Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקשר בין פוטנציאל הפעולה הספציפי לסוג התא בקליפת המוח החושית במהלך עיבוד המידע לזהות המורפולוגית של הנוירונים המוקלטים. זה מושג על ידי הכנה כירורגית ראשונה של החולדה להקלטות סומליות סמוכות. לאחר ההכנה, אלקטרודה מתעדת פעילות ספונטנית וחושית מעוררת, והנוירון המוקלט נטען ביוצידין באמצעות זרם וזריקות.

לאחר מכן, המוח מעובד לצביעה של ביוטין. לבסוף, הנוירון המלא בביוטין משוחזר דיגיטלית מהסעיפים הבאים לסיווג סוג התא. בסופו של דבר, הקלטות סומליות סמוכות של נוירונים בודדים מאפשרות לחקור עיבוד חושי ומידע מבני בתוך הרשת בקליפת המוח.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח כגון מה תפקידם של סוגי תאים ושכבות בודדות במהלך עיבוד חושי? בדרך כלל, אנשים זקוקים לשיטה זו יתקשו מכיוון שקל מאוד להרוג נוירונים במהלך הליך המילוי. הסיכוי למילוי ביוצידין מוצלח גדל על ידי הכנת פיפטות באיכות אופטימלית, ובנוסף, יש צורך בעין מיומנת כדי לשלוט בהזרקות זרם הפס הצר.

לכן, נדרש ניסיון כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של שחזור נוירונים מלאים היטב. כדי להתחיל, הניחו חולדת וויסטאר מורדמת על מסגרת סטריאוטקסית המצוידת בכרית חימום. אשר את עומק ההרגעה על ידי בדיקת רפלקס צביטת הבוהן.

לאחר מכן הכנס בדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הנכונה. אבטח את ראש החיה והסר שיער מאתר הניתוח. מרחו משחה על העיניים למניעת יובש.

המתן שלוש עד חמש דקות לאחר הזרקת לידוקאין במקום הניתוח והסר את העור המכסה את פני הגולגולת. לאחר מכן, נקה את כל הרקמה שנותרה ונקה את הגולגולת בהרחבה עם נסיעה של 0.9% נתרן כלורי. קבע את הקואורדינטות עבור קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית בהמיספרה השמאלית וסמן את המיקום על הגולגולת עם עט סמן עור כירורגי.

השתמש במקדחה דנטלית כדי לגרד את העצם מאזור העניין. המשיכו לגרד את העצם עד שהיא הופכת לשקופה וכלי הדם נראים בבירור. לאחר מכן, חותכים חלון קטן לגולגולת הדקה בעזרת אזמל.

הקפדה לא לפגוע בדורה מאטר ובכלי הדם. סמן את שולי הגולגולת באמצעות עט טוש עור כירורגי. כדי לשפר את הנראות, מרחו שכבה דקה של דבק סופר על הגולגולת היבשה, ולאחר מכן מלט דנטלי לבניית אמבטיה.

בסגירת הגולגולת, חתוך את השפם בצד הנגדי לחמישה מילימטרים בדיוק כדי לסייע בנראות שלהם. הדגישו את השפם הגזוז עם מסקרה שחורה לפני תחילת ההקלטות, הכינו פיפטות טלאים מזכוכית בורו סיליצ'יק. המורפולוגיה האידיאלית של פיפטה היא התחדדות דקה הדרגתית, זווית חרוט נמוכה וקוטר קצה פנימי של מיקרון אחד בערך.

טען את פיפטת התיקון עם צלצול ראד רגיל, בתוספת 2% ביוטין, והרכיב את פיפטת התיקון על מחזיק פיפטה, מקובעת לשלב ראש, ומחוברת למניפולטור מיקרום. כדי למקד באופן ספציפי את העמודה D שתי של חולדה S אחת, הגדר את הזווית של מחזיק האלקטרודה ל-34 מעלות ביחס למישור הסגיטלי. לאחר מכן, מקם את פיפטת התיקון בסמיכות לקרניוטומיה.

מלאו את האמבטיה ב-0.9% נתרן כלורי. כאשר המגבר במצב גשר, החל פולסים מרובעים עם הזרקת זרם חיובי כדי לקבוע את התנגדות האלקטרודה. התנגדות האלקטרודות האופטימלית היא בין שלושה לחמישה מגה.

קבע לחץ יתר של 100 עד 150 מיליבר וקדם את פיפטת התיקון בצעדים של מיקרון אחד תוך הפעלת זרם חיובי בצורה של פולסים מרובעים. עקוב אחר שינוי ההתנגדות החזק עם יצירת מגע עם הדורה מאטר. בשלב זה, הגדר את הקואורדינטות של המניפולטור המיקרו לאפס כדי לאפשר מדידות עומק מדויקות.

