כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

קינורנינים קשורים לוויסות תגובה חיסונית במספר מחלות, כולל סרטן. שיטות אמינות ומאומתות לזיהוי קינורנינים מרובים מסייעות בפיתוח טיפולים יעילים יותר. הפרוטוקול שלנו משתמש בכרומטוגרפיה נוזלית יחד עם ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את מטבוליטים הטריפטופן השונים הנוצרים על ידי מסלול הקינורנין במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים.

משתמשים לא מנוסים עשויים להיתקל בקושי מסוים במהלך הכנת המדגם או שלבי רכישת הנתונים והפרשנות. על ידי ביצוע הפרוטוקול וההמלצות שלנו, ניתן להימנע מטעויות ולקבל נתונים אמינים. להכנת תמיסות מלאי של הריאגנטים, שקלו 0.3 מיליגרם מכל מגיב בבקבוקון לדיוק הגבוה ביותר והמיסו כל מגיב ב-300 מיקרוליטר של הממס המתאים כדי לקבל תמיסות מלאי של גרם אחד לליטר של כל מגיב.

להכנת מדיום תרבית שטופל בפחם, שקלו 280 מיליגרם של פחם פעיל בצינור חרוטי והוסיפו חמישה מיליליטר מהמדיום הנוזלי שהוכן לתרבית התאים המעניינים. נענע את הצינור עם המדיום והפחם על נדנדה נדנדה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ו -50 תנודות לדקה. בתום הדגירה, משקעים את הפחם על ידי צנטריפוגה ואוספים בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לפחם, ואז מסננים את המדיום באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר.

כדי להכין את תמיסת הכיול, יש להעלות את מדיום התרבית המטופל בפחם עם 0.75 מיקרוליטר של 0.1 גרם לליטר תמיסת 3NT ולהוסיף 3-H kynurenine, 3-HAA kynurenine וחומצה קסנטורנית לשישה ריכוזים שונים לפחות כדי לכסות את כל טווחי הכיול לנפח סופי של 150 מיקרוליטר לדגימה. לאחר המערבולת, הוסף 150 מיקרוליטר של מינוס 20 מעלות צלזיוס מתנול קר בתוספת חומצה פורמית 1% לכל צינור לדה-פרוטאיניזציה של הדגימה ומכסה היטב ומערבל שוב את הצינורות. לאחר דגירה של 40 דקות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס, צנטריפוגה את הדגימות והשתמש בפיפטה אוטומטית כדי להעביר 270 מיקרוליטר מכל סופרנטנט לבקבוקוני זכוכית תחתונים שטוחים בודדים.

הכניסו את הבקבוקונים למאייד והשתמשו בתוכנית המתאימה לשברי מתנול מים כדי לאדות בעדינות את הרכיבים הנדיפים למשך כ-30 דקות. כאשר הצינורות יבשים, הרכיבו מחדש כל דגימה ב-60 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית במים ומערבלו את הדגימות לפני העברת כל תמיסה לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר לצנטריפוגה. מבלי להפריע למשקעים, העבירו את הסופרנטנטים לבקבוקונים כרומטוגרפיים עם תוספות זכוכית חרוטית והניחו את הבקבוקונים לתוך דגימה אוטומטית LC-MS.

לפני הפעלת הדגימות, נקה את מערכת ה-LC עם השלב הנייד כדי להסיר בועות ולטשטש את כל ערוצי הממס. לאחר מכן, שטפו את המגן והעמודה האנליטית ב-100% אצטוניטריל למשך כ-30 דקות לפני שטיפת המערכת ב-100% ממס A עד שנצפה לחץ יציב בעמודה, ולאחר מכן הגדירו את פרמטרי ה-LC המתאימים בתוכנת רכישת הנתונים ובנו רשימת עבודה להפעלת הדגימות במערכת LC. כדי לבנות את עקומת הכיול, בתוכנת רכישת הנתונים, הוסף את תקני הכיול לרשימת העבודה והפעל את התקנים במשולשות, ולאחר מכן שלב ומדוד את שטח השיא המתאים ל-3-הידרוקסיקינורנין, קינורנין, חומצה 3-הידרוקסיאנטרנילית, 3-ניטרוטירוזין וחומצה קסנטורנית בזמן שמירה של כ-4.4, 10, 16, 21 ו-30 דקות בהתאמה.

