מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

הבדיקה מבוססת התאים מאפשרת תצפית וכימות של אינטראקציות הידבקות טרנס ללא צורך בטיהור חלבונים ממושך או ציוד מיוחד. למרות שאינטראקציות החלבון שנבדקו כאן רלוונטיות לנוירוביולוגיה, ניתן ליישם שיטה זו בכל תחום מחקר שבו הידבקות חלבון מתרחשת בין-תאית. 48 שעות לאחר העברת תאי HEK-293T, קצרו את התאים מצלחת שש הבארות לצבירה.

ראשית, יש לשטוף כל באר פעמיים עם PBS. לאחר מכן, כדי לנתק בעדינות את התאים, הוסף מיליליטר אחד של 10 מילי-מולרי EDTA לכל באר, ולאחר מכן דגר על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות של דגירה, הקש בעדינות על הצלחת כדי לנתק את התאים ולקצור כל באר לצינור חרוטי נפרד של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה את הצינורות בטמפרטורה של 500 x גרם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. בזמן שהתאים מתגלגלים, הכינו שישה צינורות דגירה על ידי סימון החלק העליון של צינורות מיקרו-צנטריפוגה בתנאי הניסוי. יש להשתמש בכל תמורות של GFP ו-mCherry .

הסר את הסופרנטנט מהצינורות החרוטיים של 15 מיליליטר והשהה מחדש את התאים ב -500 מיקרוליטר של מדיום. בעזרת המוציטומטר ספרו את התאים בכל צינור חרוטי. לאחר מכן יש להוציא 200,000 תאים מכל מצב לתוך צינור הדגירה המתאים לתערובת אחד לאחד בנפח כולל של 500 מיקרוליטר.

לאחר הערכת הצבירה הבסיסית המתוארת בסעיף הבא, הנח את צינורות הדגירה במסובב צינור איטי בטמפרטורת החדר. כדי להעריך את הצבירה, בנקודת ההתחלה ושוב לאחר 60 דקות, פיפטה 40 מיקרוליטר מצינור הדגירה על שקופית מיקרוסקופ טעונה. רכישה בסיסית צריכה להיעשות במהירות האפשרית לאחר הוספת תאים לצינור המיקרו-צנטריפוגה.

דמיין את השקופית תחת פלואורסצנטיות בערוץ הירוק והאדום. עבור כל שקופית, צלם תמונות של שלושה שדות ראייה שונים במישור מוקד אחד. תאי HEK-293T הועברו עם חלבון מעניין, חלבון מוטנטי מעניין, או ליגנד מעניין ועברו טרנספקט משותף עם חלבון פלואורסצנטי.

אוכלוסיות תאים המבטאות את החלבון המעניין עורבבו עם אוכלוסיות תאים המבטאות את הליגנד המעניין והוערכו לצבירה לאחר 60 דקות. בשכבות-על של תמונות שצולמו בערוצים הירוקים והאדומים, הצבירה מופיעה כפונקטה צהובה. מצבים שבהם תאים לא ביטאו ליגנדים סינפטיים הראו צבירה מינימלית.

כמו כן, צבירה מינימלית הוצגה כאשר רק אחת משתי האוכלוסיות ביטאה ליגנדים סינפטיים. לא הוצגה צבירה כאשר שתי אוכלוסיות התאים ביטאו מולקולות הידבקות לא תואמות. תנאים עם מולקולות הידבקות תואמות הראו צבירה משמעותית לאחר דגירה של 60 דקות.

באופן מפתיע, החלבון המוטנטי המעניין הפגין צבירה משמעותית יותר מאשר מקבילו מסוג הבר, מה שמרמז על כך שהמוטציה הנקודתית משפרת את יכולות קשירת החלבונים. מוטציות במולקולות הידבקות רבות קשורות בדרך כלל להפרעות נוירו-התפתחותיות, נוירו-פסיכיאטריות והתמכרות. בעזרת טכניקה זו, ניתן לסנן את ההשפעות של מוטציות נקודתיות רלוונטיות למחלה על אינטראקציות טרנס.