Name: שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למד שיטת ניקוי הידרופובית לרקמת מוח חולדה לניתוח מעגלים עצביים שלמים. הטכניקה שומרת על שלמות הרקמה ומאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים מולקולריים במוח עכברוש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 &32 הכשרה גרנט 5T32GM081740

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה.
1. הכנת פתרון מלאי
<ol><li>פתרון 1 (1 ליטר): ל 900 מ"ל של H2O deionized להוסיף 100 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט 10x (PBS) ו 2 מ"ל של טריטון X-100.</li>
	<li>פתרון 2 (1 ליטר): ל 900 מ"ל של H2O deionized, להוסיף 100 מ"ל של 10x PBS, 2mL של Tween-20 ו 1 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל פתרון מלאי הפרין.</li>
	<li>פתרון 3 (500 מ"ל): ל-400 מ"ל של פתרון 1, הוסף 11.5 גרם של גליצין ו-100 מ"ל של דימתילסולפוקס (DMSO).</li>
	<li>פתרון 4 (50 מ"ל): ל 42 מ"ל של פתרון 1, להוסיף 3 מ"ל של סרום מתאים ו 5 מ"ל של DMSO.</li>
	<li>פתרון נוגדנים ראשי (50 מ"ל): ל 46 מ"ל של פתרון 2, להוסיף 2.5 מ"ל של DMSO ו 1.5 מ"ל של סרום מתאים.</li>
	<li>פתרון נוגדנים משני (50 מ"ל): ל 48.5 מ"ל של פתרון 2, להוסיף 1.5 מ"ל של סרום מתאים. הערה: עבור פתרון 4, פתרון ראשוני, פתרון משני, להשתמש בסרום המתאים עם הנוגדן המשני (למשל, עז, סוס, שור).</li>
</ol>2. הכנת מדגם
הערה: בצע שלבים 2.1 עד 2.7 במכסה המנוע של אדים עקב הגבלת החשיפה ל- PFA.
<ol><li>עכברוש צעיר מאוד (3-6 שבועות) באמצעות סבופלורן; המשך ל 2.2 כאשר חולדה אינה מגיבה ואינה מגיבה לצביטת בוהן וזנב.</li>
	<li>מניחים את החולדה בתנוחה על-חניכית וגורמים חתכים דרך דופן הבטן באמצעות זוג מספריים של איריס.</li>
	<li>חותכים דרך החלק התחתון של כלוב הצלעות לעצם הבריח משני צידי כלוב הצלעות באמצעות מספריים מאיו.</li>
	<li>מדביק את החזה והצלעות הרחק מהלב והריאות עם hemostat.</li>
	<li>לנקב את החדר השמאלי עם מחט 23 G מחובר משאבת זלוף לחתוך את האטריום הימני עם מספריים איריס.</li>
	<li>בצע זלוף עירוי עם כ 75 מ"ל של 100 mM (1x) PBS.</li>
	<li>המשך זלוף עירוי קרדית עם כ 100 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) חוצץ ב 1x PBS.</li>
	<li>הסר את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>מניחים את המוח במצב קשת ופורסים ל-4 חלקים שווים (ברוחב של כ-3 מ"מ) באמצעות סכין גילוח ומטריצת מוח חולדה.</li>
	<li>תקן כל סעיף ב- 4% PFA ב- 1x PBS בצינור פלסטיק אטום, 5 מ"ל למשך הלילה ב 4 °C (70 °F) על שייקר.</li>
	<li>המשך לתקן ב 4% PFA ב 1x PBS בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר עבור 1 שעה.</li>
	<li>לשטוף כל סעיף עם 1x PBS ב RT במשך 30 דקות, 3 פעמים.</li>
</ol>3. התייבשות ודפיגמנטציה
<ol><li>לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור על המדגם ב 100% מתנול במשך 1 שעה ב RT. חזור עם יותר 100% מתנול, דגירה במשך 1 שעה ב RT.</li>
	<li>מצננים את המדגם ב 100% מתנול ב 4° C במשך כ 10 דקות.</li>
	<li>הכן פתרון מתנול 66%./33%.</li>
	<li>לדגור את המדגם לילה בתמיסת DCM / מתנול ב RT, עם רועד.</li>
	<li>לשטוף עם מתנול ב RT במשך 30 דקות, 2 פעמים.</li>
	<li>מצננים את המדגם ב 100% מתנול ב 4° C במשך כ 10 דקות.</li>
	<li>אקונומיקה במצנן, מוכן טרי 5% מי חמצן במתנול לילה ב 4° C.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>לדגור על המדגם ב 1x PBS עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>יש לשטוף בפתרון 1 למשך שעה אחת ב-RT, פעמיים.</li>
</ol>4. כולרה רעלן Subunit B תיוג
<ol><li>הכנס קצה מחט של מזרק 1 מ"ל לתוך אתר גרעין accumbens.</li>
	<li>להזריק לאט 2.5 μL של 1% ביוטין-CTB מעל 20 s.</li>
	<li>השאירו את קצה המחט במקום במשך 1 דקות ולהסיר לאט מעל 10 s כדי למנוע דליפה.</li>
</ol>5. יישום נוגדנים
<ol><li>לדגור על המדגם בפתרון 3 במשך יומיים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.</li>
	<li>לדגור על המדגם בפתרון 4 במשך יומיים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן ראשוני במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.</li>
