Juxtasomal Biocytin תיוג לחקר קשר בין מבנה לתפקוד של פרט נוירונים קליפתיים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקשר בין פריקה של פוטנציאל פעולה הספציפית לסוג התא בקליפת המוח החושית במהלך עיבוד מידע, לבין הזהות המורפולוגית של הנוירונים שהוקלטו. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנה כירורגית של החולדה להקלטות juxtasomal. לאחר ההכנה, אלקטרודה מקליטה פעילות פריקה ספונטנית ופעילות המעוררת על ידי גירויים חושיים, והנוירון המוקלט נטען ב-biocidin באמצעות זרם והזרקות.

לאחר מכן, המוח עובר עיבוד לצורך צביעת ביוטין. לבסוף, הנוירון הממולא בביוטין משוחזר דיגיטלית מחתכים עוקבים לצורך סיווג סוג התא. בסופו של דבר, הקלטות juxtasomal של נוירונים בודדים מאפשרות את חקר העיבוד החושי והמידע המבני בתוך הרשת הקורטיקלית.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במדעי המוח, כגון מהו תפקידם של סוגי תאים ושכבות בודדות במהלך עיבוד חושי? באופן כללי, אנשים הזקוקים לשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, שכן קל מאוד להרוג נוירונים במהלך הליך המילוי. הסיכויים למילוי מוצלח באמצעות biocidin עולים על ידי הכנת פיפטות באיכות אופטימלית, ובנוסף, נדרשת עין מיומנת כדי לשלוט בהזרקות זרם בטווח צר.

לפיכך, נדרש ניסיון כדי להעלות את שיעור ההצלחה בהשגת נוירונים מלאים. ראשית, הנח חולדה מסוג wistar מורדמת על גבי מסגרת סטריאוטקסיס המצוידת במצע חימום. ודא את עומק הסדציה על ידי בדיקת רפלקס צביטה של בהונות.

לאחר מכן, הכניסו מדחום רקטלי כדי לשמור על טמפרטורת גוף תקינה. קבעו את ראשו של בעל החיים והסירו את הפרווה מאזור הניתוח. מרחו משחה על העיניים כדי למנוע התייבשות.

המתינו שלוש עד חמש דקות לאחר הזרקת lidocaine לאתר הניתוח והסירו את העור המכסה את פני הגולגולת. לאחר מכן, פנו את שאריות הרקמה ונקו את הגולגולת באופן יסודי עם 0.9% sodium chloride ride. קבעו את הקואורדינטות עבור קורטקס התחושה הראשוני (primary somatosensory cortex) בהמיספרה השמאלית וסמנו את המיקום על הגולגולת באמצעות טוש סימון כירורגי לעור.

השתמשו במקדח דנטלי כדי לגרד את העצם מאזור העניין. המשיכו לגרד את העצם עד שתהפוך לשקיפה וכלי דם יהיו גלויים בבירור. לאחר מכן, חתכו חלון קטן בגולגולת הדקה באמצעות סכין מנתחים (scalpel).

הקפידו לא לפגוע בקרומי המוח (dura mater) ובכלי הדם. סמנו את קצוות הקרניוטומיה באמצעות טוש לסימון עור כירורגי. כדי לשפר את הנראות, מרחו שכבה דקה של דבק מהיר (super glue) על הגולגולת היבשה, ולאחר מכן דבק שיניים לבניית אמבט.

בסגירת הקרניאוטומי, קצצ את השערות (whiskers) בצד הנגדי לאורך של בדיוק חמישה מילימטרים כדי לסייע בנראותן. סמן את השערות הקצוצות במסקרה שחורה לפני תחילת ההקלטות והכן פיפטות patch מזכוכית בורו-סיליקטית. המורפולוגיה האידיאלית של הפיפטה היא היתסרות הדרגתית ודקה, זווית קונוס נמוכה וקוטר קצה פנימי של כ-מיקרון אחד.

מלא את פפיפט הפאץ' (patch pipette) בתמיסת rad ringer רגילה, מועשרת ב-2% biotin, והרכב את פפיפט הפאץ' על מחזיק פפיפטים, המקובע לראש הבמה (head stage) ומחובר למיקרו-מניפולטור. כדי להתמקד באופן ספציפי בעמודה D2 של S1 בחולדה, הגדר את זווית מחזיק האלקטרודה ל-34 מעלות ביחס למישור השגי (sagittal plane). לאחר מכן, מקם את פפיפט הפאץ' בסמיכות רבה לקראניוטומיה.

מלאו את האמבט ב-0.9% sodium chloride. כאשר המגבר במצב גשר (bridge mode), הפילו פולסים מרובעים עם הזרקת זרם חיובית כדי לקבוע את התנגדות האלקטרודה. ההתנגדות האופטימלית של האלקטרודה נעה בין שלושה לחמישה מגה-אוהם.

צור לחץ יתר של 100 עד 150 millibar והנח את פיפטת התיקון (patch pipette) בפסעות של מיקרון אחד תוך הפעלת זרם חיובי בצורה של פולסים מרובעים. עקוב אחר השינוי המהותי בהתנגדות עם יצירת מגע עם הקרום העז (dura mater). בנקודה זו, אפס את קואורדינטות המיקרו-מניפולטור כדי לאפשר מדידות עומק מדויקות.

