גישה לחקר תעתיק תלוי צורה ברמת תא יחיד
November 2nd, 2020
נייר זה מציג שיטות לגידול מיוציטים לבביים עם צורות שונות, המייצגות פתולוגיות שונות, ומיון מיוציטים לביים דבקים אלה בהתבסס על המורפולוגיה שלהם ברמת תא אחד. הפלטפורמה המוצעת מספקת גישה חדשנית לתפוקה גבוהה והקרנת סמים עבור סוגים שונים של אי ספיקת לב.
אנו מציעים פלטפורמה חדשנית לחקירת ההשפעות של צורת התא על ביטוי גנים, תוך שימוש בשיטות לגידול ומיון דבקויות עם מורפולוגיות שונות ברמת התא הבודד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מקלה על מחקר תפוקה גבוהה של צורת התא במבחנה כמו השוואת תאים עם צורות שונות ב vivo הוא תובעני מבחינה טכנית. כדי להקים תרבות cardiomyocyte בדוגמת, להעביר השעיה cardiomyocyte ביחס גובה-רוחב של עניין צינור 15 מיליליטר לספירה ולדלל את התאים ל 10 פעמים עד חמשת התאים למיליליטר של ריכוז בינוני ציפוי מתאים.
הוסיפו שני מיליליטר תאים לשבב מיקרו-פטרוני מצופה פיברונקטין שקוע בשני מיליליטר של מדיום ציפוי חם בתוך צלחת גרנייה פטרי 35 מיליליטר והניחו את המנה בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 18 שעות. למחרת, בדוק את השבב על ידי מיקרוסקופ אור כדי לאשר שרוב התאים מחוברים. מוציאים את המדיום מהצלחת כדי להסיר את כל הפסולת או התאים המתים, ומתחילים מהמרכז ומתקדם לכיוון הצדדים בצורה טיפה חכם, בעדינות להוסיף PBS לתאים.
לאחר הכביסה השלישית, החלף את ה- PBS במדיום תחזוקה של ארבעה מיליליטר והחזר את התאים לאנקובטור תרבות התאים. לאחר 72 שעות, יש לשטוף בעדינות את משטח השבב פעמיים עם שני מיליליטר של PBS חם של Dulbecco לכל שטיפה כפי שהוכח ולהשתמש במטליות כדי להעביר מיד את השבב השטף למנה סטרילית חדשה של 35 מיליליטר גרנייה פטרי. הוסף במהירות 1.5 מיקרוליטרים של ירוק דיסיקל תוסס מדולל 1000 לקפל DPBS לשבב.
מתקנים תא מעל השבב ומ מניחים את המנה על מחזיק הכלים של שלב בורר התאים. הכנס את המכסה המגנטי ואתר את הכוונת בחלון התצוגה החיה. התמקד בצלב, ובחלון הסריקה והמיון, בחר את הכיול להזרקה וכיול אוטומטיים.
החלף את המנה supernatant עם 1.5 מיליליטר של E משולש אחד לאחד בפתרון DPBS כדי לשחרר את התאים מן fibronectin ולפתוח את לשונית הסריקה. כדי לסרוק את השבב כולו, התמקד בפינה השמאלית העליונה של השבב בשדה התצוגה ולחץ על קבל את מיקום המיקרוסקופ הנוכחי. לאחר מכן, התמקד בפינה השמאלית התחתונה של השבב ולחץ על קבל את מיקום המיקרוסקופ הנוכחי.
בחלון המוקפץ, לחץ על הגדר את המישור החד ביותר ולחץ על מעבר לפינה השמאלית העליונה ולעבור ללחצני הפינה הימנית התחתונה. לאחר מכן, לחץ על סיום כדי להתחיל בסריקה. לאחר השלמת הסריקה, פתח את הכרטיסיה ניתוח ולחץ על הצג מפה כדי לבחור את התאים הבודדים העוברים את קריטריוני המחקר.
מרכז את מיקרו-הכיפה של הזכוכית באמצע הנוף החי של המיקרוסקופ ופתח את לשונית המשאבה. כדי ליצור ואקום, לסגת הבוכנה מ 50 מיליליטר מספר אחד מזרק ארבעה מיליליטר ולפתוח את לשונית המיון. כדי לאפשר תא בודד להיאסף, הגדר את השסתום 2 להיפתח במשך 120 אלפיות שנייה ושסתום אחד להיפתח במשך 20 אלפיות שנייה לאחר זמן לשגות של 200 אלפיות שנייה.
כדי לאפשר את התא הרים להישלח בהצלחה לצינור PCR שלה המכיל מאגר תזה, להגדיר את השסתום אחד להיפתח במשך 20 אלפיות שנייה שסתום שתיים להיפתח במשך 10 אלפיות שנייה לאחר זמן לשגות של 10 אלפיות השניה. לאחר התאמת הגדרות השסתום, לחץ על מ לחשב את הנתיב. התוכנה ת לחשב את הנתיב המהיר ביותר מתא לתא להרים והזרקת התאים שנבחרו לאורך השבב.
לאחר מכן, למקד את המיקרוסקופ על דפוס על פני השטח של השבב. השתמשו בהיגוי כדי להזיז את המיקרו-אקפילארי כלפי מטה בזהירות, כך שניתן יהיה להשיג את התמונה החדה ביותר של קצה המיקרו-אקפילארי מבלי לגעת במשטח השבב וללחוץ על סט. ייפתח חלון חדש, המציג את חתך המיקרו-אקפילארי.