	<li>יש לשטוף בתמיסה 2 למשך 5 פעמים, תוך כדי הדגירה של שעה אחת לכביסה. יש לאחסן בפתרון 2 ב-RT למשך הלילה.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן משני במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.</li>
	<li>לשטוף בתמיסה 2 במשך 5 פעמים, דגירה 1 שעה לכל לשטוף; יש לאחסן בפתרון 2 ב-RT למשך הלילה. הערה: כל השלבים מ- 5.6 ואילך, כולל אחסון סופי, צריכים להתרחש באור נמוך. צינורות מדגם ניתן להגן עם רדיד אלומיניום. הריכוזים המשמשים לנוגדנים בפרוטוקול זה היו: TH בשעה 1: 100, איבה1 בשעה 1: 200, ואת הנוגדן המשני בשעה 1: 100. הוסף פתרון נוסף 2 לשלבים 5.1-5.6 כדי להבטיח שצינורות מלאים לחלוטין.</li>
</ol>6. ניקוי רקמות
<ol><li>לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>לדגור על המדגם ב 100% מתנול עבור 1 שעה ב RT.</li>
	<li>דגירה טרי 100% מתנול לילה ב RT.</li>
	<li>דגירה ב 66% DCM / 33% מתנול במשך 3 שעות, עם רועד, בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה באתר דיבנזיל (DBE) מבלי לרעוד. השאר את המדגם ב- DBE עד ניקוי ולאחסן ב- DBE עד הדמיה.</li>
</ol>7. הרכבה
<ol><li>קבל תא מודפס בתלת-ממד העשוי משרף קריסטל Visijet M3 (תבניות הזמינות באתר האינטרנט idisco.info).</li>
	<li>אבטחו את התא לשקופית מיקרוסקופ באמצעות אפוקסי.</li>
	<li>מניחים את הדגימה בחלל המרובע באמצע התא.</li>
	<li>מלא את התא לחלוטין עם DBE.</li>
	<li>מניחים כיסוי בעובי 0.17 מ"מ מעל התא ומפעילים לחץ עד שלכיסוי יש מגע מלא עם קירות התא.</li>
	<li>אוטמים את קצות כיסויי הכיסוי לתא באמצעות האפוקסי.</li>
	<li>סובבו את התא כדי לאפשר לבועות אוויר לברוח ממפרצון המילוי.</li>
	<li>מלא את התא ב- DBE נוסף.</li>
	<li>לאטום את מפרצון המילוי עם אפוקסי ולאפשר לרפא. הערה: עודף DBE יישפך במהלך הרכבה.</li>
</ol>8. הדמיה
<ol><li>השתמש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלית כדי לבצע סריקת z בהגדלה פי 4 (ראה וידאו תלת-ממדיהמצורף ).</li>
	<li>להשיג עירור פלואורסצנטי של המדגם באמצעות ערכת לייזר לפלוט אורך גל דומה לאורך הגל שצוין על ידי הנוגדן המשני. עירור TH הושג תוך שימוש בערכת לייזר HeNe לפלוט ב 632 ננומטר.</li>
	<li>הגדר את הגלאי אורך גל קרוב לפליטת הלייזר. עבור הפרוטוקול הנוכחי, הגלאי עבור TH הוגדר 650 ננומטר.</li>
	<li>להעלות את הרווח של הגלאי עד שיש אות גלוי. הרווח של 650LP לתמונות נקבע על 7.50 B.</li>
	<li>באמצעות האפשרות סריקה בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית, הזז את שלב המיקרוסקופ עד שהדגימה מובאת למוקד.</li>
	<li>נווט סביב הרקמה בכל המישורים וקבל תמונות בודדות או תמונות z-stack באמצעות תוכנת ההדמיה הקונפוקלית.</li>
	<li>לאחר השלמת ההדמיה, הסר את הדגימה מהתא. מניחים אותו בחזרה לתוך צינור מלא לחלוטין עם DBE ולאחסן ב RT במקום חשוך, רצוי מכוסה בנייר אלומיניום. הערה: ניתן טען מחדש ותמונה של דגימות כל עוד אות פלורסנס עדיין חזק.</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298(2020).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li>
<li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li>
<li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens%3A+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).</li>
<li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins%2C+Tat+and+gp120%2C+target+the+developing+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li>
<li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404(2017).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152(2018).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurovirology%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li>
<li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li>
<li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braking+dopamine+systems%3A+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li>
<li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).</li>
<li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li>
<li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy%3A+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13(2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
</ol>

