השלמת פעילות התרסיס על ידי מתחם גלקטין-3 - U1 snRNP על חרוזים

דוח זה מספק את הראיות הניסיוניות לתיעוד כי קומפלקס snRNP של גלקטין-3 U1 נקשר למצע pre-mRNA יוצר קומפלקס פונקציונלי ומוביל לתוצרים של תגובת השחבור. פרוטוקול זה משתמש ב-galectin-3 U1 snRNP immunoselected על חרוזים המחוברים קוולנטית לנוגדנים נגד gal3 כדי ליזום את תגובת השחבור, שיכולה להתקדם עד לסיום. שלב קריטי בפרוטוקול הוא הסרה זהירה של נוזל לאחר כדור החרוזים המכילים את קומפלקס הגלקטין-3 U1 snRNP והשימוש המיידי בו בהתחלת תגובת השחבור.

כדי לרוקן את ה-SnRNPs של U1 מהתמצית הגרעינית, דגרו 200 מיקרוליטר של תמצית גרעינית עם 100 מיקרוליטר של חרוזים נגד U1. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של RNA לתערובת וסובבים את ראש צינור המיקרו מעל הזנב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. גלולה את התערובת על ידי צנטריפוגה ואספו את החומר הלא קשור באמצעות מזרק המילטון.

דיאליזה של כל הנפח של תמצית גרעינית מדולדלת U1 יחד עם 50 מיקרוליטר נפרד של התמצית הגרעינית המקורית שלא התרוקנה בתאים נפרדים של מיקרו דיאלייזר תוך ערבוב במשך 75 דקות כנגד 60% מאגר D בארבע מעלות צלזיוס. השתמש בקרום דיאליזה עם משקל מולקולרי של 8K מנותק. מיד לאחר הדיאליזה, חלקו את התכשירים ל -20 מיקרוליטר אליקוט, ואז הקפיאו אותם באמבט אתנול קרח יבש ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.

רגע לפני השימוש, שטפו את חרוזי האנטי-גל3 פעמיים עם 0.5 מיליליטר של מאגר כביסה TX. לכל שטיפה מוסיפים את מאגר הכביסה והצנטריפוגה. הסר את הסופרנטנט תחילה עם מיקרופיפטה ולאחר מכן עם מזרק המילטון כדי להוציא את הנוזל מהחרוזים.

חלקו את התמצית הגרעינית על פני שיפוע גליצרול של 12% עד 32%. שלב וערבב שברי שיפוע גליצרול שלוש, ארבע וחמש שנמצאים ליד אזור 10S. הכינו שני ליטרים של 150 מיקרוליטר של שברי שיפוע משולבים שלוש עד חמש והניחו אותם ב-50 מיקרוליטר של חרוזים נגד גל3.

במקביל, הכינו שתי דגימות כל אחת עם 150 מיקרוליטר של שבר אחד והניחו אותן ב -50 מיקרוליטר של חרוזים נגד גל 3. כבקרה, הנח 150 מיקרוליטר של 60% מאגר D ב-50 מיקרוליטר של חרוזים נגד גל3. מערבבים בעדינות על ידי הקשה על הצינורות, ואז מסובבים אותם ראש מעל הזנב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.

גלולה את הדגימות עם צנטריפוגה עדינה. הסר את רוב הסופרנטנט בעזרת מיקרופיפטה. הסר את הסופרנטנט באמצעות מזרק המילטון על ידי הכנסת בזהירות של קצה המחט לתחתית החרוזים.

השתמש בחרוזים מיד לתגובות השחבור. הרכיבו את תגובת השחבור כמתואר בכתב היד של הטקסט והוסיפו אותה לקבוצה אחת של דגימות החרוזים. הרכיבו קבוצה זהה של תגובות שחבור בנפח כולל של 24 מיקרוליטר אך ללא תמצית גרעינית מדולדלת U1 והוסיפו אותה לסט החרוזים השני.

