Name: שימוש בכלי המיני-דגן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: חקור שינויים בהסתבכות mRNA גלובלית באמצעות כלי המיני-דג'ן E1A2 בתאי HEK 293. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה וחסכונית של תפקוד חלבונים ברגולציית ספלייסינג חלופי לאחר טיפול כימותרפי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, דרך גרנט Temático 2017/03489-1 ל- JK ואחווה ל FLB 2018/05350-3) ולקונסטליונל דה Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) למימון מחקר זה. ברצוננו להודות לד"ר אדריאן קריינר על שסיפק את pMTE1A פלסמיד וזלר ועמיתיו על עבודתם בשיבוט E1A. אנו מודים גם לפרופ' ד"ר פטרישיה מוריאל, לפרופ' ד"ר וונדה פריירה אלמידה, לפרופ' מרסלו לנסלוטי ולפרופ' ד"ר קרינה קוגו קוגו מולר על כך שיאפשרו לנו להשתמש בשטח המעבדה ובציוד שלהם.

1. תאי ציפוי
הערה: בפרוטוקול המתואר הזה, HEK293 קווי תאים יציבים, שנוצרו בעבר עבור ביטוי יציב ובלתי ניתן לתמיהה של Nek4 שימשו21, עם זאת, אותו פרוטוקול מתאים לקווי תאים רבים אחרים, כגון HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. דפוס הביטוי של איזופורמים E1A מיניג'ן בתנאים בסיסיים משתנה בין תאים אלה ויש לאפיין אותו עבור כל תנאי. פרוטוקול זה אינו מוגבל לקווי תאים יציבים. הגישה הנפוצה ביותר בהערכת חלבון המועמד היא על ידי שיתוף פעולה חולף של הגדלת כמותו עם כמות קבועה של המיני-דגן. אותו פרוטוקול מתאים לתאי הסתרה.
<ol><li>תאי לוח שוקלים רכב, לא נגוע ובקרות GFP.</li>
	<li>תאי HEK293 של תרבות עם ביטוי יציב של גן העניין במדיום הנשר המותנה (DMEM) של דולבק בתוספת 10% של סרום בקר עוברי (FBS), 4.5 גרם / L גלוקוז, 4 mM L-גלוטמין ולשמור עם 100 מיקרוגרם / מ"ל של hygromycin B, על לוחות שטופלו בתרבית רקמות ב 37 °C ב 5% CO2 ואטמוספירה לחה.</li>
	<li>לפצל תאים באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA. צלחת 3 x 105 תאים ב 6-טוב צלחות ולדגירה אותם במשך 24 שעות ב 37 °C (5% CO2). הערה: עבור transfection, תאים חייבים להיות 70-80% confluent כדי להפחית את המוות התא לאחר transfection.</li>
</ol>2. תעתיק תאים
הערה: 1-2 מיקרוגרם של pMTE1A מיני-דגן plasmid שימש כאן, אולם כמות ה- DNA, כמו גם את זמן הביטוי, חייב להישמר מינימלי כדי למנוע רעילות. לדוגמה, רעילות גבוהה נצפתה בתאי HeLa לאחר 30 שעות של transfection עם 1 מיקרוגרם של DNA pMTE1A. עבור transfection המתואר כאן, ריאגנט transfection מבוסס שומנים שימש
<ol><li>בדוק מפגש תאים 24 שעות לאחר ציפוי ולהדביק HEK293 תאים יציבים רק כאשר 70-80% confluent.</li>
	<li>הסר את תרבית התא בינוני בזהירות עם pipette, במקום להשתמש במערכת משאבת ואקום. לאחר מכן בזהירות להוסיף 2 מ"ל של מדיום DMEM מלא ללא אנטיביוטיקה ולהחזיר את הצלחת באינקובטור.</li>
	<li>הכן צינור עם חיץ transfection (200 μL / well), להוסיף 2 מיקרוגרם של pMTE1A DNA, מערבולת ולאחר מכן להוסיף 2 μL של ריאגנט transfection. מערבולת שוב ודגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מוציאים צלחות מהאינקובטור ומוסיפים בזהירות את תערובת הטרנספקטים.</li>
	<li>לתאים יציבים HEK293, הוסף טטרציקלין (0.5 מיקרוגרם/מ"ל) עבור אינדוקציה של ביטוי Nek4 6 שעות לאחר ההדבקה. אין צורך בשינוי בינוני. הערה: אמצעי אחסון/סכומים המתוארים בסעיף זה מיועדים לבאר אחת. הכן את התערובת עבור כל הבארות המשמשות בניסוי באותו צינור.</li>
	<li>הכן באר אחת כדי לעבור עם EGFP, או פלואורופור אחר מבטא plasmid כדי להעריך את יעילות transfection. תוצאות טובות יותר ניתן לראות עם יעילות transfection של לפחות 40%, אבל ביצועים טובים עם יעילות transfection נמוכה יותר נצפו בעבר.</li>
	<li>בעת שימוש בשיתוף פעולה (חלבון עניין ומיני-דג'ין) שמור על באר עם תאים שאינם נגועים כדי להימנע מהשגת תוצאות מ- mRNA אנדוגני. במקרה של E1A, תאי HEK293 כבר מבטאים את הגן E1A30.</li>
</ol>3. הכנת הסמים
הערה: הזמן והריכוז של הטיפול נבחרו על סמך תוצאות הספרות, המצביעות על שינויים בהזרמה חלופית עבור גנים מסוימים.
<ol><li>בצע עקומת תגובת מינון לפני תחילת ההסתה כדי לקבוע את הריכוז המינימלי אינדוקציה חיבור חלופי ללא השפעה על הכדאיות התא.</li>
	<li>הכן פתרון מלאי Paclitaxel בריכוז 5 mM באתנול. הריכוז הסופי הוא 1 מיקרומטר. לשמור על -20 °C (50 °F). השתמש 0.02% אתנול כמו בקרת רכב.</li>
	<li>הכן פתרון ציספלטין על ידי דילול ב 0.9% NaCl בסביבות 0.5 מ"ג / מ"ל (1.66 מ"מ). להגן מפני אור, מערבולת ודגרה באמבט תרמי, 37 °C (30 °F) למשך 30 דקות. הריכוז הסופי הוא 30 מיקרומטר. להכין טרי או לאחסן ב 2-10 °C (50 °F) עד חודש אחד. הערה: כל הסמים חייבים להיות מוגנים מפני האור.</li>
</ol>4. טיפול ואיסוף תאים
הערה: HEK293 תאים יציבים נאספו 48 שעות לאחר transfection ועל כך טופלו 24 שעות לאחר transfection כי רמת הביטוי Nek4 הגבוהה ביותר מושגת בתוך 48 שעות. עם זאת, רמות גבוהות של ביטוי איזופורם 13S (עד 90%) נצפו בשלב זה. כדי להקטין את היחס של isoform 13S, לנסות לטפל ולאסוף תאים 30 שעות לאחר transfection מקסימום.
<ol><li>השתמש RNA / DNase טיפים חינם צינורות. בצע מיצוי RNA הכולל עם פנול-כלורופורם ריאגנט בעקבות המלצת היצרן.</li>
	<li>24 שעות לאחר ההדבקה, לאמת מורפולוגיה של תאים ויעילות transfection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	<li>הסר את המדיום תרבית התא, מועדף באמצעות pipette במקום מערכת משאבת ואקום. לאחר מכן להוסיף מדיום תרבית התא עם כימותרפיה בריכוז הסופי שתואר בעבר.</li>
	<li>דגירה ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 עבור 18 - 24 שעות.</li>
	<li>לאסוף RNA על ידי השלכת המדיום תרבית התא במיכל והוספת 0.5 - 1 מ"ל של ריאגנט חילוץ RNA ישירות לבאר. אם בארות הן מאוד משכנעות, השתמש 1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA כדי לשפר את איכות הרנ"א.</li>
	<li>הומוגני עם פיפטה ולהעביר צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. בשלב זה, הפרוטוקול יכול להיות מושהה על ידי אחסון דגימות ב -80 °C (80 °F) או להמשיך מיד לחילוץ RNA. אזהרה: ריאגנט החילוץ RNA מבוסס פנול רעיל וכל ההליכים צריכים להתבצע במכסה אדים כימי ושאריות מסולקות כראוי.</li>