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

ניקוי רקמות מציע פתרון למגבלות של פרוטוקול IHC המסורתי. מדגם שקוף ממזער את הפיזור והספיגה של האור, המספק גישה אופטית ברמה התאית לרקמות שלמות18,19. טכניקות ניקוי רקמות הופכות רקמה לשקופה באמצעות התלזות, דה-צבע ופירוק הסתיידות עם ניהול ממסים. לאחר אינדקס שבירה של דגימת הרקמה תואם את האינדקס שבירה של מדיום ההדמיה שנבחר, המדגם ייראה שקוף לחלוטין וניתן לדמיין כראוי3. הפרוטוקול ההידרופובי הנוכחי מסיר מים מהרקמה בשלבי ההתייבשות הראשוניים, ובכך מפ...

מספר טכניקות לניקוי רקמות אומתו לשימוש במוח: הידרוג'ל, הידרופילי והידרופובי. טכניקות אלה שואפות להפוך רקמה לשקופה באמצעות התלזות, דה-צבע ופירוק באמצעות ניהול ממסים. לאחר אינדקס שבירה של דגימת הרקמה תואם את האינדקס שבירה של מדיום ההדמיה שנבחר, ניתן להשיג תמונה ברורה של המדגם. טכניקות מבוססות הידרוג'ל, כגון CLARITY, ביומולקולים מאובטחים ברקמה על ידי קישורם הידרוג'לים מבוססי אקריל, המונע נזק מבני ואובדן חלבונים1. עם זאת, טכניקות הידרוג'ל להשתמש כימיקלים קשים מאשר יש פוטנציאל לפגוע רקמות שבירות יותר, ודגימות רקמות צפופות יותר לא יכול להיות תואם פרוטוקול הידרוג'ל. טכניקות הידרוג'ל מסוימות עשויות לדרוש ציוד יקר או להוביל להרחבת רקמות. טכניקות הידרופיליות, כמו CUBIC, לשמר מבנה 3D באמצעות היווצרות של קשרי מימן בתוך הרקמה2. הרחבת רקמות יכולה להתרחש גם בפרוטוקול הידרופילי מסוים. יכולת הסליקה של טכניקות הידרופיליות לעתים קרובות אינה תואמת את היכולת שיש לטכניקות הידרופוביות, החשובה לרקמות צפופות ועבות יותר3.
טכניקות הידרופוביות הן בדרך כלל מהירות, אינן דורשות ציוד מיוחד, ומייצרות מדגם שקל לטפל בו ולאחסן. iDISCO היא טכניקה הידרופובית שמבטלת את ההתכווצות שיכולה להתרחש בפרוטוקול הידרופובי אחר. במקור, טכניקת ניקוי הרקמות iDISCO תוארה על ידי Renier et al.4 עבור העוברים ואיברים צפופים, מבוגרים של עכברים. טכניקה זו מסירה מים מהרקמה בשלב ההתייבשות הראשוני, ובכך מפחיתה את פיזור האור. הרקמה מחלחלת במהלך טיפול מקדים כדי לאפשר חדירת נוגדנים עמוקה. אלכסה פלור צבעים בספקטרום האדום הרחוק משמשים אימונולאבלינג כדי למנוע autofluorescence של הרקמה באורכי גל נמוכיםיותר 5. רקמה שעברה פרוטוקולי סליקה הידרופוביים ניתן לטפל בקלות וניתן לדמיין מספר פעמים בשל אריכות הימים של צבעי Alexa Fluor. אם מאוחסן כראוי, רקמות יכול לספק תמונות במשך חודשים עד שנה לאחר העיבוד הראשוני.
בפרוטוקול הנוכחי, נוגדן טירוסין הידרוקסילאז (TH), נוגדן Iba1, ו Cholera רעלן Subunit B (CTB) שימשו הן על שליטה זכרית ונקבה והן HIV-1 מהונדס (Tg) מוחות חולדה. חולדת HIV-1 Tg מחזיקה בשבעה מתוך תשעת הגנים המרכיבים את הגנום הנגיפי HIV-1, מה שמוביל למודל לא זיהומי של חשיפה ארוכת טווח לחלבון HIV-16,7,8. שינויים דופאמין הוכחו בעבר בחולדה HIV-1 Tg, ו- HIV-1 עצמו היא מחלה דלקתית, ולכן בחירת הנוגדנים הייתה רלוונטית לעיצוב הניסיוני9,10,11,12. CTB הוא נותב המתחבר לנוירונים באמצעות כריכת גנגליוסיד וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תחזיות חיוביות במוח. CTB שימש בעבר כדי ללמוד תחזיות מגרעין האקומבנס לאזור הסובסטנציה ניגרה, שני אזורים במוח המעורבים בכבדות עם מסלולים דופאמין13,14,15.
בפרוטוקול זה, TH ישמש סמן לייצור דופמין, ו Iba1 יסמן מיקרוגליה פעילה. נוגדן TH המשמש באופן סלקטיבי תוויות רצועה אחת בכ 62 kDa התואם טירוצין הידרוקסילאז. הנוגדן Iba1 מתאים לרצף מסוף קרבוקסי Iba1. שני הנוגדנים גדלו בארנב והיו פוליקלונליים. CTB ישמש למעקב מדרדר של נוירונים מאזור גרעין האקומבנס לאזור הסובסטנציה ניגרה. הפרוטוקול הנוכחי מציע גם קו מנחה להתאמת פרוטוקול iDISCO המקורי בשתי דרכים נפרדות: 1) הפחתה כוללת של כתמי הרקע על ידי שינוי ריאגנטים בסרום בשלבי החסימה, ו -2) שינוי קנה המידה של זמן הדגירה כך שיתאימו לדגימות רקמות גדולות יותר. בסך הכל, הפרוטוקול הנוכחי מספק ראיות מתמשכות לכך שטכניקות סליקה הידרופוביות אפשריות ברקמות המוח של החולדה, אין להן אינטראקציות מזיקות ניכרות עם חלבונים ויראליים HIV-1, והן תואמות לנוגדן TH, נוגדן Iba1 ו- CTB.

<table><tbody><tr><td>תת-יחידה B של רעלן כולרה (רקומביננטי), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>פישר כימי</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>סיגמא מדעי החיים</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני Iba1</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil אפוקסי</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>מכונת זלוף</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>מיני משאבה זרימה משתנה</td></tr><tr><td>PFA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH נוגדן ראשוני</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

