Name: מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: למדו פרוטוקול לבדיקת אינטראקציות ליגנד-רצפטור ב-HEK-293T באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת מדידה מהירה של אינטראקציות הידבקות חלבוניות בנוירוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות הנפש (R00MH103531 ו- R01MH116901 ל- J.A.), מענק הכשרה מוקדמת מהמכון הלאומי לרפואה כללית (T32GM007635 ל- S.R.), ומלגת לידה היל גיליאם למחקר מתקדם (GT11021 ל- S.R.). אנו מודים לד"ר קווין וולפרי על העזרה במיקרוסקופ, ד"ר K אולריך באייר על השימוש במיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי שלו, ותומס סודהוף (אוניברסיטת סטנפורד) על פלסמיד LRRTM2.

1. תרבות תאים ו transfection
<ol><li>הפוך את המדיה הסלולרית HEK עם DMEM, 1x (שינוי של Dulbecco של הנשר בינוני) בתוספת 4.5 גרם / L גלוקוז, L-גלוטמין & נתרן פירובט ו 10% FBS. מסנן סטרילי.</li>
	<li>קבוע מראש ליגנדים מתאימים קולטנים לבדיקת צבירה. הערה: Neurexin3α SS4+/- ואחד הליגנדים הידועים שלה, LRRTM2, שימשו במחקר זה. ליגנדים קולטנים של עניין באו לידי ביטוי cDNAs ב pcDNA3.1. הרכבת גיבסון שימשה להכנסת Neurexin3α לתוך pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: טטאקטטאגקטגטגGGCGCGCGTCCGCCAקטגCTCTCTC / גאגג'גקטגאגאטקטאקאטקטקטקטגTTCCTT.</li>
	<li>הכן תאי HEK293T.<ol>
<li>לגדל תאי HEK293T לעיסוק בבקבוק T-75 אחד.</li>
		<li>לאחר המפגש, להשתמש 2 מ"ל של טריפסין ומניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות. הוסף 6 מ"ל של מדיה HEK לבקבוק כדי resuspend תאים ולהעביר את כל 8 מ"ל לצינור חרוט 15 מ"ל.</li>
		<li>גלולה ב 500 x g במשך 5 דקות ו resuspend במדיה סלולרית HEK עבור סך של 8 מ"ל.</li>
		<li>לספור תאים ולהוסיף 735,000 תאים לתוך כל באר של צלחת 6-well. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 2 מ"ל עבור כל באר באמצעות מדיית תא HEK.</li>
		<li>מניחים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים לגדול בן לילה או עד שהם מגיעים 50-60% מפגש.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfect HEK293T תאים באמצעות שיטת סידן פוספט13.<ol>
<li>להחליק היטב 1 עם 3 מיקרוגרם של החלבון של עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- ו 1 מיקרוגרם של mCherry).</li>
		<li>תעביר היטב 2 כמו בשלב 1.4.1. אבל עם חלבון מוטציה של עניין (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>חוצה היטב-3 עם 3 מיקרוגרם של ligand של עניין co-transfect עם 1 מיקרוגרם של חלבון פלואורסצנטי אחר (3 מיקרוגרם של pcDNA3.1 LRRTM2 ו 1 מיקרוגרם של GFP).</li>
		<li>להחדיר גם-4 ו- well-5 לשמש פקדים שליליים: גם 4 עם 1 מיקרוגרם של GFP ו well-5 עם 1 מיקרוגרם של mCherry.</li>
		<li>הכן צלחת נוספת (כמו בשלב 1.4.1-1.4.4) אם נדרשים תנאים או פקדים נוספים (Neurexin3αWT/A687T SS4+). הערה: יעילות Transfection מנותחת 24 שעות לאחר transfection תחת מיקרוסקופ epifluorescence ו כימות כמו מספר התאים המבטאים את החלבון פלואורסצנטי הם היו transfected עם. גישה יעילה יותר תכלול את ההשתנות של תאי HEK עם קידוד וקטורי דו-יסטרי לחלבון פלואורסצנטי ואת הליגנד של עניין ומומלץ מאוד מעל שינוי-תיקון. במקרה של מחקר זה, אלפא Neurexins הם ~ 4.3 kb ועוצמת פלואורסצנטיות נמוכה נצפתה באמצעות מערכת bicistronic המחייבת שיתוף transfection.</li>
	</ol></li>
	<li>48 שעות לאחר טרנס-פליטה, תאי קציר לצבירה.<ol>
<li>לשטוף כל באר פעמיים עם PBS.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של EDTA 10 מ"מ ב PBS לתוך כל באר בעדינות לנתק אינטראקציות תא לתא צלחת דגירה ב 37 °C (70 °F) במשך 5 דקות. הערה: טריפסין אינו מומלץ לשלב 1.5.2 עקב מחשוף פרוטאוליטי פוטנציאלי של מולקולות הידבקות במחקר. בנוסף, לאחר הוספת EDTA ייתכן שהפרוטוקול לא יופסק עד להשלמתו מכיוון שהתאים ייחשפו כעת לתנאי הסביבה.</li>
		<li>הקישו בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים, וקצרו כל באר לצינורות חרוטים נפרדים של 15 מ"ל.</li>
		<li>צינורות חרוט צנטריפוגה ב 500 x גרם וטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	</ol></li>
	<li>בעוד תאים הם pelleting, להכין 6 צינורות דגירה על ידי תיוג החלק העליון של כל צינור microcentrifuge עם כל מצב. הערה: יש להשתמש בכל תמורות של תנאי GFP ו- mCherry כדי להקיף את כל התנאים הניסיוניים והבקרות המתאימות. לדוגמה: 1. GFP/mצ'רי, 2.mצ'רי/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-–mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- – mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-- mCherry/LRRTM2 – GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- – mשרי / LRRTM2 - GFP. הפוך צינורות נוספים כדי להתאים תנאים נוספים ובקרות.</li>