</ol>5. מיצוי RNA וסינתזת CDNA
<ol><li>במכסה המנוע האדים מפשירים את הדגימות ודגר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 0.1 -0.2 מ"ל של כלורופורם ונסער במרץ.</li>
	<li>דגירה במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-12,000 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף את השלב מימי העליון ולעבור צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל חדש. לאסוף כ-60% מהנפח הכולל; עם זאת, אין לאסוף את ה- DNA או את השלב האורגני (התחתון).</li>
	<li>הוסף 0.25 - 0.5 מ"ל של איזופרופנול ונסיסה על ידי היפוך 4 פעמים. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות, ב 4 °C (55 °F) להשליך את supernatant.</li>
	<li>לשטוף את כדורי RNA פעמיים עם אתנול (75% במים דיאתילפירוקרבונט (DEPC). צנטריפוגה ב 7,500 x g במשך 5 דקות ולהשליך את האתנול.</li>
	<li>הסר אתנול עודף על ידי היפוך הצינור על נייר מגבת ולאחר מכן להשאיר את הצינור פתוח בתוך מכסה המנוע אדים לייבש חלקית את הכדור במשך 5 - 10 דקות.</li>
	<li>resuspend כדורי RNA ב 15 μL של מים שטופלו DEPC.</li>
	<li>כימת את סך הרנ"א באמצעות ספיגה ב- 230 ננומטר, 260 ננומטר ו- 280 ננומטר כדי לאמת את איכות ה- RNA.</li>
	<li>כדי לאמת את איכות הרנ"א הכוללת, הפעל ג'ל אגרוז 1% שטופלו מראש עם 1.2% (v/v) של פתרון היפוכלוריט נתרן 2.5% למשך 30 דקות31.</li>
	<li>בצע סינתזת cDNA באמצעות 1-2 מיקרוגרם של RNA הכולל.<ol>
<li>Pipette RNA, 1 μL של אוליגו-dT (50 מיקרומטר), 1 μL של dNTP (10 מ"מ) ולהוות את הנפח עד 12 μL עם מים ללא נוקלאז. דגירה בתרמוציקלר במשך 5 דקות ב 65 °C (65 °F).</li>
		<li>הסר דגימות מן thermocycler כדי להתקרר ולהכין את תערובת התגובה: 4 μL של חוצץ תמלול הפוך, 2 μL של dithiothreitol (DTT), ו 1 μL של מעכב ריבונוקלאז. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 2 דקות.</li>
		<li>הוסף 1 μL של תמלול הפוך תרמו יציב. דגירה ב 37 °C במשך 50 דקות ולהנטרל את האנזים ב 70 °C (70 °F) במשך 15 דקות. הערה: ניתן לאחסן את ה- cDNA ב- -20 °C (70 °F) למשך מספר שבועות. בצע בקרת תמלול לא הפוכה (NRT) לזיהום גנומי מאפליה של אירועי שימור אינטרון.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. pMTE1A מיני פיג'ן PCR
<ol><li>בצע PCR עם הרכב התגובה (1.5 mM של MgCl2, 0.3 מ"מ של תערובת dNTP, 0.5 מיקרומטר של כל פריימר, 2.5 U של הפעלה חמה טאק פולימראז ו 150 ננוגרם של cDNA) עם התנאים הבאים: 94 °C (74 °F) למשך 2 דקות, 29 מחזורים של: 94 °C (74 °F) למשך דקה אחת, 50 °C (50 °F) למשך 2 דקות, 72 °C (72 °F) למשך 10 דקות.</li>
	<li>לטעון 20-25 μL של המוצר PCR בג'ל אגרוז 3% המכיל כתם חומצת גרעין ולהפעיל ב 100 V במשך כ 1 שעה.</li>
</ol>7. ניתוח הג'ל באמצעות תוכנת עיבוד וניתוח תמונה32
<ol><li>לאחר הריצה, צלם את הג'ל (באמצעות מערכת רכישת דימות ג'ל) תוך הימנעות מרוויה של רצועות וכימות הרצועות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.</li>
	<li>לכימות שקול את הרצועות ב ~ 631 bp, ~ 493 bp, ו ~ 156 bp כדי להתאים 13S, 12S ו 9S isoforms, בהתאמה.</li>
	<li>מתפריט קובץ של התוכנה, פתח את קובץ התמונה המתקבל ממערכת רכישת ההדמיה. המר לגווני אפור, התאם את הבהירות והחדות והסר רעש חריג במידת הצורך.</li>
	<li>ציירו מלבן סביב הנתיב הראשון בעזרת הכלי בחירת מלבן ובחרו אותו דרך | ג'לים | בחר את הפקודה נתיב ראשון, או על-ידי הקשה על קיצור המקשים עבורה.</li>
	<li>השתמש בעכבר כדי ללחוץ ולהחזיק באמצע המלבן בנתיב הראשון ולגרור אותו לנתיב הבא. עבור אל ניתוח | ג'לים | בחר בנתיב הבאאו הקש על קיצור הדרך הזמין. חזור על שלב זה לכל הנתיבים הנותרים.</li>
	<li>לאחר שכל הנתיבים מסומנים וממוספרים, עבור אל ניתוח | ג'לים | נתיבי עלילה כדי לצייר חלקת פרופיל של כל נתיב.</li>
	<li>בעזרת כלי בחירת הקו הישר, צייר קו לאורך הבסיס של כל פסגה המתאימה לכל רצועה, והשאר את רעשי הרקע. אחרי כל הפסגות, מכל נתיב, נסגרו, בחרו בכלי השרביט ולחצו בתוך כל פסגה. עבור כל שיא מסומן, מידות צריכות לצוץ בחלון התוצאות שמופיע.</li>
	<li>סכם את העוצמה מכל 3 הרצועות עבור כל דגימה וחשב את האחוז עבור כל איזופורם ביחס לסכום הכולל.</li>
	<li>התווה את האחוזים של כל איזופורם או את ההבדלים באחוזים ביחס לדגימות שלא טופלו. הערה: ודא שהסכום של שלוש וריאנטים של E1A חייב להיות שווה ל- 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Ule, J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+Regulatory+Networks%3A+Functions%2C+Mechanisms%2C+and+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution.</a> Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).</li>
<li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+their+transduction+pathways+regulating+alternative+splicing%3A+a+new+dimension+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome.</a> Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).</li>
<li>Kornblihtt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing%3A+a+pivotal+step+between+eukaryotic+transcription+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+Phosphorylation+of+SR+Proteins+Is+Required+for+Their+Recruitment+to+Sites+of+Transcription+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo.</a> Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).</li>
<li>Kanopka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adenovirus+alternative+RNA+splicing+by+dephosphorylation+of+SR+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins.</a> Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).</li>
<li>Anufrieva, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-induced+stress+response+is+associated+with+downregulation+of+pre-mRNA+splicing+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells.</a> Genome Medicine. 10 (1), 49(2018).</li>