שיטות ניקוי רקמות הידרופוביות ניתנות להתאמה בקלות, מהירות ובעלות נמוכה המאפשרות לחקור מולקולה של עניין בדגימות רקמות ללא לשינוי. הליכי אימונולאבלילינג מסורתיים דורשים חיתוך המדגם לחלקים דקים, מה שמגביל את היכולת לתייג ולבחון מבנים שלמים. עם זאת, אם רקמת המוח יכולה להישאר שלמה במהלך העיבוד, מבנים ומעגלים יכולים להישאר שלמים לניתוח. שיטות הסליקה שנקבעו בעבר לוקחות זמן משמעותי לנקות את הרקמה לחלוטין, והכימיקלים הקשים יכולים לעתים קרובות לפגוע בנוגדנים רגישים. שיטת iDISCO מנקה רקמות במהירות ובצורה מלאה, תואמת לנוגדנים רבים, ואינו דורש ציוד מעבדה מיוחד. טכניקה זו אומתה בתחילה לשימוש ברקמת עכברים, אך הפרוטוקול הנוכחי מתאים שיטה זו לחצי הכדורים של שליטה ומוחות חולדה מהונדסים. בנוסף לכך, הפרוטוקול הנוכחי מבצע גם מספר התאמות לפרוטוקול הקיים כדי לספק תמונות ברורות יותר עם פחות כתמי רקע. נוגדנים עבור איבה-1 ו טירוצין הידרוקסילאז אומתו בחולדה מהונדסת HIV-1 ובחולדות בקרה F344/N בשיטת ניקוי הרקמות ההידרופובית הנוכחית. המוח הוא רשת שזורה, שבה מבנים פועלים יחד לעתים קרובות יותר מאשר בנפרד זה מזה. ניתוח המוח כמערכת שלמה בניגוד לשילוב של חלקים בודדים הוא היתרון הגדול ביותר של כל שיטת ניקוי המוח הזו.

ניקוי מלא של חלקים גדולים של F344/N ו- HIV-1 רקמת מוח חולדה הושג באמצעות פרוטוקול ניקוי רקמות הידרופוביות זה שונה. איור 1 מציג תמונה קונפוקלית טיפוסית עבור TH באזור הסובסטנציה ניגרה. איור 1A מייצג כתמים צפופים וחיוביים. אזורים צפופים כגון אלה ניתן לנתח על ידי התמקדות דרך מישור "Z" כדי לאשר כתמים חיוביים מורפולוגיה תאים נכונה. איור 1B מייצג כתמים חיוביים דלילים, שניתן לזהותם על ידי המורפולוגיה הייחודית של תאי העצב TH. <strong class="...

כאן אנו מציגים שיטת ניקוי רקמות הידרופובית המאפשרת צפייה במולקולות יעד כחלק ממבני מוח שלמים. טכניקה זו אומתה כעת לשליטה F344/N ו- HIV-1 חולדות מהונדסות משני המינים.