כדי שהתוכנה תקליט את היסט הקצה של נימי הקואורדינטות X, Y ו- Z, לחץ על המרכז המדויק של נימי. לאחר מכן, לחץ על התחל למיין כדי להפעיל את המיון. בניתוח מייצג זה של cDNA מוגבר מראש מתא בודד הרים, רצועה ברורה בג'ל כמו עלילה densitometry נצפתה המתאימה לשיא ב 1, 852 זוגות בסיס ב electropherogram.
הגודל הממוצע של שברים היה 1, 588 זוגות בסיס עם מספר קטן של שברים שהיו קצרים יותר מ 300 זוגות בסיס, המציין את הדור של ספריית cDNA טובה. כתמים וניתוח Immunofluorescent יכול להתבצע גם כדי להעריך את מבנה sarcomere בתוך cardiomyocytes בדוגמת. פלטפורמה זו סוללת את הדרך לחקר תפוקה גבוהה הקרנת סמים של סוגים שונים של אי ספיקת לב.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פלטפורמה חדשנית לגידול ומיון מיוציטים לבביים על סמך המורפולוגיה שלהם ברמת תא יחיד. שיטה זו מאפשרת סינון תרופות בתפוקה גבוהה עבור סוגים שונים של אי ספיקת לב.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- תרבות מיוציטים לבביים
- ניתוח מורפולוגיה של תאים
- מתודולוגיות סינון תרופות
רקע
- מיוציטים לבביים מציגים צורות מגוונות המתואמות עם פתולוגיות שונות.
- חקירת השפעות צורת התא על ביטוי גנים היא מאתגרת in vivo.
- טכניקות בתפוקה גבוהה חיוניות לסינון תרופות יעיל.
- השיטות הנוכחיות חסרות יעילות במיון וניתוח תאים בודדים על סמך המורפולוגיה.
מטרת המחקר
- לפתח פלטפורמה לחקר ההשפעה של צורת התא על ביטוי גנים.
- להקל על מיון מיוציטים לבביים על סמך המורפולוגיה שלהם.
- לשפר תהליכי סינון תרופות לטיפול באי ספיקת לב.
שיטות ששימשו
- הכנת ומילוי השעיה של קרדיומיציטים.
- שימוש ברכיבי מיקרו מצופים בפיברוניקטין לתרבות תאים.
- מיקרוסקופיה אופטית לאישור התקשרות התאים.
- סריקה מיון אוטומטיים של תאים בודדים באמצעות מערכת מיקרו-קפילרית.
תוצאות עיקריות
- התקשרות תחזוקה מוצלחת של קרדיומיציטים מדוגמים.
- ייצור ספריית cDNA טובה מתאים ממויינים.
- צביעה אימונופלואורסצנטית חשפה מבני סרקומר.
- הפלטפורמה תומכת במחקרים וסינון תרופות בתפוקה גבוהה.
מסקנות
- הפלטפורמה המפותחת מציעה גישה חדשנית לחקר מיוציטים לבביים.
- היא מאפשרת מיון וניתוח יעילים של תאים על סמך המורפולוגיה.
- שיטה זו יכולה לקדם משמעותית את המחקר בטיפולים לאי ספיקת לב.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This platform enables systematic investigation of how cardiac myocyte morphology influences gene expression, addressing a critical gap in understanding shape-dependent transcriptomic regulation in heart failure. By linking defined geometrical morphotypes to pathological phenotypes such as hypertrophic and dilated cardiomyopathy, it provides a mechanistic bridge between cellular structure and disease-relevant signaling. The approach supports early-stage target validation and phenotypic screening by generating reproducible, morphology-stratified single-cell transcriptomic data for de-risking therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating specific cardiomyocyte aspect ratios with gene expression profiles linked to pathological remodeling.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through standardized, morphology-controlled single-cell isolation and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying shape-dependent molecular signatures that may predict compound efficacy across heart failure subtypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with precise length:width aspect ratios for downstream compound screening in heart failure models.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via micropatterned fibronectin chips that enforce consistent cell morphologies across replicates.
- Scalability: Supports high throughput screening through automated single-cell picking and injection into lysis buffer for parallel processing.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase morphology-stratified transcriptomics to preclinical validation by modeling HCM and DCM-associated geometries.
- Biomarker Alignment: Enables identification of shape-dependent transcriptomic signatures that may serve as predictive indicators of treatment response.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing how cell shape modulates pathway activation in response to pharmacological perturbation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis-driven analysis of cell shape effects prior to lead identification, with outputs informing preclinical model selection and mechanistic de-risking strategies.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating the variable of cell shape to clarify its role in transcriptional regulation under normal and pathological conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, morphology-defined cardiomyocyte populations for reliable compound evaluation in heart failure drug discovery.
- Analytics: Generates quantitative single-cell transcriptomic measurements that allow comparison of gene expression across distinct geometrical morphotypes.
- Translational Research: Provides disease-relevant systems modeling concentric and eccentric hypertrophy through controlled aspect ratios, enhancing preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative screening campaigns across multiple heart failure phenotypes and compound libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in how cellular morphology influences signaling pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through micropatterned culture and automated single-cell handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of shape-dependent biological responses that may indicate clinical translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects across morphology-stratified cardiomyocyte models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac cell culture, micropatterning techniques, and single-cell manipulation systems.
- Dependent on access to fibronectin-coated micropatterned chips, fluorescence microscopy, and automated microcapillary-based cell pickers.
- Necessitates cross-team standardization of aspect ratio definitions and transcriptomic analysis pipelines for consistent interpretation.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other cell types or disease models beyond cardiac myocytes.
- Practical limitations include the need for optimization of cell density and incubation times to ensure uniform attachment across micropatterns.