<li>Shultz, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1+Regulates+the+Alternative+Splicing+of+Caspase+9+Via+A+Novel+Intronic+Splicing+Enhancer+Affecting+the+Chemotherapeutic+Sensitivity+of+Non-Small+Cell+Lung+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells.</a> Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).</li>
<li>Gabriel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+splicing+factor+SRSF4+in+cisplatin-induced+modifications+of+pre-mRNA+splicing+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis.</a> BMC Cancer. 15, (2015).</li>
<li>Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+splicing+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of splicing in cancer.</a> Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li>
<li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).</li>
<li>Zerler, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1A+coding+sequences+that+enable+ras+and+pmt+oncogenes+to+transform+cultured+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).</li>
<li>Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+splicing+of+adenovirus+E1A+transcripts%3A+characterization+of+novel+reactions+and+of+multiple+branch+points+abnormally+far+from+the+3%27+splice+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site.</a> Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).</li>
<li>Stephens, C., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+splicing+yields+novel+adenovirus+5+E1A+mRNAs+that+encode+30+kd+and+35+kd+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).</li>
<li>Ulfendahl, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adenovirus-2+E1A+mRNA+encoding+a+protein+with+transcription+activation+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties.</a> The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).</li>
<li>Berk, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+adenovirus+2+early+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the adenovirus 2 early mRNAs.</a> Cell. 14 (3), 695-711 (1978).</li>
<li>Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+adenovirus+2+early+region+1A+mRNAs+is+non-sequential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential.</a> Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).</li>
<li>Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Science. 13 (1), 11(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akt-SRPK-SR+Axis+Constitutes+a+Major+Pathway+in+Transducing+EGF+Signaling+to+Regulate+Alternative+Splicing+in+the+Nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus.</a> Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+in+vivo+by+overexpression+of+antagonistic+splicing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors.</a> Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).</li>
<li>Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+SR+protein+phosphorylation+and+alternative+splicing+by+modulating+kinetic+interactions+of+SRPK1+with+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones.</a> Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).</li>
<li>Naro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosomal+kinase+NEK2+is+a+novel+splicing+factor+kinase+involved+in+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).</li>
<li>Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+Molecular+Characterization+of+the+Splicing+Factor+RBM4%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4.</a> PLoS ONE. 8 (3), 59092(2013).</li>
<li>Jarnæss, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+Factor+Arginine%2FSerine-rich+17A+%28SFRS17A%29+Is+an+A-kinase+Anchoring+Protein+That+Targets+Protein+Kinase+A+to+Splicing+Factor+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).</li>
<li>Bressan, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+of+human+Ki-1%2F57+with+pre-mRNA+splicing+events%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events.</a> FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).</li>
<li>Vivarelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraquat+Modulates+Alternative+Pre-mRNA+Splicing+by+Modifying+the+Intracellular+Distribution+of+SRPK2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2.</a> PLoS ONE. 8 (4), 61980(2013).</li>
<li>Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+Human+Cell+Line+Transformed+by+DNA+from+Human+Adenovirus+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.</a> Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).</li>
<li>Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleach+gel%3A+A+simple+agarose+gel+for+analyzing+RNA+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality.</a> Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+3%27+splice+site+choice+in+vivo+by+ASF%2FSF2+and+hnRNP+A1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1.</a> Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).</li>
<li>Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+in+vitro+RNA+processing+system+for+CT%2FCGRP+precursor+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA.</a> Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מיני-ג'נס הם כלים חשובים לקביעת ההשפעות של תרסיסים אלטרנטיביים גלובליים ב-vivo. ה adenoviral minigene E1A שימש בהצלחה במשך עשרות שנים כדי להעריך את התפקיד של חלבונים על ידי הגדלת כמות אלה בתא13,14. כאן, אנו מציעים את השימוש E1A minigene להערכת חוג חלופי לאחר חשיפה כימותרפית. קו תא יציב המבטא Isoform 1 Nek4 שימש, הימנעות הממצאים של ביטוי יתר שנגרם על ידי זיהום ארעי. isoform 1 של Nek4 לא הראה השפעה על מיני-gene E1A חלופי splicing בתנאים בסיסיים21<...

