שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה
23 בדצמבר 2020
כאן אנו מציגים שיטת ניקוי רקמות הידרופובית המאפשרת צפייה במולקולות יעד כחלק ממבני מוח שלמים. טכניקה זו אומתה כעת לשליטה F344/N ו- HIV-1 חולדות מהונדסות משני המינים.
המטרה הכוללת של טכניקת ניקוי זו היא לבסס שיטת ניקוי רקמות למוח החולדה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור חולדה טרנסגנית HIV-1. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשאיר את רקמת המוח של החולדה שלמה לניקוי ובכך לאפשר ניתוח ברמת המעגל המלא.
מישתדגים את ההליך יהיו קריסטין קירשנר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי, וגם היילונג לי, עמית מחקר מהמעבדה שלי. לאחר ביצוע זלוף דרך הלב בחולדה בת שלושה עד שישה שבועות, הסר את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים. לאחר מכן הניחו אותו במצב סגיטלי וחתכו אותו לארבעה חלקים שווים ברוחב שלושה מילימטרים באמצעות סכין גילוח ומטריצת מוח של חולדה.
תקן כל חלק בארבעה אחוז PFA בצינור פלסטיק אטום של חמישה מיליליטר למשך הלילה על שייקר בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, המשיכו בקיבוע בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו כל חלק שלוש פעמים עם PBS למשך כ-30 דקות בכל כביסה.
דגרו באופן סדרתי את החלקים השטופים בתמיסת מתנול של 20, 40, 60, 80 ו-100% למשך שעה כל אחד. חזור על ההתייבשות עם 100% מתנול. לאחר מכן מצננים את הדגימות ב-100% מתנול בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
הכינו תמיסה המכילה 66% DCM ו-33% מתנול ודגרו את החלקים המצוננים בתמיסה זו למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם ניעור. למחרת, שטפו את הדגימה פעמיים עם מתנול למשך 30 דקות וצננו אותה ב-100% מתנול בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להלבנה, הניחו את הדגימה במי חמצן טריים של חמישה אחוזים במתנול ודגרו אותה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה של הלילה, דגרו את הדגימה באופן סדרתי בתמיסות מתנול של 80, 60, 40 ו-20% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את הדגימה ב-PBS למשך שעה ושטפו אותה פעמיים בתמיסה, אחת למשך שעה לכל כביסה. מלאו מזרק של מיליליטר אחד ב-2.5 מיקרוליטר של אחוז אחד ביוטין-CTB והזריקו אותו לאט לאתר גרעין האקומבנס במשך 20 שניות.
השאירו את קצה המחט במקומו למשך דקה אחת והוציאו אותו לאט במשך 10 שניות כדי למנוע דליפה. דגרו את הדגימה בתמיסה שלוש ולאחר מכן בתמיסה ארבע למשך יומיים כל אחד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו את הנוגדן הראשוני והמשיכו בדגירה במשך שבעה ימים.
שטפו את הדגימה חמש פעמים בתמיסה שתיים למשך שעה לכל שטיפה ואחסנו אותה בתמיסה שתיים בטמפרטורת החדר למשך הלילה. דגרו את הדגימה עם נוגדן משני למשך שבעה ימים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, שטפו אותו חמש פעמים בתמיסה שתיים למשך שעה אחת לכל שטיפה ואחסנו אותו בתמיסה שתיים בטמפרטורת החדר למשך הלילה בתאורה חלשה.
דגרו את הדגימה באופן סדרתי ב-20, 40, 60, 80 ו-100% מתנול למשך שעה אחת כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו אותו ב-100% מתנול טרי למשך הלילה. למחרת, דגרו את הדגימה ב-66% DCM טרי ב-33% מתנול למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר עם ניעור.
לאחר שלוש שעות, דגרו את הדגימה באתר דיבנזיל מבלי לנער עד שהיא צלולה. לאחר מכן אחסן אותו באתר דיבנזיל עד להדמיה. השג תא מדפסת תלת מימד ואבטח אותו לשקופית מיקרוסקופ באמצעות אפוקסי.
הנח את הדגימה בחלל המרובע באמצע החדר ומלא לחלוטין את החדר באתר דיבנזיל. הנח החלקת כיסוי בעובי 0.17 מילימטר מעל החדר והפעל לחץ כדי להבטיח שהוא נמצא במגע מלא עם קירות החדר. ואז אוטמים את הקצוות באמצעות אפוקסי.