הכן תגובת שחבור בקרה שתתבצע בהיעדר חרוזים בנפח כולל של 12 מיקרוליטר. תגובת בקרה זו מכילה תמצית גרעינית, 60% מאגר D ומצע שחבור רדיואקטיבי. מערבבים את הצינורות בעדינות על ידי הקשה וסובבו אותם ראש על זנב ב-30 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות, ולאחר מכן גלולו את התערובת על ידי צנטריפוגה עדינה.

עצור את התגובה והוציא את החלבונים מהחרוזים על ידי הוספת 24 מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS 2X לצינורות המכילים חרוזים ו-12 מיקרוליטר של מאגר דגימת SDS 2X לצינור הבקרה המכיל תמצית גרעינית אך ללא חרוזים. מערבולת כל צינור. מחממים את הצינורות בחום של 100 מעלות צלזיוס למשך שבע דקות.

צנטריפוגה את הצינורות ב -1, 000 פעמים G ברוטור דלי מתנדנד בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 שניות. העבירו את הסופרנטנטים לצינורות מיקרו טריים. הוסף 20 מיליגרם למיליליטר חלבון K כדי לעכל ולהמיס את החלבונים.

דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה בעדינות את הצינורות. מדללים את התחמקות החרוזים עם 39.5 מיקרוליטר TE ו -10 מיקרוליטר של שלושה נתרן אצטט מולארי.

לדלל את בקרת התמצית הגרעינית עם 63.5 מיקרוליטר TE ו-10 מיקרוליטר נתרן אצטט. חלץ ונתח את ה-RNA כמתואר בכתב היד הטקסטואלי. תמציות גרעיניות שהתרוקנו מקומפלקסים של U1 snRNP ו-gal3 U1 snRNP מאזור 10S של שיפוע גליצרול שהושקע על ידי אנטי-גל3 עורבבו בתגובת שחבור.

תערובת תגובה זו הכילה U1 snRNA, כמו גם את החלבון הספציפי U1 U1-70K. כצפוי, האנטי-גל3 זירז את gal3. U1 snRNA, חלבון U1-70K ו-gal3 לא נמצאו במשקעים שלפני הבקרה החיסונית.

בהשוואה לתמצית גרעינית לא מדולדלת שבוצעה כבקרה חיובית, התמצית הגרעינית שהתרוקנה מ-U1 snRNP לא הראתה פעילות שחבור. ניתן לשחזר את פעילות השחבור בתמצית הגרעינית המדולדלת U1 על ידי קומפלקס gal3 U1 snRNP הקשור לחרוזים. נמצאו שני תוצרי תגובת השחבור אקסונים קשורים ולריאט אינטרון כרות, כמו גם בחומרי ביניים.

המרכיבים של שברים 3 עד 5 היו קריטיים בשיקום השחבור לתמצית הגרעינית המדולדלת U1. כאשר שברים אלה הוחלפו במאגר בלבד, לא ניתן היה להבחין בפעילות שחבור, מה שמצביע על כך שהחרוזים נגד גל3 לא היו אחראים לשיקום פעילות השחבור בתמצית גרעינית שהתרוקנה מ-U1. באופן משכנע יותר, כאשר שברים 3 עד 5 הוחלפו בשבר אחד בהליך המשקעים החיסוניים ולאחר מכן נוספו לתמצית הגרעינית המדולדלת U1, לא נמצאו תוצרי ביניים או תוצרים של תגובת השחבור. כאשר מנסים פרוטוקול זה, אדם אחד צריך להשלים את המשקעים החיסוניים בעוד שהאדם השני מכין את תגובת השחבור בעיכוב קטן ככל האפשר.

ניתוח פרוטאומי של הרכב הפוליפפטיד של גלקטין-3 U1 SNRP המשחזר את פעילות השחבור לתמצית גרעינית מדולדלת U1 יהיה מעניין מאוד.