חיבור הוא בין השלבים החשובים ביותר בעיבוד mRNA אאוקריוטי המתרחש בו זמנית ל- 5'mRNA המכסה ופוליאדנילציה של 3'mRNA, המורכבת מהסרת אינטרונים ואחריה צומת אקסון. ההכרה של אתרי splicing (SS) על ידי spliceosome, קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין המכיל ריבונוקלאופרוטאינים קטנים (snRNP U1, U2, U4 ו- U6), RNAs קטנים (snRNAs) וכמה חלבוניםרגולטוריים 1 יש צורך splicing.
מלבד הסרה אינטרון (splicing מרכיב), ב eukaryotes, introns ניתן לשמור ו exons ניתן לשלול, קביעת התצורה של התהליך שנקרא splicing חלופי mRNA (AS). ההשתתפות החלופית לפני ה-mRNA מרחיבה את יכולת הקידוד של הגנום האוקריוטי המאפשר ייצור של מספר גדול ומגוון של חלבונים ממספר קטן יחסית של גנים. ההערכה היא כי 95-100% של mRNAs אנושי המכילים יותר מאקון אחד יכול לעבור splicingחלופי 2,3. זה בסיסי עבור תהליכים ביולוגיים כמו התפתחות עצבית, הפעלת אפופטוזיס ותגובת מתח תאי 4 , מתןחלופותהאורגניזם לווסת את תפקוד התא באמצעות אותו רפרטואר של גנים.
המכונות הדרושות לחבורת אלטרנטיבית זהה לשימוש בהשתלבתיות מכוננת והשימוש ב- SS הוא הקובע העיקרי להתרחשות פריצה חלופית. חלוקה מכוננת קשורה לשימוש באתרי חלוקה חזקים, הדומים בדרך כלל יותר למוזגי קונצנזוס להכרה5.
אקסונים אלטרנטיביים מוכרים בדרך כלל פחות ביעילות מאשר אקסונים מכוננים ברגע שהרכיבים הרגולטוריים של cis,הרצפים ב- 5 SS ו- 3'sS מאגפים את האקסונים האלה, מראים יכולת מחייבת נחותה לתרסיס. mRNA מכיל גם אזורים בשם משפרי או משתיקי קול הממוקמים אקסונים (משפרי ESEs) ו- splicing exonic (ESSs)) ואינטרונים (משפרי חוג אינטרוניים (ISEs) ומשתיקים אינטרוניים של שכפול (ISSs)) המשפרים או מדחיקים את השימוש ב- exon, בהתאמה5. רצפים אלה מזוהים על ידי אלמנטים טרנס-רגולטוריים, או גורמי שיתוף (SF). SFs מיוצגים בעיקר על ידי שתי משפחות של חלבונים, גורמי הצמדה עשירים serine / ארגינין (SRSFs) אשר נקשרים ESEs ואת המשפחה של ריבונוקלאופרוטאינים גרעיניים הטרוגניים (hnRNPs) אשר נקשרים רצפי ESSs5.
שכפול חלופי יכול להיות מווסת על ידי זרחן / dephosphorylation של טרנס - גורמים המשנים את השותפים אינטראקציות ולוקליזציה הסלולר של גורמי splicing6,7,8. זיהוי רגולטורים חדשים של גורמי שכפול יכול לספק כלים חדשים כדי לווסת את ההסתבכות, וכתוצאה מכך, כמה טיפולים בסרטן.
Anufrieva ואח'9, בפרופיל ביטוי גן microarray mRNA, נצפו שינויים עקביים ברמות של רכיבים spliceosomal ב 101 קווי תאים ולאחר תנאי לחץ שונים (תרופות מבוססות פלטינה, הקרנת גמא, מעכבי topoisomerase, מעכבי טירוסין קינאז ומסים). הקשר בין דפוס ההשתלשלות ויעילות הכימותרפיה כבר הוכח בתאי סרטן ריאות, שהם עמידים לכימותרפיה, ומציגים שינויים בגרסאות caspase-9 שיעור10. HEK293 תאים שטופלו עם לוח כימותרפיה להראות שינויים splicing עם עלייה בגרסאות פרו-אפופטוטי. גבריאל ואח' 11 נצפו שינויים לפחות 700 אירועים של splicing לאחר טיפול ציספלטין בשורות תאים שונים, וציין כי נתיבי שיוך מושפעים ציספלטין. מאפננים splicing כבר הוכיחו פעילות אנטי גידולית, מראה כי splicing חשוב להתפתחות הגידול, ובעיקר,תגובה כימותרפית 12. לפיכך, אפיון חלבונים חדשים המסדירים את ההשתתפות לאחר סוכני לחצים תאיים, כמו כימותרפיה, חשוב מאוד לגלות אסטרטגיות חדשות של טיפול.
הרמזים של ויסות שכפול אלטרנטיבי ממחקרים interactome, חשוב במיוחד לאפיין פונקציות של חלבונים חדשים או לא אופייניים, יכול לדרוש גישה כללית ופשוטה יותר כדי לאמת את התפקיד האמיתי של החלבון ב- AS. מיני-ג'נס הם כלים חשובים לניתוח התפקיד הכללי של חלבון המשפיע על ויסות ההשתתפות. הם מכילים קטעים מתוך גן של עניין המכיל לחילופין אזורים גנומיים מסונפים ולאגפים13. שימוש בכלי מיני-דג'ן מאפשר ניתוח של חוג ב- vivo עם מספר יתרונות כגון אורך המיניג'ן שהוא מינורי ולכן אינו מגבלה לתגובת ההגברה; ניתן להעריך את אותו מיני-דגן בשורות תאים שונים; כל הרכיבים התאיים, בעיקר שינוי לאחר התרגום שלהם (זרחן ושינויים בתאי התא) נמצאים וניתן לטפל בהם13,14. יתר על כן, שינויים דפוס splicing חלופי ניתן לראות לאחר מתח הסלולר, השימוש במערכת מיני-ז'ן, לאפשר לזהות את המסלול להיות מווסת על ידי גירויים שונים.
ישנן מספר מערכות מיני-דג'ן שכבר תוארו הספציפיות לסוגים שונים של אירועי חיתור13,14, עם זאת, כבדיקה ראשונית, המיני-ג'ין E1A15 היא מערכת כתבים חלופית מבוססת מאוד לחקר בחירת ה- SS של 5 ב- vivo. מתוך גן אחד בלבד, E1A, חמישה mRNAs מיוצרים על ידי חיבור חלופי המבוסס על בחירה של שלושה אתרי חיבור שונים 5 ′ ושל אחד גדול או אחד קטן 3 ′ splice אתר16,17,18. הביטוי של גרסאות E1A משתנה בהתאם לתקופה של זיהום אדנו-ויראלי19,20.
הראינו בעבר כי שני isoforms Nek4 אינטראקציה עם גורמי splicing כגון SRSF1 ו hnRNPA1 ובעוד isoform 2 משנה מיני-סוגן E1A חלופי, isoform 1 אין השפעה עלזה 21. מכיוון ש- isoform 1 הוא האיזופורם הנפוץ ביותר ומשנה עמידות לכימותרפיה ותגובת נזק לדנ"א, אנו מעריכים אם הוא יכול לשנות חוג חלופי של Minigene E1A במצב לחץ.
מיניג'ן אסאי היא שיטה פשוטה, בעלות נמוכה ומהירה, שכן היא זקוקה רק לחילוץ RNA, סינתזת cDNA, הגברה וניתוחי ג'ל אגרוז, ויכולה להיות כלי שימושי להערכה מאז השפעה אפשרית על חוג חלופי על ידי חלבון של תחומי עניין עד ההשפעה של טיפולים שונים על דפוס splicing חלופי הסלולר.