	<li>הסר את התאים supernatant ו resuspend ב 500 μL של מדיה HEK עם 10 mM CaCl2 ו 10 mM MgCl2 מחומם ל 37 °C (69 °F). הערה: התוספת של CaCl2 ו- MgCl2 מאפשרת למולקולות הידבקות להקים מחדש את הכריכה ונדרשת רק אם שותפי האינטראקציה הטרנס-תאית המדוברים דורשים ציות דו-תאי להדבקה.</li>
	<li>לספור את התאים בכל צינור חרוט 15 מ"ל באמצעות hemocytometer ו aliquot 200,000 תאים של כל תנאי לתוך הצינור המתאים משלב 1.6.1 עבור 1:1 לערבב בנפח כולל של 500 μL. הערה: זה צריך לקחת רק 5 דקות לכל תנאי לספור כמויות aliquot.</li>
	<li>דגירה צינורות בטמפרטורת החדר במסובב צינור איטי.</li>
</ol>2. רכישת תמונה
<ol><li>מטב פרמטרי רכישת מיקרוסקופ עבור דגימות ספציפיות. בדוגמה זו, תמונות צולמו במיקרוסקופ רחב שדה. השתמש במטרת אוויר 5x (NA: 0.15; WD: 20000 מיקרומטר) כדי לקבל שדה גדול מספיק לניתוח.</li>
	<li>להעריך צבירה בסיסית מיד לאחר ערבוב שני התנאים של תאי HEK בשלב 1.8. אלה עכשיו תמונות 'זמן אפס'.<ol>
<li>פיפטה 40 μL של כל תערובת מדגם על שקופית מיקרוסקופ טעונה ותמונה תחת פלואורסצנטיות בשני ערוצי 488 ו 561.</li>
		<li>רכוש שלושה שדות תצוגה שונים במישור מיקוד אחד לכל טיפה לדוגמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>רכוש תמונות סופיות ב- 60 דקות כתמונה 'זמן 60'.<ol>
<li>כדי לקבל את התמונה 'זמן 60' של התערובת לאחר דגירה של 60 דקות, לקחת עוד 40 μL מדגם של כל תנאי מצינורות מסתובבים פיפטה כל מדגם על שקופית טעונה. תמונה כמו בשלב 2.2.2. הערה: יש לבדוק צבירת תאים כל 15 דקות עד שתתרחש רוויה. תזמון הצבירה יהיה תלוי בחלבונים הנבדקים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח ImageJ/פיג'י
<ol><li>כדי לכמת את היקף הצבירה באמצעות פיג'י/ImageJ, שמור קבצי ניתוח.<ol>
<li>שמור את קבצי הקידוד המשלימים שסופקו בתיקיה פקודות מאקרו של imageJ במחשב.</li>
		<li>התקן את מאקרו הצבירה שסופק (תוספים, פקודות מאקרו, התקן ובחר בקובץ "צבירהאי.txt").</li>
	</ol>
</li>
	<li>קבע ערכי סף.<ol>
<li>טען קובץ .tif 'זמן אפס' לתוך imageJ ופצל את הערוצים (תמונה | | צבע פיצול ערוצים). הערה: התמונה 'זמן אפס' משמשת לקביעת גודל הסף והפונקטה הקטן ביותר עבור הניסוי כולו.</li>
		<li>מסיכה כל ערוץ (תוספים | פקודות מאקרו | AggregationAssay_MakeMask). החלון 'הפוך מסיכה מתמונה' יופיע. בתיבות הסימון לצד קבע סף לתמונה וקבע פארמים של אשכול מהיסטוגרמה ולחץ על אישור.</li>
		<li>קבע את סף התמונה באמצעות סרגל השקופיות, הקלט את המספר משמאל לסרגל השקופיות ולחץ על אישור.</li>
		<li>תופיע היסטוגרמה של גודל אשכול. בחר גודל אשכול מההיסטוגרמה המתאימה לניסוי, הקלד מספר זה בתיבה גודל אשכול מינימלי: ולחץ על אישור. אשכולות מתחת לגודל זה לא ינותח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תריץ את הניתוח.<ol>
<li>פתח את התמונה 'זמן 60' של תנאי 1 ב imageJ ולפצל את הערוצים כמו בשלב 3.2.1.</li>
		<li>מסיכה כל ערוץ (תוספים, פקודות מאקרו AggregationAssay_MakeMask). השתמש באותו סף ובאותו גודל שנקבעו בשלב 3.2.3 ובשלב 3.2.4. בטלו את הבחירה בתיבות שליד 'קביעת סף לתמונה' ו'קביעת תערוכי אשכול מהיסטוגרמה' והקלדו ידנית את הגודל והסף בשדות המתאימים ולחצו על הלחצן 'אשר'.</li>
		<li>חישוב אינדקס הצבירה (תוספים | פקודות מאקרו | AggregationAssay_CalculateOverlap). בחר את הערוצים עם המסיכה שיש להשוות ואת הספריה שבה ישמרו הקבצים המתקבלים.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.3.1-3.3.3 עבור כל תמונה 'זמן 60' בכל תנאי. הערה: אינדקס הצבירה מוגדר כאזור החפיפה הכולל חלקי הסכום של שני אזורי הערוצים פחות אזור החפיפה כפול 100 (אינדקס צבירה = אזור חפיפה/[אזור של ערוץ 1 + אזור של ערוץ 2 – אזור חפיפה] x 100). נורמליזציה זו היא פעולת 'OR' בין שני הערוצים עם המסיכה המייצגת את סך כל הפיקסלים בכל אחת מהמסכות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון המתרחשות טרנס במהלך הידבקות בתא יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים תאיים בסיסיים כולל היווצרות, פונקציה ותחזוקה של סינפסות במהלך התבגרות ושיפוץ. ההשלכות של אינטראקציות בין תא לתא מתרחבות מעבר לנוירוביולוגיה ויש להן תפקידים רחבים יותר בתמרת אותות, נדידת תאים ופיתוחרקמות 14. סטיות בהדבקת תאים יכולות לשבש תהליכים תאיים הכרחיים לתפקוד תקין של התא ויכולות בבסיס מגוון אטיולוגיות כגון סרטן, דלקת פרקים, התמכרות, אוטיזם וסכיזופרניה<sup class="x...