התקדמו במצב צעד מיקרון אחד עד שפיפטת התיקון חודרת לדורה מאטר המצוינת על ידי ירידה פתאומית בהתנגדות האלקטרודות. הסר את לחץ האחיזה של הפיפטה. לאחר מכן, חפש יחידות בודדות תוך כדי התקדמות בצעדים של מיקרון אחד.

עקוב אחר התנגדות האלקטרודה ברציפות על ידי הפעלת פולסים של 200 אלפיות השנייה על כיבוי ועלייה בהתנגדות האלקטרודה מצביעה בדרך כלל על קרבתו של נוירון בודד לקדם את האלקטרודה עד לפעולה חיובית. צורות גל פוטנציאליות של כשני מילי-וולט נרשמות. לחלופין, רשום פעילות זינוק ספונטנית וקבע את פעילות הזינוק של השפם על ידי הסטה קלה של שפם בודד באמצעות מכשיר חשמלי פיזו כדי להשיג תנאים אופטימליים למילוי סומלי סמוך.

קדם את האלקטרודה עד שההתנגדות תהיה 25 עד 35. למגה אוהם וקוצים יש משרעת של שלושה עד שמונה מילי-וולט כדי להתחיל את המילוי הסומלי הסמוך. החל פולסים של זרם מרובע חיובי החל מננו אמפר אחד.

הגדל לאט ובהדרגה את הזרם בשלבים של 0.1 ננו אמפר תוך ניטור הצורה והתדר של גל AP. עקוב אחר פתיחת הממברנה כעלייה ברורה בתדר AP במהלך שלב ההפעלה של דופק הבלוק צורת גל הספייק במהלך המילוי מראה רוחב מוגבר ומופחת לאחר היפרפולריזציה להגדיל או להקטין את הזרם בזמן המילוי כדי לשמור על עירוי ביוטין יציב, להפחית או לעצור את פעימות הזרם עם עלייה פתאומית של תדר ה-AP. כדי למנוע רעילות על ידי זרם עודף של יונים חוץ-תאיים כגון יוני נתרן.

חשוב לציין שכל נוירון יגיב אחרת להליך המילוי. לכן, יש להתאים את פרמטרי התיוג הסומלי הסמוכים בהתאם למצב ההקלטה. עקוב מקרוב אחר האות לאחר הפסקת הזרקת הזרם.

צורת גל הספייק לאחר סשן מילוי מורחבת בדרך כלל ומראה ירידה משמעותית לאחר היפרפולריזציה המתנה להתאוששות הנוירון, מה שניכר כאשר צורת הגל של הספייק חוזרת לתכונותיה המקוריות כדי להפחית כל לחץ מכני על התא. החזר את פיפטת המדבקה בצעדים של מיקרון אחד עד שמשרעת הספייק יורדת, המתן לפחות שעה עד שהביוטין יתפזר תוך תאי תוך ניטור מקרוב של טמפרטורת הגוף והנשימה של בעל החיים. לבסוף, דגימות מוח מתקבלות ומעובדות כדי לחשוף את איכות התיוג הסומלי הסמוך.

תמונות אלה מציגות תמונות של נוירונים מלאים בסמיכות בקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית. מבט משיקי זה של נוירון פרה-מתכתי מדגים את ההבדל בגודל בין דנדריטים לאקסונים. בשחזור דיגיטלי זה של נוירון סמוך, תמונת הקרנת הנוירונים מוצגת ברזולוציה גבוהה, אך בהגדלה נמוכה, ועם שחזור דיגיטלי אוטומטי על אקסון בכחול, דנדריט באדום בהתאמה.

כאן אזור התיבה מורחב כדי להראות את האקסון בוטון לכל אורך האקסון. באנימציה אחרונה זו, אנו מדגימים את צינור השחזור של שכבה אחת של חמישה נוירון פרמטאלי עבה מקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית של חולדה. הצינור כרוך בשחזור של מורפולוגיה דנדריטית ואקסונלית בהגדלה פי 100 וקווי מתאר חבית בהגדלה פי ארבעה.

התוצאה היא שחזור תלת מימד מלא, אשר נרשם לאחר מכן למסגרת ייחוס סטנדרטית לביצוע ניתוח כמותי של מאפיינים מורפולוגיים. לפיכך, תיוג סומלי צמוד in vivo מאפשר איכות תיוג יוצאת דופן לשחזור אמין של מורפולוגיה תלת מימדית מלאה. כאן הראינו את השיטה בבעלי חיים מורדמים אורטן.

עם זאת, ניתן להשתמש בהקלטות Jux Somal גם בבעלי חיים מרוסנים בראש ער כדי לחקור את תפקידם של סוגי תאים ושכבות בודדות במהלך חקירה פעילה של הסביבה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד לבצע תיוג ביוצידין על נוירונים בודדים לצורך זיהוי ושחזור מורפולוגי לאחר המלחמה.