<table><tbody><tr><td>100 pb DNA סולם</td><td>Invitrogen</td><td>15628-050</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות</td><td>צלחת Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma</td><td>P4394</td><td></td></tr><tr><td>DEPC מים</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9920</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>תערובת dNTP</td><td>ThermoFisher</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי - FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>12657029</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>DMIL LED FLUO</td><td></td></tr><tr><td>מערכת רכישת הדמיית ג'ל - ChemiDoc Gel Imagin System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP - pEGFPC3</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 תאים יציבים - HEK293 Flp-In</td><td></td><td></td><td>נוצר מ-Flp-In&trade; T-REx וסחר; 293 - Invitrogen ומתואר באסמכתא 21</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>ThermoFisher</td><td>10687010</td><td>משמש לתחזוקת תאי Flp-In</td></tr><tr><td>תוכנת עיבוד וניתוח תמונה - תוכנת</td><td></td><td></td> FIJI <td>ref. 32</td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה מבוסס ליפידים - jetOPTIMUS Polyplus Reagent Polyplus</td><td></td><td>117-07</td><td></td></tr><tr><td>Oligo DT</td><td>ThermoFisher</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Paclitxel</td><td>Invitrogen</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות / ספיגת UV</td><td>Biotech</td><td></td><td>Epoch Biotek / מתאם Take3</td></tr><tr><td>pMTE1A פלסמיד</td><td></td><td></td><td>מסופק על ידי ד"ר אדריאן קריינר</td></tr><tr><td>pMTE1A F</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; 5' -ATTATCTGCCACGGAGGT-3</td><td></td></tr><tr><td>pMTE1A</td><td>R Invitrogen</td><td>5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>F5810R</td><td></td></tr><tr><td>טרנסקריפטאז הפוך - M-MLV</td><td>ThermoFisher</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>טרנסקריפטאז הפוך - Superscript IV</td><td>ThermoFisher</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>מעכב ריבונוקלאז RNAse OUT</td><td>ThermoFisher</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>מגיב מבוסס פנול-כלורופורם למיצוי RNA - טריזול</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA כתם ג'ל</td><td>ThermoFisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Platinum</td><td>Thermo</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma</td><td>T3383</td><td>משמש לדגל ריק או Nek4- ביטוי אינדוקציה</td></tr><tr><td>Thermocycler Bio-Rad</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בכלי המיני-דג'ן e1a לחקר שינויי ההסתבכות של mrna