אינטראקציות סינפטיות בהנחיית מולקולות הידבקות סינפטית הן הבסיס לפיתוח, ארגון, מפרט, תחזוקה ותפקוד של סינפסות ויצירת רשתות עצביות. הזיהוי של מולקולות הידבקות תאים טרנס-סינפטיות אלה גדל במהירות; לכן, חשוב ביסודו לזהות שותפים מחייבים ולהבין כיצד מולקולות הדבקה חדשות אלה אינטראקציה אחד עם השני. בנוסף, רצף הגנום זיהה מוטציות ברבים ממולקולות הידבקות אלה הקשורות בדרך כלל לשלל הפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירופסיכיאטריות והתמכרות1. מוטציות בגנים המקודדות למולקולות סינפטיות של הידבקות בתאים עלולות לשנות לרעה אינטראקציות טרנסג'נדריות ועשויות לתרום לשינויים פתופיזיולוגיים בהיווצרות סינפסה או תחזוקה.
מבחנים מרובים קיימים כדי להעריך כמותית אינטראקציות חלבון חלבון כגון קלורימטריה איזותרמית, dichroism מעגלי, תהודה פלסמון פני השטח2 ולמרות כמותי בטבע, יש להם מספר מגבלות. ראשית, הם דורשים חלבון רקומביננטי, לפעמים דורשים צעדי טיהור ארוכים ומייגעים. שנית, הם דורשים ציוד מיוחד מתוחכם ומומחיות טכנית. שלישית, הם יכולים להפרז בהיקף הכריכה כפי שהם מאפשרים הן אינטראקציות cis ו טרנס בין חלבונים הקשורים באופן טבעי קרום vivo. כאן אנו מציעים בדיקה פשוטה ומהירה יחסית הבדוקה באופן בלעדי אינטראקציות טרנסג'נדריות.
כדי לעקוף רבים מהסיבוכים הקשורים למטעני חלבון מטוהרים, יש לנו אופטימיזציה של בדיקת אינטראקציה חלבון מבוסס תאים כי recapitulates אינטראקציות טרנס במערכת תאים הטרולוגית מופחתת. מבחנים אלה שימשו בעבר בצורות שונות לחקר אינטראקציות טרנס-תאיות. בגישה זו, מולקולות הידבקות תאים מועמדים הם transfected לתוך תאי HEK293T. בתנאים פיזיולוגיים, תאי HEK293T אינם מפגינים צבירה עצמית, מה שהופך אותם למודלים למופת לבדיקה זו. עם זאת, כאשר אוכלוסיות בודדות של תאי HEK המביעים קולטן ו ligand משולבים, הכריכה של הקולטן ואת ligand כוחות צבירה של תאי HEK להתרחש. צבירה זו מתווכת אך ורק על ידי אינטראקציות טרנסג'נדריות ובדרך כלל ניתן לצפות בה בעשרות דקות. בשיטה זו אין צורך בצעדי טיהור חלבונים, ויעילות השיטה מסתמכת על הפרדיגמה לפיה משולבות אוכלוסיות של תאי HEK המבטאות מולקולות הידבקות קוגניציה ולאחר מכן מצולמות רק עשרות דקות לאחר מכן. בנוסף, שיטה זו זולה יחסית, שכן לא נדרשים נוגדנים ולא ציוד יקר. הציוד היחיד הנדרש לרכישת נתונים הוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. יתרון נוסף למבחן מבוסס תא זה הוא היכולת לסנן במהירות את ההשפעה של מוטציות נקודתיות רלוונטיות למחלות על אינטראקציות טרנסג'נדריות. זה יכול להתבצע על ידי transfecting תאי HEK עם cDNAs של גרסאות מוטציה של החלבון של עניין.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים דוגמה שבה אנו חוקרים אם מוטציה שגויה Neurexin3α (Neurexin3αA687T), זוהה בחולה שאובחן עם מוגבלות אינטלקטואלית עמוקה ואפילפסיה, משנה אינטראקציות טרנס עם חלבון טרנסממברן חוזר עשיר לאוצין 2 (LRRTM2). Neurexin3α הוא חבר במשפחה השמורה מבחינה אבולוציונית של מולקולות הידבקות תאים presynaptic ובעוד העבודה האחרונה זיהתה תפקידים מרובים בסינפסה3,4,5,6,7, ההבנה הסינפטית שלנו של מולקולה זו וכל בני משפחת neurexin נשאר שלם. LRRTM2 הוא חלבון הידבקות תאים פוסט-סינפטי מעורר המשתתף בהיווצרות סינפסה ותחזוקה8,9,10. חשוב לציין, LRRTM2 באופן בלעדי אינטראקציה עם isoforms neurexin שחסרים באתר splice 4 אקסון חלופי (SS4-) אבל לא עם isoforms neurexin המכיל את אתר splice 4 exon חלופי (SS4+). מוטציית ההחמצה האנושית (A687T) שזוהתה ב Neurexin3α ממוקמת באזור חוץ-תאי לא מתורבת השמור מבחינה אבולוציונית ושמור בין כל אלפא neurexins7. כמו האינטראקציהביןשתי מולקולות אלה הוקמה 8,9,11, אנו מציגים את השאלה: האם היכולת מחייבת של Neurexin3α SS4- כדי LRRTM2 השתנה על ידי מוטציה נקודת A687T? בדיקה זו גילתה כי מוטציית נקודת A687T שיפרה באופן בלתי צפוי את הצבירה של Neurexin3α ל- LRRTM2 מה שמרמז על כך שהאזור החוץ-תאי שבו נמצאת המוטציה הנקודתית, ממלא תפקיד בתיווך אינטראקציות טרנסינפטיות.