התקדמו במצב צעדים של מיקרון אחד עד שהפיפטה של ה-patch תחדור את הקשיה (dura mater), דבר שיבוא לידי ביטוי בירידה פתאומית בהתנגדות האלקטרודה. הסירו את לחץ ההחזקה של הפיפטה. לאחר מכן, חפשו יחידות בודדות תוך כדי התקדמות בצעדים של מיקרון אחד.

נטר את התנגדות האלקטרודה באופן רציף על ידי הפעלת פולסים של הדלקה וכיבוי למשך 200 millisecond; עלייה בהתנגדות האלקטרודה מעידה בדרך כלל על קרבה לנוירון בודד. העמק את האלקטרודה עד להקלטת גלי פוטנציאל פעולה חיוביים בעוצמה של כ-two millivolts. באופן רשות, הקלט פעילות של פריקות (spiking) ספונטנית וקבע את פעילות הפריקות המופעלת על ידי השפנת השפם על ידי הסטה מבוקרת של שפם בודד באמצעות מכשיר פייזו-אלקטרי, כדי להשיג תנאים אופטימליים למילוי ג'וקסו-סומטי (juxtasomal filling).

העמיקו את האלקטרודה עד שההתנגדות תהיה 25 עד 35 Mega ohms ומתחים (spikes) בעוצמה של שלושה עד שמונה millivolts כדי להתחיל את המילוי היוקסו-סומטי (juxtasomal filling). הגבישו פולסי זרם מרובעים חיוביים החל מ-one nano amp.

העלה באיטיות ובהדרגה את הזרם בפסיעות של 0.1 nano amps תוך ניטור צורת הגל והתדר של ה-AP. נטר את פתיחת הממברנה כעלייה ברורה בתדר ה-AP במהלך שלב הפעילות (on phase) של פולס החסימה; צורת גל הספייק במהלך המילוי תראה רוחב מוגבר והיפר-פולריזציה פוסט-סינפטית מופחתת. הגדל או הפחת את הזרם בזמן המילוי כדי לשמור על עירוי ביוטין יציב, והפסק או הפחת את פולסי הזרם בעת עלייה פתאומית בתדר ה-AP. זאת כדי למנוע רעילות עקב זרימה מוגברת של יונים חוץ-תאיים, כגון יוני נתרן.

חשוב לציין שכל נוירון יגיב באופן שונה להליך המילוי. לפיכך, יש להתאים את פרמטרי הסימון הסומטי הסמוך (juxta somal) בהתאם לתנאי ההקלטה. עקוב מקרוב אחר האות לאחר הפסקת הזרמת הזרם.

צורת גל הספרייק (spike) לאחר סשן מילוי היא בדרך כלל רחבה יותר ומראה הפחתה משמעותית של היתר-היפר-פולריזציה (after hyperpolarization); המתן להתאוששות הנוירון, הנראית כאשר צורת גל הספרייק חוזרת למאפייניה המקוריים, כדי להפחית כל מאמץ מכני המופעל על התא. נסוג עם פיפטת הפאץ' (patch pipette) במדרגות של 1 µm עד שהאמפליטודה של הספרייק פוחתת; המתן לפחות שעה אחת כדי שהביוטין יפעפף בתוך התא, תוך ניטור צמוד של טמפרטורת הגוף והנשימה של בעל החיים. לבסוף, דגימות מוח נלקחות ומעובדות כדי לבחון את איכות הסימון היוקסטה-סומטי (juxtasomal labeling).

תמונות אלו מציגות נוירונים שמולאו בשיטת juxtasomatic בקליפה הסומטו-סנסורית הראשונית. מבט טנגנציאלי זה של נוירון פרי-מרכזי מדגים את ההבדל בגודל בין הדנדריטים לאקסונים. בשחזור דיגיטלי זה של נוירון שסומן בשיטת juxtasomatic, תמונת ההקרנה של הנוירון מוצגת ברזולוציה גבוהה, אך בהגדלה נמוכה, כאשר שחזור דיגיטלי אוטומטי מונח מעל: אקסון בכחול ודנדריט באדום, בהתאמה.

כאן הגג של תיבת הבחירה מורחב כדי להציג כפתורי אקסון לאורך כל אורך האקסון. באנימציה סופית זו, אנו מדגימים את תהליך השחזור עבור נוירון פארא-מטלי בעל קיטוף עבה (thick tufted parametal neuron) משכבה חמישה של קורטקס סומטוסנסורי ראשוני של חולדה. תהליך השחזור כולל שחזור של מורפולוגיה דנדריטית ואקסונלית בהגדלה של 100 פעמים, ושחזור של מתהרי החביות (barrel contours) בהגדלה של 4 פעמים.

התוצאה היא שחזור תלת-ממדי מלא, אשר לאחר מכן נרשם למסגרת ייחוס סטנדרטית לצורך ביצוע ניתוח כמותי של מאפיינים מורפולוגיים. לפיכך, סימון סמוך לסומה (juxta somal labeling) in vivo מאפשר איכות סימון יוצאת דופן לשחזור אמין של מורפולוגיה תלת-ממדית מלאה. כאן הדגמנו את השיטה בבעלי חיים תחת הרדמה באורתן.

עם זאת, ניתן להשתמש בהקלטות Jux Somal גם בבעלי חיים ערים עם קיבוע ראש, כדי לחקור את התפקיד של סוגי תאים ושכבות ספציפיות במהלך חקירה פעילה של הסביבה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה יותר לגבי אופן ביצוע סימון ב-Biocidin של נוירונים בודדים לצורך זיהוי לאחר הניסוי ושחזור מורפולוגי.