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

עיבוד mRNA כרוך במספר שלבים בו-זמניים להכנת mRNA לתרגום, כגון 5'capping, תוספת פולי-A וחביך. מלבד חיבור מהווה, חיבור mRNA חלופי מאפשר ביטוי של חלבונים רב תכליתיים מגן אחד. כמו מחקרים interactome הם בדרך כלל הניתוח הראשון עבור חלבונים חדשים או לא ידועים, הקשר של חלבון הפיתיון עם גורמי חיבור הוא אינדיקציה כי זה יכול להשתתף בתהליך חיבור mRNA, אבל כדי לקבוע באיזה הקשר או מה הגנים מוסדר הוא תהליך אמפירי. נקודת התחלה טובה להערכת פונקציה זו היא באמצעות כלי מיני-דג'ן קלאסי. כאן אנו מציגים את השימוש במיני-ז'נים E1A אדנו-ויראלי להערכת שינויי ההצמדה החלופיים לאחר גירויי לחץ תאיים שונים. הערכנו את ההשתתפות של מיני-דגן E1A ב- HEK293 המבטא יתר על המידה חלבון Nek4 לאחר טיפולי הדגמה שונים. הפרוטוקול כולל E1A מיני-דבק, טיפול בתא, מיצוי RNA וסינתזת cDNA, ואחריו ניתוח PCR וג'ל וכימות של גרסאות משולבות E1A. השימוש בשיטה פשוטה ומבוססת זו בשילוב עם טיפולים ספציפיים הוא נקודת התחלה אמינה לשפוך אור על תהליכים תאיים או אילו גנים ניתן להסדיר על ידי חבית mRNA.

5' splice אתרים בבדיקה באמצעות E1A minigene בוצע כדי להעריך שינויים בפרופיל splicing בתאים לאחר תערוכת כימותרפיה. התפקיד של Nek4 - isoform 1 בוויסות AS בתאים יציבים HEK293 לאחר טיפול paclitaxel או ציספלטין הוערך.
אזור Adenoviral E1A אחראי לייצור של שלושה mRNAs עיקריים ממבשר RNA אחד בגלל השימוש של תורמי splice שונים. הם חולקים טרמינלי משותף של 5' ו-3 אינץ', אך הם שונים בגודלם של האינטרונים הנתמכים שלהם. Adenoviral E1A mRNAs נקראי...

פרוטוקול זה מציג כלי מהיר ושימושי להערכת תפקידו של חלבון עם פונקציה לא אופיינית בוויסות חיבור חלופי לאחר טיפול כימותרפי.

שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת לשימוש ב- Minigene E1A2 להערכת שינויים גלובליים של חיבור mRNA. זהו כלי מהיר, זול ופשוט להערכת תפקודו של חלבון היעד בוויסות שכפול חלופי ללא צורך במשטרים מיוחדים או בתנאי מעבדה. התחל על ידי פולחן HEK 293 תאים עם ביטוי יציב של גן העניין.לפצל את התאים באמצעות 0.25%טריפסין EDTA, ולאחר מכן צלחת 300, 000 תאים לבאר בשש צלחות היטב ולדגירה אותם במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, לבדוק את המפגש, ולהדביק HEK 293 תאים יציבים רק כאשר 70 עד 80% confluent. בזהירות להסיר את המדיום תרבית התא עם pipette, ולאחר מכן להוסיף שני מיליליטר של מדיום DMEM מלא ללא אנטיביוטיקה ולהחזיר את הצלחת באינקובטור.הכן צינור עם חיץ טרנספקטיון, ולאחר מכן הוסף שני מיקרוגרם של DNA pMTE1A, מערבולת, ולהוסיף שני microliters של ריאגנט transfection. מערבולת שוב ודגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הצלחות מהאינקובטור ומוסיפים בזהירות את תערובת הטרנספקטיון.שש שעות לאחר ההדבקה, הוסף טטרציקלין לתאים יציבים HEK 293 עבור אינדוקציה ביטוי Nek4. 24 שעות לאחר ההדבקה, לאמת מורפולוגיה של תאים ויעילות transfection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש pipette כדי להסיר את המדיום תרבית התא, ולאחר מכן להוסיף מדיום תרבית התא עם chemotherapeutics.לדגור על התאים לעוד 24 שעות. כדי לאסוף RNA, להשליך את המדיום תרבית התא, ולהוסיף 0.5 עד 1 מיליליטר של ריאגנט חילוץ RNA ישירות לבאר. אם בארות הן מאוד משכנעות, להשתמש מיליליטר אחד של ריאגנט מיצוי RNA כדי לשפר את איכות הרנ"א.הומוגניזציה התאים עם פיפטה ולהעביר אותם לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. המשך מיד לחילוץ הרנ"א, או אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. להפשיר את הדגימות במכסה אדים ודגר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.מוסיפים 0.1 עד 0.2 מיליליטר של כלורופורם ונסיתים במרץ, ואז מדגירים במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12, 000 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאסוף את השלב מימי העליון ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר חדש. לאסוף סביב 60% מהנפח הכולל, אבל לא לאסוף את ה- DNA או את השלב האורגני.הוסף 0.25 עד 0.5 מיליליטר של איזופרופנול ולעצבן את המדגם על ידי היפוך ארבע פעמים. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant. לשטוף את כדורי RNA פעמיים עם אתנול, וצנטריפוגה ב 7, 500 פעמים G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשליך את האתנול.הסר אתנול עודף על ידי היפוך הצינור על מגבת נייר, ולאחר מכן להשאיר את הצינור פתוח בתוך מכסה המנוע אדים לייבש חלקית את הכדור במשך חמש עד 10 דקות. להשעות מחדש את כדורי הרנ"א ב-15 מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC. לכמת את הרנ"א הכולל ולאמת את איכות הרנ"א על-ידי מדידת ספיגה ב- 230, 260 ו- 280 ננומטר.כדי לאמת את איכות הרנ"א הכוללת, הפעל ג'ל אגרוז 1%עם טיפול מראש עם 1.2% של פתרון היפוכלוריט נתרן 2.5% במשך 30 דקות. בצע סינתזת cDNA באמצעות מיקרוגרם אחד עד שניים של RNA הכולל. שלבו RNA, מיקרוליטר אחד של אוליגו D-T, מיקרוליטר אחד של DNTP, ומים ללא נוקלאז ל-12 מיקרוליטרים.לדגור על התגובה ב מחזור התרמו במשך חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס. הסר דגימות מן מחזור התרמו, ולהוסיף ארבעה microliters של מאגר תמלול הפוך, שני microliters של DTT, ו microliter אחד של מעכב ריבונוקלאז. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס לשתי דקות.הוסף מיקרוליטר אחד של תמלול הפוך תרמו-יציב, ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות. לנטרל את האנזים ב 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בצע PCR כמתואר בכתב היד של הטקסט, ולאחר מכן לטעון 20 עד 25 microliters של המוצר PCR על ג'ל 3% agarose המכיל כתם חומצה גרעין, ולהפעיל ב 100 וולט במשך כשעה אחת.צלם את הג'ל, הימנע מרוויה של רצועה, וכמת את הרצועות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. הלהקות ב- 631, 493 ו- 156 זוגות בסיס תואמות לאיזפורמות 13S, 12S ו- 9S בהתאמה. מתפריט קובץ של התוכנה, פתח את קובץ התמונה והמרת אותו לקנה מידה אפור.כוונן את הבהירות והחדות ולאחר מכן הסר רעש חריג במידת הצורך. צייר מלבן סביב הנתיב הראשון באמצעות כלי בחירת המלבן ובחר אותו באמצעות הפקודה ניתוח, ג'לים ובחירת נתיב ראשון, או באמצעות קיצור המקשים. השתמש בעכבר כדי ללחוץ ולהחזיק באמצע המלבן בנתיב הראשון וגרור אותו לנתיב הבא.עבור אל ניתוח, ג'לים ובחר הנתיב הבא. חזור על שלב זה עבור כל הנתיבים הנותרים. לאחר שכל הנתיבים מסומנים וממוספרים, עבור אל נתח, ג'לים ונתיבי עלילה כדי לצייר חלקת פרופיל של כל נתיב.השתמש בכלי בחירת הקו הישר כדי למתוח קו לאורך הבסיס של כל פסגה, המתאים לכל רצועה, ומשמיט את רעשי הרקע. לאחר שכל הפסגות מכל נתיב נסגרו, בחרו בכלי השרביט ולחצו בתוך כל פסגה. יש לצוץ מדידות בחלון התוצאות עבור כל שיא מסומן.שקול רק את פסגות 13S, 12S ו- 9S המתאימות ללהקות 631, 493 ו- 156 זוגות בסיסים. העתק נתוני עוצמה עבור עורך גיליון אלקטרוני וסכם את העוצמה מכל שלוש הרצועות עבור כל דגימה ולאחר מכן חשב את האחוז עבור כל איזופורם ביחס לסכום הכולל. התוויית האחוזים של כל איזופורם, או את ההבדלים באחוזים ביחס לדגימות שלא טופלו.פלסמיד המכיל את המיני-דגן מ- E1A שימש כדי לבחון את ההשפעה על חבורת חלופית על ידי הערכת שיעור ה- mRNA מכל איזופורם המיוצר. ביטוי בזאלי של וריאנטים איזופורמים E1A היה תלוי בקו התא והשעה של ביטוי E1A. קו התא היציב HEK 293, או HEK 293 רקומבינאז המכיל אתר, הראה ביטוי גבוה יותר של 13S בהשוואה לתאי HeLa, אך הראה רמות דומות של isoforms 13S ו- 12S לאחר 48 שעות של ביטוי E1A.תאים שנחשפו לציספלטין הראו שינוי בבחירת שיתוף ה-S-S הראשונית לטובת ביטוי 12S. אפקט זה נצפה HEK 293 ביציבות מבטא את הווקטור הריק דגל, כמו גם איזופורם אחד של Nek4. שינויים בהשתלבות חלופית לאחר טיפול paclitaxel היו דיסקרטיים מאוד, אבל הכיוונים של השינויים היו הפוכים פלאג ו Nek4 מבטא תאים.בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב להשתמש בפקדי תמלול לא נגועים ולא הפוכים כדי למנוע פרשנות שגויה עם ביטוי E1A אנדוגני, בעיקר בעת שימוש בתאי HEK 293. לאחר קבלת תוצאות חיוביות, ניתן להעריך את ההשתתפות החלופית של גנים ספציפיים הקשורים לתגובה הכימותרפית. כאשר נצפתה השפעה מסוימת, פרוטוקול פשוט זה יכול לכוון מחקרים אלה למסלולים עקביים יותר, שבהם החלבון ממלא תפקיד בוויסות חיבור חלופי בתגובת כימותרפיה, למשל.