<table><tbody><tr><td>מיקרו-צינורות חד פעמיים בנפח 1.5 מ"ל עם כובעי הצמד</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>דגירה של אוכלוסייה מעורבת של תאי HEK</td></tr><tr><td>1000 מ"ל Rapid&mdash; יחידת מסנן זרימה, 0.2 אום aPES ממברנה</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>עיקור של מדיה</td></tr><tr><td>HEK 15 מ"ל SpectraTube צינורות צנטריפוגה</td><td>Ward' s Science</td><td>470224-998</td><td>קצירת תאי HEK</td></tr><tr><td>6 צלחות תרבית רקמות סטריליות היטב</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>תרבית תאי HEK</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>223506-500G</td><td>העברת סידן פוספט, צנטריפוגה להשעיית תאי HEK</td></tr><tr><td>- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro מוצרי מעבדה</td><td>75004377</td><td>קצירת תאי</td></tr><tr><td>HEK חממת</td> <td>תאי CO2Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>דגירה של תאי HEK במהלך הגידול</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (שינוי של Dulbecco של מדיום הנשר) עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, L-גלוטמין ונתרן פירובט</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>תחזוקת תאי HEK</td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>מעבר/קציר תאי HEK</td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>קצירת תאי HEK</td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית מאווררות בז, 75 ס"מ2 אזור גידול</td><td>קורנינג</td><td>9381M26</td><td>תרבית תאי HEK</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>סיגמא</td><td>17L184</td><td>תחזוקת</td></tr> <tr>תאי HEK<td>HEK293T תאים</td><td>מערכת מודל</td><td>ATCC</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>ניתוח תמונה</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>סיגמא</td><td>M9272-500G</td><td>השעיית תאי HEK</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP332-500</td><td>טרנספקציה של סידן פוספט</td></tr><tr><td>טריפסין 0.25% (1X) תמיסה</td><td>GE Healthcare Life מדעים</td><td>SH30042.01</td><td>מעבר תאי HEK</td></tr><tr><td>מסובב</td><td></td><td></td> צינור <td>דגירה של אוכלוסייה מעורבת של תאי HEK</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ אולטרה-קליר. לבן חלבי, חיובי טעון</td><td>דנוויל סיינטיפיק בע"מ</td><td>רכישת תמונה</td> <td>M1021</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה רחב</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>רכישת תמונה</td></tr></tbody></table>