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

המטרה הכוללת של טכניקת ניקוי זו היא לבסס שיטת ניקוי רקמות למוח החולדה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור חולדה טרנסגנית HIV-1. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשאיר את רקמת המוח של החולדה שלמה לניקוי ובכך לאפשר ניתוח ברמת המעגל המלא.מי שתדגים את ההליך יהיו קריסטין קירשנר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי, וגם היילונג לי, עמית מחקר מהמעבדה שלי. לאחר ביצוע זלוף דרך הלב בחולדה בת שלושה עד שישה שבועות, הסר את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים. לאחר מכן הניחו אותו במצב סגיטלי וחתכו אותו לארבעה חלקים שווים ברוחב שלושה מילימטרים באמצעות סכין גילוח ומטריצת מוח של חולדה.תקן כל חלק בארבעה אחוז PFA בצינור פלסטיק אטום של חמישה מיליליטר למשך הלילה על שייקר בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, המשיכו בקיבוע בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו כל חלק שלוש פעמים עם PBS למשך כ-30 דקות בכל כביסה.דגרו באופן סדרתי את החלקים השטופים בתמיסת מתנול של 20, 40, 60, 80 ו-100% למשך שעה כל אחד. חזור על ההתייבשות עם 100% מתנול. לאחר מכן מצננים את הדגימות ב-100% מתנול בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.הכינו תמיסה המכילה 66% DCM ו-33% מתנול ודגרו את החלקים המצוננים בתמיסה זו למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם ניעור. למחרת, שטפו את הדגימה פעמיים עם מתנול למשך 30 דקות וצננו אותה ב-100% מתנול בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להלבנה, הניחו את הדגימה במי חמצן טריים של חמישה אחוזים במתנול ודגרו אותה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה של הלילה, דגרו את הדגימה באופן סדרתי בתמיסות מתנול של 80, 60, 40 ו-20% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את הדגימה ב-PBS למשך שעה ושטפו אותה פעמיים בתמיסה, אחת למשך שעה לכל כביסה. מלאו מזרק של מיליליטר אחד ב-2.5 מיקרוליטר של אחוז אחד ביוטין-CTB והזריקו אותו לאט לאתר גרעין האקומבנס במשך 20 שניות.השאירו את קצה המחט במקומו למשך דקה אחת והוציאו אותו לאט במשך 10 שניות כדי למנוע דליפה. דגרו את הדגימה בתמיסה שלוש ולאחר מכן בתמיסה ארבע למשך יומיים כל אחד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו את הנוגדן הראשוני והמשיכו בדגירה במשך שבעה ימים.שטפו את הדגימה חמש פעמים בתמיסה שתיים למשך שעה לכל שטיפה ואחסנו אותה בתמיסה שתיים בטמפרטורת החדר למשך הלילה. דגרו את הדגימה עם נוגדן משני למשך שבעה ימים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, שטפו אותו חמש פעמים בתמיסה שתיים למשך שעה אחת לכל שטיפה ואחסנו אותו בתמיסה שתיים בטמפרטורת החדר למשך הלילה בתאורה חלשה.