כדי לאסוף דגימות סופרנטנט מתרבית תאים במבחנה, לאחר 48 שעות של תרבית תאים סטנדרטית של התאים המעניינים, העבירו 500 מיקרוליטר של סופרנטנט מכל באר לצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר והסירו את פסולת התא על ידי צנטריפוגה, ואז העבירו את הסופרנטנטים הבינוניים לצינורות חדשים לאחסון של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח ושמרו על כדורי התא במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לניתוח הערכת החלבון. כדי להכין דגימות לניתוח LC-MS, העבירו 149.25 מיקרוליטר מכל דגימת מדיום תרבית מופשרת לצינור חדש של 1.5 מיקרוליטר והוסיפו 0.75 מיקרוליטר של 0.1 גרם לליטר תמיסת 3NT לכל צינור. לאחר הכנת הדגימות כפי שהודגם, הוסף 150 מיקרוליטר של מינוס 20 מעלות צלזיוס מתנול בתוספת 1% חומצה פורמית לכל צינור והכן את הדגימה לניתוח LC-MS כפי שהודגם.

לאחר השלמת רשימת העבודה, מדוד את שטח השיא של כל אנליט והשתמש במשוואת כיול ליניארית בודדת המוקדשת לכל אנליט כדי לחשב את ריכוזי האנליטים הקיימים בכל דגימת ניסוי. כדי להעריך את תכולת החלבון התאי המתאימה לדגימת מדיום התרבית, השעו מחדש כל כדור תא ב-100 מיקרוליטר PBS והקפיאו את הדגימות במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה לפני הפשרתן על קרח. לאחר הקפאת הדגימות שלוש פעמים, אספו את הליזאטים של התאים על ידי צנטריפוגה והעבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים מבלי להפריע לכדורים.

יש לדלל את הדגימה 10 פעמים עם PBS טרי ולהוסיף את הכמויות המתאימות של תמיסה סטנדרטית של אלבומין בסרום בקר בשכפול לבארות המתאימות של צלחת של 96 בארות. טען 10 עד 15 מיקרוליטר מכל דגימת ליזאט תא לבארות המתאימות של צלחת 96 הבארות ומלא הן את בארות הסטנדרט והן את בארות הדגימה לנפח סופי של 50 מיקרוליטר PBS לבאר. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מגיב ברדפורד מדולל חמש פעמים במים טהורים במיוחד לכל באר ודגרו את הצלחת לפחות חמש דקות בטמפרטורת החדר.

בתום הדגירה, טען את הצלחת על קורא מיקרופלייט ומדוד את הספיגה ב-595 ננומטר, ולאחר מכן בנה עקומת כיול כדי לאפשר חישוב של כמות החלבון בכל דגימה וחלקו את הריכוז של כל קינורנין בתכולת החלבון הכוללת כדי לנרמל את כמות הקינורנין בכל דגימה למיקרוגרם אחד של חלבון. להלן תוצאות ספקטרומטריית מסה מרובעת בודדת שהתקבלו במהלך ניתוח מדיום המכיל 4.5 גרם לליטר D-גלוקוז וסרום בקר עוברי של 10%. שימו לב לשיא הקטן המצביע על נוכחות של קינורנין בתוך הדגימה.

הפעל דגימת בקרת איכות לפני שתזדקק לנתוני הדגימה בפועל כדי לאשר את זמני השמירה המתאימים של האנליטים שכן ניתן להבחין בשינוי באותות LC או אי התאמות. רכיבי מטריצה משותפים יכולים ליצור יונים עם יחס המטען הראשי שנבחר עבור אנליטי היעד. לדוגמא, בניתוח זה, השיא מהתרכובת הלא ידועה הופיע בתקופת הסריקה שבמהלכה נוטר יון יחס המטען הראשי 206.

בשל חוסר ההתאמה של זמן השמירה, האות לא תאם את האנליט. למרות שאיזוטופ הטריפטופן חלק את אותו יון כמו יחס המטען הראשי 206, ניתוח כרומטוגרפי גילה כי אות הטריפטופן הופרד היטב מהאות של חומצה קסנטורנית, מה שמצביע על כך שרמת הטריפטופן הקיימת במדיום התא הסרטני שנבדק לא השפיעה על כימות חומצה קסנטורנית. ניתוח זה של מדיום התרבית משני סוגים של קווי תאים סרטניים מדגים כי תאי סרטן השד האפיתל האנושיים שהוערכו שחררו כמויות שונות של מטבוליטים של טריפטופן, בעוד שתאי סרטן השחלות האנושיים שנבדקו ייצרו רמות גבוהות משמעותית של קינורנין.

שימוש בתקן פנימי במהלך הכנת המדגם מסייע ברכישת נתונים אמינה. נורמליזציה של הנתונים לתכולת החלבון מתקנת את השונות במספר התאים בתוך בארות בודדות. ניתן להרחיב את הפרוטוקול שלנו עוד יותר כדי לקבוע אנליטים נוספים, אך עשויים להצטבר במדיום התרבית בתנאי ניסוי שונים.