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

אינטראקציות חלבון בממשקים סלולריים מכתיבות שפע של תוצאות ביולוגיות החל מהתפתחות רקמות והתקדמות סרטן ועד היווצרות ותחזוקה של סינפסה. רבות מהאינטראקציות הבסיסיות הללו מתרחשות בטרנס ובדרך כלל נגרמות על ידי אינטראקציות הטרופיליות או הומופיליות בין תאים המבטאים זוגות כריכה מעוגנים בקרום. המבהיר כיצד מוטציות רלוונטיות למחלות משבשות את אינטראקציות החלבון הבסיסיות האלה יכול לספק תובנה על מספר עצום של תחומי ביולוגיה של התא. מבחני אינטראקציה רבים של חלבון-חלבון אינם מנטרלים בדרך כלל בין אינטראקציות cis ו- trans, מה שעלול להוביל להערכת יתר של היקף הכריכה המתרחשת ב- vivo וכרוכה בטיהור אינטנסיבי של חלבון ו/או ציוד ניטור מיוחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט אופטימיזציה המאפשר תצפית וכימות של אינטראקציות טרנס בלבד ללא צורך בטיהור חלבונים ממושך או ציוד מיוחד. מבחני צבירת תאי HEK כרוכים בערבוב של שתי אוכלוסיות עצמאיות של תאי HEK, שכל אחת מהן מבטאת ליגנדים קוגניאטים הקשורים לקרום. לאחר תקופת דגירה קצרה, הדגימות מסומנות והצטברויות המתקבלות מכמתות.