using-the-e1a-minigene-tool-to-study-mrna-splicing-changes

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

הוכח כי ויסות שחבור חלופי תורם למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במודל EMT הניתן להשראה לזיהוי שחבור חלופי במהלך EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

אירועי שחבור טנדם מתרחשים באתרים המרוחקים פחות מ-12 נוקלאוטידים זה מזה. כימות יחסים של גרסאות חיבור כאלה אפשרי באמצעות גישת PCR כמותית מוחלטת. כתב יד זה מתאר כיצד ניתן לכמת וריאנטים של הגן STAT3, שבהם שני אירועי שחבור מביאים להכללה/אי הכללה של Serine-701 ו-α/β C-termini.

מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

אנחנו לשכפל ולנתח גנים עיתונאי יצירת RNAs מעגלית. גנים כתבת אלה גדולים יותר מאשר בנייה כדי לנתח שחבור ליניארי ולהכיל Alu אלמנטס. כדי לחקור את RNAs מעגלית, המבנים הם מנותחים לתוך תאים וכתוצאה מכך RNA מנותח באמצעות RT-PCR לאחר הסרת RNA ליניארי.

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

מאמר זה מתאר את ההליכים הניסיוניים עבור (א) דלדול של U1 snRNP מתמציות גרעיניות, עם אובדן במקביל של פעילות splicing; ותואר (ב) שחזור של פעילות ההצמדה בתמצית U1-מרוקנת על ידי חלקיקי גלקטין-3 - U1 snRNP הקשורים חרוזים בשילוב עם נוגדנים אנטי-גלקטין-3.

השלמת פעילות התרסיס על ידי מתחם גלקטין-3 - U1 snRNP על חרוזים

שחבור חלופי (AS) ופוליאדנילציה חלופית (APA) מרחיבים את מגוון האיזופורמים של שעתוק ותוצרים. כאן אנו מתארים פרוטוקולים ביואינפורמטיים לניתוח מבחני RNA-seq בתפזורת ו-3' של ריצוף קצה כדי לזהות ולהמחיש AS ו-APA המשתנים בין תנאי ניסוי.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית minigene כדי לפקח על ההשפעה של מוטציות באתר 5-splice באתר על חיבור ומפתח מדכא U1 snRNA להצלת עיכוב חיבור המושרה מוטציה. הכתב והמדכא U1 snRNA מבנים באים לידי ביטוי בתאי HeLa, ו splicing מנותח על ידי הרחבת פריימר או RT-PCR.

בדיקה סלולרית מבוססת כתב לניטור יעילות חיבור

בדיקת ACT1-CUP1, בדיקת גידול נחושת, מספקת קריאה מהירה של שחבור RNA שליח מבשר (pre-mRNA) וההשפעה שיש לגורמי שחבור מוטנטיים על תפקוד השחבור השחבור. מחקר זה מספק פרוטוקול ומדגיש את ההתאמה האישית האפשרית כדי להתמודד עם שאלת השחבור המעניינת.

מבחני ACT1-CUP1 קובעים את הרגישויות הספציפיות למצע של מוטנטים שחבורים בשמרים ניצנים

זיהוי מהיר וכימות אמין של אירועי עריכת RNA בקנה מידה גנומי נותרו מאתגרים ומסתמכים כיום על שיטות ריצוף RNA ישירות. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באלקטרופורזה של ג'ל גרדיאנט מיקרו-טמפרטורה (μTGGE) כשיטה פשוטה, מהירה וניידת לאיתור עריכת RNA.

גישת אי-ריצוף לגילוי מהיר של עריכת RNA

חקור שינויים בהסתבכות mRNA גלובלית באמצעות כלי המיני-דג'ן E1A2 בתאי HEK 293. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה וחסכונית של תפקוד חלבונים ברגולציית ספלייסינג חלופי לאחר טיפול כימותרפי.

שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA

גלה סרטונים נוספים