הדמיה של אינטראקציות מארחות מיקרוביוטה במעיים באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום , כתמי לטין והדמיה

פרוטוקול יעיל זה מפרט זרימת עבודה לזיהוי ותמונה של חיידקים בדגימות רקמות מורכבות, החל מתיקון הרקמה ועד להכתמת חיידקים עם פלואורסצנטיות בהכלאה במקום .

חיידקים הקשורים למארח מהווים מערכת אקולוגית מורכבת מאוד שבאמת דורשת הדמיה כדי להיות מובנת. ודרך החלקיק הזה, נראה לכם איך לעבור את תהליך ההכתמה ולהשיג הדמיה של ממשק המיקרוביום המארח. הבנת הביולוגיה של חיידקים הקשורים למארח דורשת הבנה של לוקליזציה שלהם בתוך סביבות מיקרו.

וטכניקה זו תאפשר לנו לדמיין מסה בודדת בתוך סביבות מארחות, כמו גם בהקשר של חיידקים אחרים. באמצעות טכניקה זו, זה הולך להיות אפשרי כדי לקבוע אילו חיידקים אולי חדרו דרך הרקמה המארחת, כמו גם כדי לקבוע אם תכונות מפתח כגון ריר המארח עשוי להיות מרוקן. הכן מת'קארן טרי במיכל תואם עם מתנול מוחלט של 60%, 30% כלורופורם ו-10% חומצה אצטית קרחונית.

באמצעות כלים חדים ונקיים, לחתוך מקטעי מעיים מן העכברים להדמיה. מזער הפרעה לדגימה ככל האפשר ולטפל בקטעים על ידי הרכסים שלהם כדי למנוע השפעה על אזור ההדמיה. תקן את המדגם בהקדם האפשרי לאחר ניתוח כדי למנוע השפלה.

מניחים את חלקי המעיים בקלטות היסתולוגיות על ידי החזקה עדינה של קצה הרקמה עם פינצטה. סגרו את הקלטת והטביעו אותה לחלוטין בתמיסת methacarn טרייה, מה שמבטיח שהפתרון לא יהיה מבוגר מכמה שעות עם טבילת הקלטות. עבור דגימות קליניות שייאספו בסוויטה קלינית ללא גישה למכסה אדים, השתמשו במיכל אחסון פוליאתילן עם דש חתוך למכסה שיאפשר את מעבר קלטות ההיסטיולוגיה.

טפטפת את הדש הזה סגור כאשר לא עובר דגימות כדי למנוע את הבריחה של אדים רעילים. מניחים את הפרפין במיכל עמיד בחום וממיסים בתנור ב-60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף את הרקמה על ידי שפיכת הנוזל בכלי הפסולת המתאים ודגורה אותו ברצף במתנול מוחלט, אתנול מוחלט וקסילן כמתואר בכתב היד של הטקסט.

פתחו מעט את הקלטות כדי לאפשר לפרפין להיכנס מבלי לאבד את מקטעי הרקמה באמצעות כפפות כפולות או פינצטה. שקועים וסוגרים את הקלטות במיכל של פרפין מומס. מחזירים את המיכל לתנור 60 מעלות, ומבטיחים שהקלטות יהיו מלאות בפרפין ולא יישארו בועות אוויר גדולות.

לאחר הדגירה במשך שעתיים, מוציאים את המיכל מהתנור. באמצעות מלקחיים, הסר בזהירות את הקלטות. מחממים את התנור ל-60 מעלות ומקדמים צנצנת קופלין.

הוסף כמות מספקת של קסילן בבקבוק זכוכית כדי לכסות את שקופיות הזכוכית בצנצנת פעמיים ולהניח parafilm סביב המכסה כדי למנוע אידוי של קסילן. אפשר לטמפרטורת הקסילן להגיע ל-60 מעלות צלזיוס. הכן את פתרון ההכלאה של FISH כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט.

מניחים את השקופיות בצנצנת קופלין, ומבטיחים כי המקטעים לא באו במגע עם שקופיות אחרות או הצנצנת ואופים את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. במכסה המנוע האדים, מלאו את צנצנת הקופלין בקסילן שחומם מראש מהתנור, תוך כדי דאגה לא לשפוך ישירות על גבי הדגימות ועלולים להוציא את הרקמות. מחזירים את צנצנת הקופלין לתנור ב-60 מעלות.

יוצקים קסילן משומש לתוך מיכל פסולת תקין, דואגים לא להפריע לחלקי הרקמה על מגלשות הזכוכית ושימוש בזוג מלקחיים כדי למנוע מהשקופיות ליפול מצנצנת הקופלין. לחדש את צנצנת קופלין עם קסילן הנותרים ודגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע אדים. לדגור את החלקים ב 99.5% אתנול במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, להסיר את השקופיות מצנצנת קופלין. נגב את גב המגלשות על מגבית מעבדה או מגבת נייר וייבש בקצרה עד שטיפות האתנול ייעלמו. צור עיגולים קרובים מאוד סביב כל מקטע רקמה באמצעות חוסם נוזל או עט PAP כדי להגביל את שטח ההתרחבות הדרוש לכיסוי על ידי פתרון ההיברידיזציה, הימנעות מגע דיו עם המקטע.

