שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

המטרה הכוללת של טכניקת ניקוי זו היא לבסס שיטת ניקוי רקמות למוח החולדה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור חולדה טרנסגנית HIV-1. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשאיר את רקמת המוח של החולדה שלמה לניקוי ובכך לאפשר ניתוח ברמת המעגל המלא.

שתדגים את ההליך יהיו קריסטין קירשנר, דוקטורנטית מהמעבדה שלי, וגם היילונג לי, עמית מחקר מהמעבדה שלי. לאחר ביצוע זלוף דרך הלב בחולדה בת שלושה עד שישה שבועות, הסר את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים. לאחר מכן הניחו אותו במצב סגיטלי וחתכו אותו לארבעה חלקים שווים ברוחב שלושה מילימטרים באמצעות סכין גילוח ומטריצת מוח של חולדה.

תקן כל חלק בארבעה אחוז PFA בצינור פלסטיק אטום של חמישה מיליליטר למשך הלילה על שייקר בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, המשיכו בקיבוע בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו כל חלק שלוש פעמים עם PBS למשך כ-30 דקות בכל כביסה.

דגרו באופן סדרתי את החלקים השטופים בתמיסת מתנול של 20, 40, 60, 80 ו-100% למשך שעה כל אחד. חזור על ההתייבשות עם 100% מתנול. לאחר מכן מצננים את הדגימות ב-100% מתנול בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

הכינו תמיסה המכילה 66% DCM ו-33% מתנול ודגרו את החלקים המצוננים בתמיסה זו למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם ניעור. למחרת, שטפו את הדגימה פעמיים עם מתנול למשך 30 דקות וצננו אותה ב-100% מתנול בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להלבנה, הניחו את הדגימה במי חמצן טריים של חמישה אחוזים במתנול ודגרו אותה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה של הלילה, דגרו את הדגימה באופן סדרתי בתמיסות מתנול של 80, 60, 40 ו-20% למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את הדגימה ב-PBS למשך שעה ושטפו אותה פעמיים בתמיסה, אחת למשך שעה לכל כביסה. מלאו מזרק של מיליליטר אחד ב-2.5 מיקרוליטר של אחוז אחד ביוטין-CTB והזריקו אותו לאט לאתר גרעין האקומבנס במשך 20 שניות.

השאירו את קצה המחט במקומו למשך דקה אחת והוציאו אותו לאט במשך 10 שניות כדי למנוע דליפה. דגרו את הדגימה בתמיסה שלוש ולאחר מכן בתמיסה ארבע למשך יומיים כל אחד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו את הנוגדן הראשוני והמשיכו בדגירה במשך שבעה ימים.

שטפו את הדגימה חמש פעמים בתמיסה שתיים למשך שעה לכל שטיפה ואחסנו אותה בתמיסה שתיים בטמפרטורת החדר למשך הלילה. דגרו את הדגימה עם נוגדן משני למשך שבעה ימים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, שטפו אותו חמש פעמים בתמיסה שתיים למשך שעה אחת לכל שטיפה ואחסנו אותו בתמיסה שתיים בטמפרטורת החדר למשך הלילה בתאורה חלשה.

דגרו את הדגימה באופן סדרתי ב-20, 40, 60, 80 ו-100% מתנול למשך שעה אחת כל אחד בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו אותו ב-100% מתנול טרי למשך הלילה. למחרת, דגרו את הדגימה ב-66% DCM טרי ב-33% מתנול למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר עם ניעור.

לאחר שלוש שעות, דגרו את הדגימה באתר דיבנזיל מבלי לנער עד שהיא צלולה. לאחר מכן אחסן אותו באתר דיבנזיל עד להדמיה. השג תא מדפסת תלת מימד ואבטח אותו לשקופית מיקרוסקופ באמצעות אפוקסי.

הנח את הדגימה בחלל המרובע באמצע החדר ומלא לחלוטין את החדר באתר דיבנזיל. הנח החלקת כיסוי בעובי 0.17 מילימטר מעל החדר והפעל לחץ כדי להבטיח שהוא נמצא במגע מלא עם קירות החדר. ואז אוטמים את הקצוות באמצעות אפוקסי.

הקפד לסובב את החדר כדי לאפשר לבועות אוויר לברוח מכניסת המילוי. מלאו את החדר באתר דיבנזיל נוסף. לאחר מכן אטמו את כניסת המילוי באפוקסי ואפשרו לו להתרפא.

התבונן בדגימה באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי לביצוע סריקת z בהגדלה פי ארבעה. התמונה הקונפוקלית של דגימת רקמה מנוקה הידרופובית בהגדלה של פי ארבעה מראה צביעת TH צפופה באזור החומר השחור, נוירוני TH דלילים הסמוכים לחומר השחור, ואזור שחור כהה של רקמה חסר נוירונים TH. מורפולוגיה אופיינית של נוירון חיובי ל-TH בהגדלה פי 20 כוללת סומה גדולה ומספר תהליכי הסתעפות.

ואילו למיקרוגליה המוכתמת ב-IBA1 יש גופי תאים קטנים ותהליכי הארכה קצרים יותר. התמונה הקונפוקלית האידיאלית מציגה צביעת TH חיובית וצפופה באזור החומר השחור עם רווח פלואורסצנטי מתאים. דוגמאות לתמונות קונפוקליות גרועות כוללות תמונה ממוקדת בצורה לא נכונה עם עלייה פלואורסצנטית רבה מדי, צביעה חיובית כוזבת עם נקודות בהירות שאינן ממוקדות עם שאר הרקמה, וכתמים גבוהים ברקע כתוצאה משימוש בסרום חוסם שאינו תואם לנוגדנים משניים.

צביעת CTB חיובית במוח החולדה מוצגת כאן. הסיבים הדקים הארוכים הם בליטות מגיעות לאורך המסלול הדופמינרגי קולוקליזציה של TH ו-CTB מאפשרת לדמיין את אתר ההזרקה באזור גרעין האקומבנס המופיע כעיגול ירוק פלואורסצנטי צפוף.

קולוקליזציה של TH ו-CTB בחומר השחור מוצגת כאן. הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בניסיון הליך זה הם לאפשר לדגימה מספיק זמן לדגור בכל תמיסות הנוגדנים והרבה זמן לנקות לחלוטין לפני ההדמיה. לדגימה צריכה להיות חשיפה מוגבלת לאוויר מכיוון שהדבר יפגע בדגימה.

השיטה הזו היא רב-תכליתית מאוד, וניתן להשתמש בה כדי לחקור חלבונים רבים ושונים שמעניינים אותם באזורים שונים במוח. הטכניקה הנוכחית עוזרת לסלול את הדרך למדעני מוח לחקור את מוח החולדה ברמת המעגל החיוני לחקר המוח כמערכת שלמה.