מוטציית A687T מגבירה את Neurexin3α SS4- מחייב LRRTM27 כדי לחקור כיצד אינטראקציות בין-תאיות של שני חלבונים סינפטיים ידועים מושפעות מהכנסת מוטציה נקודתית שנמצאה בחולה עם מוגבלות אינטלקטואלית ואפילפסיה, השתמשנו במדיין צבירת התאים הנ"ל HEK (איור 1). התאים הודבקו לפי סעיף 1 והוכנו להדמיה לפי סעיפים 1 ו-2 של הפרוטוקול. תאים צולמו בבסיס שבו לא נצפתה צבירה כצפוי (לא מוצג). תמונות שנרכשו ב 60 דקות נותחו כמו בסעיף 3 של הפרוטוקול. כדי למזער את הטיית הבחירה, התנאים היו אקר...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

הבדיקה מבוססת התאים מאפשרת תצפית וכימות של אינטראקציות הידבקות טרנס ללא צורך בטיהור חלבונים ממושך או ציוד מיוחד. למרות שאינטראקציות החלבון שנבדקו כאן רלוונטיות לנוירוביולוגיה, ניתן ליישם שיטה זו בכל תחום מחקר שבו הידבקות חלבון מתרחשת בין-תאית. 48 שעות לאחר העברת תאי HEK-293T, קצרו את התאים מצלחת שש הבארות לצבירה.ראשית, יש לשטוף כל באר פעמיים עם PBS. לאחר מכן, כדי לנתק בעדינות את התאים, הוסף מיליליטר אחד של 10 מילי-מולרי EDTA לכל באר, ולאחר מכן דגר על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות של דגירה, הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים ולקצור כל באר לצינור חרוטי נפרד של 15 מיליליטר.צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בזמן שהתאים מתגלגלים, הכינו שישה צינורות דגירה על ידי סימון החלק העליון של צינורות מיקרו-צנטריפוגה בתנאי הניסוי. יש להשתמש בכל תמורות של GFP ו-mCherry .הסר את הסופרנטנט מהצינורות החרוטיים של 15 מיליליטר והשהה מחדש את התאים ב -500 מיקרוליטר של מדיום. בעזרת המוציטומטר ספרו את התאים בכל צינור חרוטי. לאחר מכן יש להוציא 200,000 תאים מכל מצב לתוך צינור הדגירה המתאים לתערובת אחד לאחד בנפח כולל של 500 מיקרוליטר.לאחר הערכת הצבירה הבסיסית המתוארת בסעיף הבא, הנח את צינורות הדגירה במסובב צינור איטי בטמפרטורת החדר. כדי להעריך את הצבירה, בנקודת ההתחלה ושוב לאחר 60 דקות, פיפטה 40 מיקרוליטר מצינור הדגירה על שקופית מיקרוסקופ טעונה. רכישה בסיסית צריכה להיעשות במהירות האפשרית לאחר הוספת תאים לצינור המיקרו-צנטריפוגה.דמיין את השקופית תחת פלואורסצנטיות בערוץ הירוק והאדום. עבור כל שקופית, צלם תמונות של שלושה שדות ראייה שונים במישור מוקד אחד. תאי HEK-293T הועברו עם חלבון מעניין, חלבון מוטנטי מעניין, או ליגנד מעניין ועברו טרנספקט משותף עם חלבון פלואורסצנטי.אוכלוסיות תאים המבטאות את החלבון המעניין עורבבו עם אוכלוסיות תאים המבטאות את הליגנד המעניין והוערכו לצבירה לאחר 60 דקות. בשכבות-על של תמונות שצולמו בערוצים הירוקים והאדומים, הצבירה מופיעה כפונקטה צהובה. מצבים שבהם תאים לא ביטאו ליגנדים סינפטיים הראו צבירה מינימלית.כמו כן, צבירה מינימלית הוצגה כאשר רק אחת משתי האוכלוסיות ביטאה ליגנדים סינפטיים. לא הוצגה צבירה כאשר שתי אוכלוסיות התאים ביטאו מולקולות הידבקות לא תואמות. תנאים עם מולקולות הידבקות תואמות הראו צבירה משמעותית לאחר דגירה של 60 דקות.באופן מפתיע, החלבון המוטנטי המעניין הפגין צבירה משמעותית יותר מאשר מקבילו מסוג הבר, מה שמרמז על כך שהמוטציה הנקודתית משפרת את יכולות קשירת החלבונים. מוטציות במולקולות הידבקות רבות קשורות בדרך כלל להפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירו-פסיכיאטריות והתמכרות. בעזרת טכניקה זו, ניתן לסנן את ההשפעות של מוטציות נקודתיות רלוונטיות למחלה על אינטראקציות טרנס.