הכן את פתרון ההיברידיזציה והוסף 0.5 מיקרוגרם של בדיקה עבור כל 50 מיקרוליטרים של הפתרון המשמש. Pipette הפתרון על המקטעים בשקופית. לכסות את החלק עם כיסויי פלסטיק גמישים, להבטיח כי נפח הנוזל המשמש מכסה את כל החלק.

צרו תא לח עם קופסת טיפים עם מגבונים או מגבות נייר שהושרו בתמיסת היברידיזציה עודפת או PBS כדי לספק לחות. לדגור על השקופית בתא הלח ב 45 עד 50 מעלות צלזיוס לפחות שלוש שעות בהתאם לגשוש להגדיר כדי להפחית את האידוי. הסר את כיסויי הפלסטיק ודגר את השקופיות במאגר שטיפת דגים בצנצנת קופלין שניהם חוממו מראש ל -50 מעלות צלזיוס.

מחזירים את צנצנת הקופלין לתנור 50 מעלות למשך 10 עד 20 דקות. הסר את חיץ שטיפת דגים ולהחליף אותו עם PBS בצנצנת קופלין. מיד לאחר מילוי צנצנת קופלין עם PBS, decant PBS.

מוציאים שקופיות מהצנצנת ומפילים את הדלפק על גבי החלק כולו, תוך הקפדה לא לגעת ברקמה עם קצה הפיפטה. דגירה ב-4 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לשטוף את הכתמים שלוש פעמים במהירות עם PBS טרי.

נגב את גב המגלשות כנגד מגבת או נייר ותן לרוב ה-PBS להתאדות מהקטעים בסיוע קו ואקום המחובר לקצה פיפטה. טען את המקטעים באמצעות אמצעי הרכבה. הדביקו את כיסויי השער לשקופית על ידי צביעה לאורך קצות כיסוי עם לק ברור, תוך כדי דאגה להתרחק מקצה המגלשה.

תן לזה להגדיר בטמפרטורת החדר. תמונות של המעי הגס דיסטלי של עכבר מונו-קולוניאלי עם מעי Muribaculum ואחד דו קולוניאלי עם מעי Muribaculum ו Bacteroides תיטאיוטאומיקרון מוצגים כאן. הדגימות היו מוכתמות עם בדיקה FISH שלושה ציאנין-3 עיקרי מתויג ספציפי עבור Muribaculum לבודד וגם נגד עם רודמין קשור לציטין UEA-1 ו DAPI.

התמונות של קטעים מוכתמים ציאנין-3 דגים, DAPI, וערוצי ציאנין-3 דגים ו DAPI משולבים להראות את לוקליזציה של מעי Muribaculum. כל אותות DAPI בצורת חיידקים וחיידקים מסומנים עם ציאנין-3 במצב של קולוניזציה מונו. במצב דו-קולוניזציה, בנוסף לתאים ציאנין-3 ו- DAPI חיוביים כפולים אלה, ישנם תאים חיידקיים מוכתמים DAPI כי הם ציאנין-3 שלילי כצפוי.

למעט חיידקים חוטיים ארוכים יותר, מבנים DAPI חיוביים גדולים יותר הם חומר צמחי או גרעינים מתאים מארחים. קטע מעיים שנחתך בעומק המספק מבט על הלומן, כמו גם תצוגות אורך של האפיתל וקטע קטע רדוד החושף רק חתכים של קריפטות וללא שכבת ריר או חיידקים קבועים מוכיח כי חתך רדוד לא יספק פרוסות זוהרות של המעי. כיסוי רקמות או כיסויים לא אחידים גורם לסריקות אריחים מטושטשות ומוארות בצורה לא אחידה.

דוגמה לרקע רגיל ורקע גבוה מוצגת גם כאן. ככל שאנו לומדים יותר על המיקרוביוטה, זה נהיה ממש ברור כי בדיקות בתפזורת כגון רצף אינם מספיקים כדי באמת לקבוע מה קורה בין מינים מיקרוביים שונים וכיצד הם מתקשרים יחד. ולשם כך, אנחנו באמת דורשים הדמיה.

סוג זה של טכניקה אפשר כמה תגליות חשובות באמת, למשל, כי מניעת סיבים מהתזונה גורמת לדילול של שכבת הריר וזיהום פוטנציאלי על ידי פתוגנים כגון מחקרים מקבוצת מרטינס, כמו גם מחקרים לתוך ההשפעות של שלשול אוסמוטי וכיצד הידלדלות שכבת הריר באמת משפיעה הן על המארח והן על המיקרוביוטה. ואלה היו מחקרים שנעשו על ידי קבוצת זוננברג, כמו גם הקבוצה שלנו.