דגרו את הדגימה באופן סדרתי ב-20, 40, 60, 80 ו-100% מתנול למשך שעה אחת כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו אותו ב-100% מתנול טרי למשך הלילה. למחרת, דגרו את הדגימה ב-66% DCM טרי ב-33% מתנול למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר עם ניעור.לאחר שלוש שעות, דגרו את הדגימה באתר דיבנזיל מבלי לנער עד שהיא צלולה. לאחר מכן אחסן אותו באתר דיבנזיל עד להדמיה. השג תא מדפסת תלת מימד ואבטח אותו לשקופית מיקרוסקופ באמצעות אפוקסי.הנח את הדגימה בחלל המרובע באמצע החדר ומלא לחלוטין את החדר באתר דיבנזיל. הנח החלקת כיסוי בעובי 0.17 מילימטר מעל החדר והפעל לחץ כדי להבטיח שהוא נמצא במגע מלא עם קירות החדר. ואז אוטמים את הקצוות באמצעות אפוקסי.הקפד לסובב את החדר כדי לאפשר לבועות אוויר לברוח מכניסת המילוי. מלאו את החדר באתר דיבנזיל נוסף. לאחר מכן אטמו את כניסת המילוי באפוקסי ואפשרו לו להתרפא.התבונן בדגימה באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי לביצוע סריקת z בהגדלה פי ארבעה. התמונה הקונפוקלית של דגימת רקמה מנוקה הידרופובית בהגדלה של פי ארבעה מראה צביעת TH צפופה באזור החומר השחור, נוירוני TH דלילים הסמוכים לחומר השחור, ואזור שחור כהה של רקמה חסר נוירונים TH. מורפולוגיה אופיינית של נוירון חיובי ל-TH בהגדלה פי 20 כוללת סומה גדולה ומספר תהליכי הסתעפות.ואילו למיקרוגליה המוכתמת ב-IBA1 יש גופי תאים קטנים ותהליכי הארכה קצרים יותר. התמונה הקונפוקלית האידיאלית מציגה צביעת TH חיובית וצפופה באזור החומר השחור עם רווח פלואורסצנטי מתאים. דוגמאות לתמונות קונפוקליות גרועות כוללות תמונה ממוקדת בצורה לא נכונה עם עלייה פלואורסצנטית רבה מדי, צביעה חיובית כוזבת עם נקודות בהירות שאינן ממוקדות עם שאר הרקמה, וכתמים גבוהים ברקע כתוצאה משימוש בסרום חוסם שאינו תואם לנוגדנים משניים.צביעת CTB חיובית במוח החולדה מוצגת כאן. הסיבים הדקים הארוכים הם בליטות מגיעות לאורך המסלול הדופמינרגי קולוקליזציה של TH ו-CTB מאפשרת לדמיין את אתר ההזרקה באזור גרעין האקומבנס המופיע כעיגול ירוק פלואורסצנטי צפוף.קולוקליזציה של TH ו-CTB בחומר השחור מוצגת כאן. הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בניסיון הליך זה הם לאפשר לדגימה מספיק זמן לדגור בכל תמיסות הנוגדנים והרבה זמן לנקות לחלוטין לפני ההדמיה. לדגימה צריכה להיות חשיפה מוגבלת לאוויר מכיוון שהדבר יפגע בדגימה.השיטה הזו היא רב-תכליתית מאוד, וניתן להשתמש בה כדי לחקור חלבונים רבים ושונים שמעניינים אותם באזורים שונים במוח. הטכניקה הנוכחית עוזרת לסלול את הדרך למדעני מוח לחקור את מוח החולדה ברמת המעגל החיוני לחקר המוח כמערכת שלמה.

a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מתאר את הליך צביעת 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium כלוריד כדי לדמיין פרוסות רקמת מוח של חולדה ולהבדיל רקמות בנות קיימא ופגומות לאחר חסימה ורפרפוזיה של עורק המוח האמצעי.