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת צבירת חלבונים מבוססת תאים באמצעות מעכבי פרוטאזום, אשר חוסמים את פעילות הפרוטאזום, ומונעים מחלבונים מוטנטיים שאינם מקופלים כהלכה, מאוחים לתווית פלואורסצנטית, לעבור פירוק פרוטאזומלי תלוי יוביקוויטין, המוביל להצטברותם בתוך הציטופלסמה של התא. לאחר מכן מדמיינים את צברי החלבונים ומכמתים אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

בסרטון זה אנו מדגימים את הטכניקה למדידת אינטראקציות טרנס-תאיות בין מולקולות היצמדות תאים סינפטיים באמצעות בדיקת צבירת תאי HEK. בבדיקה זו, מספר שווה של תאי HEK המבטאים מולקולת היצמדות תאים קדם-סינפטית רצויה וחלבון פלואורסצנטי מעורבבים עם תאי HEK המבטאים מולקולת היצמדות תאים פוסט-סינפטית וחלבון פלואורסצנטי נוסף. האינטראקציה בין מולקולות ההיצמדות התא מאלצת את התאים להצטבר, דבר שניתן למדוד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדיקת צבירת תאים לזיהוי אינטראקציות טרנס בין מולקולות היצמדות תאים

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת ספקטרוסקופיית התהודה המגנטית הגרעינית בתוך התא כדי לחקור אינטראקציות חלבון-ליגנד בין חלבונים לא מסומנים בעלי ביטוי יתר לבין מולקולות קטנות. האינטראקציה המוצלחת בין ליגנד לחלבון מאושרת חזותית על ידי הופעתה של קבוצה נוספת של פסגות באזור העניין הספקטרלי שמחליפה בהדרגה את הפסגות המקוריות.

ספקטרוסקופיית NMR כמותית של מימן בתוך התא לניטור אינטראקציות חלבון-ליגנד

כדאיות ניידת תלויה בניהול הזמן והיעיל של misfolding חלבון. כאן אנו מתארים שיטה להמחשת הגורל הפוטנציאלי השונה של חלבון misfolded: קפל שוב, שפלה, או תפיסה בתכלילים. אנו מדגימים את השימוש בחיישן מתקפל,...

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לאפיון תכונות ההדבקה הפנימיות של מולקולות הידבקות תאים משוערות.  האקטודומיין המופרש המתויג באפיטופ של מולקולת הידבקות תאים נלכד ממדיום התרבות על חרוזים קטנים ואחידים מתפקדים.  לאחר מכן ניתן להשתמש בחרוזים אלה באופן מיידי במבחני צבירת חרוזים פשוטים.

מבחני צבירת חרוז לאפיון של תא המשוערת הידבקות מולקולות

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

כאן, שיטה מוצגת לניתוח של קינטיקה הצטברות חלבון נמטודה Caenorhabditis elegans. בעלי חיים מאוכלוסייה מסונכרנת גיל הם בתמונה בנקודות זמן שונות, ואחריו ספירת הכללה חצי אוטומטית CellProfiler והתאמה למודל מתמטי באמילופיט.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים, ואחריה טכניקות משיכה קונבנציונליות לחקר קומפלקסים חלבוניים שאינם יכולים להרכיב במבחנה.

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

למדו פרוטוקול לבדיקת אינטראקציות ליגנד-רצפטור ב-HEK-293T באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת מדידה מהירה של אינטראקציות הידבקות חלבוניות בנוירוביולוגיה.

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

גלה סרטונים נוספים