הקפד לסובב את החדר כדי לאפשר לבועות אוויר לברוח מכניסת המילוי. מלאו את החדר באתר דיבנזיל נוסף. לאחר מכן אטמו את כניסת המילוי באפוקסי ואפשרו לו להתרפא.
התבונן בדגימה באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי לביצוע סריקת z בהגדלה פי ארבעה. התמונה הקונפוקלית של דגימת רקמה מנוקה הידרופובית בהגדלה של פי ארבעה מראה צביעת TH צפופה באזור החומר השחור, נוירוני TH דלילים הסמוכים לחומר השחור, ואזור שחור כהה של רקמה חסר נוירונים TH. מורפולוגיה אופיינית של נוירון חיובי ל-TH בהגדלה פי 20 כוללת סומה גדולה ומספר תהליכי הסתעפות.
ואילו למיקרוגליה המוכתמת ב-IBA1 יש גופי תאים קטנים ותהליכי הארכה קצרים יותר. התמונה הקונפוקלית האידיאלית מציגה צביעת TH חיובית וצפופה באזור החומר השחור עם רווח פלואורסצנטי מתאים. דוגמאות לתמונות קונפוקליות גרועות כוללות תמונה ממוקדת בצורה לא נכונה עם עלייה פלואורסצנטית רבה מדי, צביעה חיובית כוזבת עם נקודות בהירות שאינן ממוקדות עם שאר הרקמה, וכתמים גבוהים ברקע כתוצאה משימוש בסרום חוסם שאינו תואם לנוגדנים משניים.
צביעת CTB חיובית במוח החולדה מוצגת כאן. הסיבים הדקים הארוכים הם בליטות מגיעות לאורך המסלול הדופמינרגי קולוקליזציה של TH ו-CTB מאפשרת לדמיין את אתר ההזרקה באזור גרעין האקומבנס המופיע כעיגול ירוק פלואורסצנטי צפוף.
קולוקליזציה של TH ו-CTB בחומר השחור מוצגת כאן. הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בניסיון הליך זה הם לאפשר לדגימה מספיק זמן לדגור בכל תמיסות הנוגדנים והרבה זמן לנקות לחלוטין לפני ההדמיה. לדגימה צריכה להיות חשיפה מוגבלת לאוויר מכיוון שהדבר יפגע בדגימה.
השיטה הזו היא רב-תכליתית מאוד, וניתן להשתמש בה כדי לחקור חלבונים רבים ושונים שמעניינים אותם באזורים שונים במוח. הטכניקה הנוכחית עוזרת לסלול את הדרך למדעני מוח לחקור את מוח החולדה ברמת המעגל החיוני לחקר המוח כמערכת שלמה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית להבהרה הידרופובית של רקמות לצורך הדמיה של מולקולות מטרה במבני מוח שלמים, תוך התמקדות ספציפית במוח של חולדה, כולל מודלי ביקורת F344/N ומודלים טרנסגניים של HIV-1. הטכניקה מאפשרת ניתוח מלא ברמת המעגלים על ידי שמירה על שלמות רקמת המוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- שיטות להשקיפות רקמות
- מדעי המוח
- טכניקות לדימיון המוח
רקע
- טכניקות הבהרה (Clearing) משפרות את הוויזואליזציה של מבנים מולקולריים.
- שיטות קיימות פוגעות לעיתים קרובות בשלמות הרקמה.
- חקירת ארכיטקטורת המוח השלמה היא קריטית לניתוח ברמת המעגל.
- השיטה מתאימה לדגמי חולדה שונים, כולל כאלה הרלוונטיים למחקר על HIV.
מטרת המחקר
- תיקוף של פרוטוקול הבהרה הידרופובית עבור מוח של חולדה.
- מתן אפשרות لديמוי ברזולוציה גבוהה של מעגלים עצביים.
- סבסוד של אפיון מולקולרי של מבני מוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המחקר עושה שימוש בשיטת שקיפות הידרופובית המותאמת לרקמות מוח של חולדה.
- המודלים הביולוגיים הם חולדות בקרה מסוג F344/N וחולדות טרנסגניות ל-HIV-1.
- הפרוטוקול כולל פרפוזיה טרנסקרדיאלית, חיתוך, דהידרציה וסימון באמצעות נוגנים.
- שלבים קריטיים כוללים מספר סבבי אינקובציה וטיפול זהיר בדגימות כדי למנוע נזק.
- הדמיה מבוצעת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי לניתוח מבנים נוירונליים צבועים.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מבצעת בהצלחה שקיפות של רקמת המוח תוך שמירה על השלמות המולקולרית.
- הושגה ויזואליזציה ברורה של צביעת tyrosine hydroxylase (TH) ושל סממנים נוירונליים אחרים.
