, מאגרי הישיבה והקבלה יוצפו במדיה. כעת הניחו יריעת PDMS סטרילית בעובי של 0.5 עד מילימטר אחד על המכשיר. הידבקות פני השטח הטבעית של PDMS עם עצמה תאטום את המכשיר לאחר האיטום, הוא מוכן להובלה, דגירה והדמיה מיקרוסקופית.

אזנו מראש את הביוט, IM על ידי הפעלתו למשך 45 דקות. כדי לייצב את הטמפרטורה, הלחות ואספקת האוויר שלו, הוסף מספר צלחות מים לתא הדגימה כדי להשיג את הלחות המתאימה. טען את המכשיר המוכן בתא הדגימה של המיקרוסקופ.

מרכז את המכשיר באמצעות פינצטה מיקרו. כעת הגדר את נקודות המיקום ונקודות הזמן של המיקוד באמצעות תוכנת Biot והתחל את הקלטות ה-time lapse במידת הצורך. לאחר חמישה ימים בתרבות, החלף את אמצעי התרבות.

ה-BTCs שנזרעו במכשיר נרשמו ברציפות על ידי תמונת פאזה. במשך חמישה ימים בתא הישיבה, תאים בצורת ציר נשארו בשלב שלפני הנדידה. כשהם התקרבו לכניסה למיקרו-ערוץ, כמה תאים התרחבו ויצרו בליטות דבק.

רק תא אחד הצליח לכבוש את הכניסה ולחקור את כיוון הנדידה. לאחר שהתא קבע את כיוון הנדידה, הוא המשיך לשייט דרך כל המיקרו-ערוץ במהירות גבוהה וקבועה. בסוף המיקרו-ערוץ, התא המשיך לחקור את החלל הפתוח של תא הקבלה לפני שנכנס אליו לבסוף.

על ידי התבוננות בתאים במרווחי הדמיה של שתי שניות, נראה כי כוח הנדידה נוצר בעיקר על ידי פעילות בלאבינג הדומה לזו של תאי OID. בזמן ניסיון ההליך, חשוב לזכור שעיצוב המכשיר כל כך גמיש שניתן לתפעל את מידות המיקרו-ערוצים כדי להשיג מידה רצויה של נדידת תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מכשיר מיקרופלואידית מידור ייחודי המתאים לתרבית התאים המעניינים שלך, ולאחר מכן לבצע הדמיית זמן לטווח ארוך כדי להגדיר באופן איכותי וכמותי את מאפייני הנדידה של תאים אלה בעקבות הליך זה.

ניתן ליישם שיטות אחרות כמו ריצוף הדור הבא או מיקרו-מערך DNA על מנת לענות על שאלות נוספות כגון עד כמה שונים גנטית תאי הסרטן הנודדים מאוד.