ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי אנטומולוגיה של קרציות, כגון הערכת נוכחות של חיידקים ברי קיימא בקרצייה מרחבית וזמנית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת חתך של הקרציות או ציוד יקר, ושהיא מאפשרת הדמיה מרחבית וזמנית של תעתיקי גנים. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שהיא כרוכה במספר שלבים וריאגנטים.

עם זאת, טכניקה זו אינה מייגעת. למרות שזה יכול לקחת כשלושה ימים, הזמן המעשי הוא רק כמה שעות בכל יום. כהכנה, האכילו את הקרציות שנאספו במשך 48 עד 72 שעות לפני איסוף המעיים.

כדי לנתח את המעיים מהקרצייה, הוסיפו 20 עד 30 מיקרוליטר של תמיסת MEMFA למגלשת זכוכית נקייה. לאחר מכן הניחו את הקרצייה ב-MEMFA, והתאימו את המיקוד לראש הקרצייה. כעת, באמצעות זוג סכיני גילוח סטריליים מפלדת פחמן גבוהה חותכים את אזור הראש בשקע ומשאירים את גוף הקרצייה בטקט.

לאחר מכן, לחץ בעדינות על הגוף כדי לדחוף את דיברטיקולת המעי ובלוטות הרוק אל מחוץ לקוטיקולה של הגוף. לאחר מכן, מבלי לפגוע במעיים, הפרד אותם בזהירות מבלוטות הרוק וגרף בזהירות את החתכים על סכין גילוח. אסוף את כל המעיים שנקטפו בצינור של 1.5 מיליליטר ב-500 מיקרומטר של MEMFA.

לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה למשך שעה. למחרת יש לייבש את הרקמה כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט ולאחסן אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס. להכנת סל רשת, ראשית, השתמש בלהב קצה יחיד מחומם על אזמל כדי לחתוך את התחתית מצינור צנטריפוגה עליון של שני מיליליטר או חמישה מיליליטר.

ייתכן שיהיה צורך לחמם את הלהב מספר פעמים לפני השלמת החיתוך. לאחר מכן, חותכים ריבוע של רשת ניילון 110 מיקרון שהיא מעט גדולה יותר מהפתחים החדשים. לאחר מכן, הצמידו את הרשת לפתח על ידי לחיצה קלה של הצינור לתוך הרשת על פלטה חמה המוגדרת לחום בינוני/נמוך עד לקבלת סל טוב.

לאחר שהוא מתקרר, חתוך את הרשת העודפת וודא שאין פערים. הכינו 24 מהסלים הללו כך שיתאימו לצלחת של 24 בארות. לאחר מכן, חותכים חורים לכיסוי של צלחת 24 בארות, כך ששפת סל הדגימה תתפוס את החור ולא תיפול.

בסיום, סלי הדגימה המורכבים צריכים לשבת כל הדרך לבארות. כעת, השתמש במחזיק סל מצויד זה כדי להעביר סלים מצלחת אחת לאחרת בקלות יחסית לאורך כל ההכלאה באתר. השתמש בשתי צלחות כאלה כך שבזמן שהדגימה דוגרת באחת, השנייה תוכל להתכונן לכביסה הבאה.

סעיף זה מכסה שלבים מסוימים של הכלאה באתר. עיין בפרוטוקול הטקסט לתיאור מלא. כדי להתחיל, העבירו כל דגימת רקמה קבועה לסל דגימות מסומן.

ארגן את הצלחת לפי תנאי ניסוי, וצבוע לפחות חמישה מעיים בכל מצב. ראשית, החזר בעדינות את הדגימות. הימנע מהכנסת בועות אוויר על ידי הגדלה הדרגתית של היחס בין PBS-T לאתנול בכל שטיפה.

במהלך היום הראשון, לאחר שלב ההיברידיזציה של שעתיים, במקום להשליך את מאגר ההכלאה, אחסן אותו לשימוש עתידי במהלך הבדיקה. מאוחר יותר, כאשר מטפלים בדגימות בתמיסת הכלאה של בדיקה, יש לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי של התמיסה. ביום השני, טען את מאגר ההכלאה השמור לצלחת 24 הבארות, וחמם את הצלחת עד 60 מעלות צלזיוס.

מאוחר יותר באותו יום, כדי להסיר את כל עקבות הבדיקה ומאגר ההכלאה, שטפו את הדגימות פעמיים עם 2x SSC למשך שלוש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם 2x SSC למשך 20 דקות לכל שטיפה ב-60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכן את הנוגדן העיקרי במאגר חוסם.

טען 500 מיקרוליטר מהתערובת הזו לכל באר. לאחר שלב החסימה יש לדגור בטמפרטורת החדר כארבע שעות או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום השלישי, הפעל את תגובת הצבע במצע כרומוגני.

מכסים את צלחת הדגימה בנייר אלומיניום. ובמהלך התגובה, בדוק מעת לעת אם יש מכתים יתר במיקרוסקופ הדיסקציה. ביום הרביעי חשוב לדגור ולהלבין על קופסת אור מכיוון שהדבר מאפשר להסיר כל פיגמנטציה בדגימות או בצבע מהתמיסה של בואן, ומשפר את אות הבדיקה להדמיה ברורה.

לאחר מכן לאחר שטיפה עם SSC, העבירו בזהירות את דגימות המעיים על ידי היפוך הסל לצלחת חדשה של 24 בארות. בזמן שהייה בבארות, שטפו היטב את הסלים באמצעות אתנול 70%. לאחר מכן הקדימו בהדמיית הדגימות.

זה קריטי להעריך את איכות בדיקות ה-RNA לפני השימוש בהן. ניתן לבדוק את הבדיקות על ג'ל פורמלדהיד. אם הם מופיעים כרצועות בהירות ונפרדות הם באיכות טובה.

בעת צביעה שונות מסוימת בפיזור היא נורמלית בין שכפולים ביולוגיים כמו גם בין שבעת זוגות הדיברטיקולות של מעיים בודדים. לכן, עדיף להכתים לפחות חמישה מעיים בכל מצב כדי לקבל מושג על דפוס צביעה ממוצע. ההצלחה הכוללת נמדדת בצורה הטובה ביותר על ידי השוואת הצביעה של דגימות חושים ואנטי-סנס עבור כל מצב.

יש לפתח את שניהם לאותו פרק זמן. דגימות החישה צריכות להיות בעלות צבע סגול מינימלי עד ללא צבע, בעוד שדגימות האנטיסנס צריכות להציג צביעה חזקה עם רקע מינימלי. באופן קריטי, הרקמות חייבות להיות במלואן בכתם לחשיפה אחידה.

חשוב להימנע מהתפתחות יתר של תגובת הצבע. זה יכול לגרום לכמות גבוהה של כתמי רקע, ודגימות החישה עשויות להתחיל להיראות כמו דגימות אנטיסנס. גורם נוסף שמשפיע על התוצאות הוא כמה הקרציות מוזנות מראש.

קשה לעבוד עם קרציות שלא ניזונו, או שניזונו במשך 24 שעות בלבד. המעיים שלהם נפגעים ביתר קלות ואינם מוכתמים היטב. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים וחצי עד שלושה אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל האספקה המפורטת בטבלת הריאגנטים והחומרים מוכנה לפני תחילת הניסוי. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.