- קולוקליזציה של CTB ו-TH סיפקה תובנות לגבי המסלולים הדופמינרגים.
- תיקוף השיטה מראה את הרב-גוניות שלה למחקר של חלבוני מוח שונים.
מסקנות
- מחקר זה מדגים טכניקה חזקה לניתוח מעגלים מוחיים תוך שמירה על שלמות הרקמה.
- השיטה מאפשרת למדעני עצבים לחקור את הארכיטקטורה המורכבת והאינטראקציות המולקולריות של מוח החולדה.
- לממצאי המחקר עשויות להיות השלכות על הבנת מודלים של מחלות ועל הנוירוביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו להבהרה הידרופובית של רקמה מאפשרת ניתוח של מוח חולדה שלם למחקרים ברמת המעגל העצבי, ובכך היא תומכת בתיקוף של מטרות במיקוד למחלות ניווניות ומחלות זיהומיות. על ידי שמירה על שלמות הרקמה תוך מתן אפשרות להדמיה ברזולוציה גבוהה של סממנים מולקולריים, היא מפחיתה את הצורך בחיתוך רקמה ובארטיפקטים הנלווים לכך. גישה זו מספקת ערך ניבוי בהפחתת סיכונים של מטרות בשלב הפרה-קליני, על ידי כך שהיא מאפשרת פנוטיפינג של המוח כולו ומיפוי מסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של רקמות שלמות עבור מטרות חלבוניות כגון TH ו-Iba-1.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי שמירה על ההקשר המבני של מעגלים עצביים ואקטיבציה של מיקרוגליה.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי מתן אפשרות לניתוח השוואתי בין קבוצות ביקורת למודלים גנטיים של מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סריקת נוגדנים ומחקרי קולוקליזציה (colocalization) בהמשך התהליך.
- ערך תפעולי: שיפור הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות תהליכי שקיפות (clearing) והדמיה עקביים.
- סקילביליות (Scalability): מאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה על פני אזורי מוח ומטרות חלבון מרובות ללא צורך בחיתוך מחדש.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך בניתוח מערכות הרלוונטיות למחלה בחולדות טרנסגניות של HIV-1 לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- סנכרון פרה-קליני: מקשר בין תיקוף מטרות בשלב הגילוי להמשכיות פרה-קלינית באמצעות פנוטיפיזציה של המוח השלם.
- קבלת החלטות מותאמת סיכונים: מאפשר קידום מותאם לסממנים ביולוגיים על ידי ויזואליזציה של שינויים פתולוגיים במעגלים שלמים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות והבהרה של מסלולים ברקמת מוח שלמה, ובכך תומכת בזיהוי מועמדים פוטנציאליים (leads) באמצעות פנוטיפיקה ברמת המעגל.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי שמירה על השלמות המבנית במהלך ויזואליזציה של המטרה.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות שקיפות סטנדרטית וקריאות פלואורסצנציה כמותיות.
- אנליטיקה: מספקת פלטים מדידים כגון צפיפות צביעה וקו-לוקליזציה לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על שלמות הרקמה לצורך מעקב ארוך טווח אחר ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמת דימיון רב-פעמית עבור מטרות מרובות במודלים של מחלות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות ניתוח רקמה שלמה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) של נהלי שקיפות (clearing) בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות משופרת לגבי המשך הפרויקט (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מקיפה של מעורבות המטרה (target engagement).
- השפעה על תיק הפרויקטים: משפר את התיעדוף מותאם הסיכונים באמצעות יכולות סריקה פנוטיפית של המוח השלם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות, תיקוף נוגדנים והדמיה קונפוקאלית.
- תלוי בציוד מעבדה סטנדרטי הכולל מנערים, אינקובטורים ומיקרוסקופים קונפוקאליים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של זמני הפיCה (clearing), ריכוזי נוגדנים ופרוטוקולי שטיפה.
- כולל שיקולי התאמה עבור זני חולדות שונים, זוגות נוגדנים ואזורי מוח שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות לחשיפה לאוויר וצורך בסרומי חסימה (blocking sera) אופטימליים לצמצום הרקע.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
3:04
CTB-Cholera Toxin Subunit B Labeling and Antibody Application
5:02
Mounting the Sample for Imaging
7:39
Conclusion
0:46
Sample Preparation
1:36
Dehydration and Depigmentation
4:17
Tissue Clearing
5:59
Results: Confocal Images of the Hydrophobically Cleared Tissue Samples with Fluorescent Labelled TH Neurons and CTB Markers