צביעת TTC של פרוסות רקמת מוח חולדה: הליך צביעה להבדיל בין רקמה בת קיימא ונמקית בפרוסות רקמה לאחר פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה

סרטון זה מדגים את תהליך בידוד כלי הדם במוח מחולדות שעברו המתת חסד. הוא כולל דיסקציה של המוח, ניקוי הרקמה, ועיכול מכני, ואחריו צנטריפוגה חוזרת ונשנית כדי לבודד את החלק הטהור של microvessels.

שיטה לבידוד יחידות נוירו-וסקולריות ממוח חולדה

מקור: Kirchner, K.N., et al., שיטה לניקוי רקמות הידרופוביות לרקמת מוח של חולדות. J. Vis. Exp. (2020). סרטון זה מדגים את השיטה לניקוי רקמות הידרופוביות של דגימת רקמת מוח של חולדה. הדגימה מיובשת ברצף במתנול, מטופלת בתערובת דיכלורומתאן ומתנול להמסת שומנים ופיגמנטים, ומועברת לאתר דיבנזיל לניקוי רקמות מלא, המאפשר הדמיה מפורטת ללא חתך דק.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לדגימת רקמת מוח של חולדה

חסימת עורק תרדמה דו צדדית בשילוב עם ירידה בלחץ דם מערכתי מייצרת איסכמיה המוחית העולמית בחולדה, וכתוצאה מכך לנזק ליפוקמפוס בחומרה לשחזור. נושאי בעלי החיים הם לקויים עם דפוסים צפויים של נזק מוחי, הם להתאושש expediently, ושיעורי תמותה הם נמוכים יחסית.

ספיגה של 2 כלי השיט / תת לחץ דם: מודל עכברוש של איסכמיה המוח הגלובלית

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי ומפורט לצביעה חיסונית כפולה בחלקי רקמת מערכת העצבים המרכזית של חולדה (CNS) ובלוטות הלימפה ההיקפית (LN) קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

כדי להבין את המבנה של רשתות נוירונים, אפיון פונקציונלי וצורני של נוירונים בודדים הוא הכרח. הנה, אנחנו מדגימים תיוג juxtasomal biocytin, המאפשר הקלטות אלקטרו בתצורה תאית, ועם זאת שמירה על היכולת לתייג את הנוירון לפוסט הוק שחזור של הדנדריטים ואדריכלות אקסון intracellularly.

Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים

מוצג פרוטוקול לסובלימציה של מטריצת DAN על רקמת מוח של חולדה לזיהוי גנגליוזידים באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית MALDI.

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.

שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels

אנו מציגים פרוטוקול להקמת מודל דימום פונטין מסיבי בחולדה באמצעות הזרקה כפולה של דם אוטולוגי.

דימום פונטין מסיבי על ידי הזרקה כפולה של דם אוטולוגי

מורפולוגיה דנדריטית עצבית לעתים קרובות עומדת בבסיס התפקוד. ואכן, תהליכי מחלה רבים המשפיעים על התפתחות הנוירונים באים לידי ביטוי עם פנוטיפ מורפולוגי. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ורבת עוצמה לניתוח ארבורים דנדריטיים שלמים ואת קוציהם הקשורים.

הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY

מחקר זה מציג פרוטוקול לחילוץ והכנה של דגימות מוח וחוט שדרה שלם עם אותות פלואורסצנטיים משומרים, המשפר את יעילות הניסוי ושלמות הנתונים כדי לקדם את המחקר במדעי המוח.

מיצוי וניקוי רקמות הכנת דגימות מוח-חוט שדרה של עכברים

למד שיטת ניקוי הידרופובית לרקמת מוח חולדה לניתוח מעגלים עצביים שלמים. הטכניקה שומרת על שלמות הרקמה ומאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של מבנים מולקולריים במוח עכברוש.

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

גלה סרטונים נוספים