ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר
1 ביוני 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי אנטומולוגיה של קרציות, כגון הערכת נוכחות של חיידקים ברי קיימא בקרצייה מרחבית וזמנית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת חתך של הקרציות או ציוד יקר, ושהיא מאפשרת הדמיה מרחבית וזמנית של תעתיקי גנים. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שהיא כרוכה במספר שלבים וריאגנטים.
עם זאת, טכניקה זו אינה מייגעת. למרות שזה יכול לקחת כשלושה ימים, הזמן המעשי הוא רק כמה שעות בכל יום. כהכנה, האכילו את הקרציות שנאספו במשך 48 עד 72 שעות לפני איסוף המעיים.
כדי לנתח את המעיים מהקרצייה, הוסיפו 20 עד 30 מיקרוליטר של תמיסת MEMFA למגלשת זכוכית נקייה. לאחר מכן הניחו את הקרצייה ב-MEMFA, והתאימו את המיקוד לראש הקרצייה. כעת, באמצעות זוג סכיני גילוח סטריליים מפלדת פחמן גבוהה חותכים את אזור הראש בשקע ומשאירים את גוף הקרצייה בטקט.
לאחר מכן, לחץ בעדינות על הגוף כדי לדחוף את דיברטיקולת המעי ובלוטות הרוק אל מחוץ לקוטיקולה של הגוף. לאחר מכן, מבלי לפגוע במעיים, הפרד אותם בזהירות מבלוטות הרוק וגרף בזהירות את החתכים על סכין גילוח. אסוף את כל המעיים שנקטפו בצינור של 1.5 מיליליטר ב-500 מיקרומטר של MEMFA.
לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה למשך שעה. למחרת יש לייבש את הרקמה כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט ולאחסן אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס. להכנת סל רשת, ראשית, השתמש בלהב קצה יחיד מחומם על אזמל כדי לחתוך את התחתית מצינור צנטריפוגה עליון של שני מיליליטר או חמישה מיליליטר.
ייתכן שיהיה צורך לחמם את הלהב מספר פעמים לפני השלמת החיתוך. לאחר מכן, חותכים ריבוע של רשת ניילון 110 מיקרון שהיא מעט גדולה יותר מהפתחים החדשים. לאחר מכן, הצמידו את הרשת לפתח על ידי לחיצה קלה של הצינור לתוך הרשת על פלטה חמה המוגדרת לחום בינוני/נמוך עד לקבלת סל טוב.
לאחר שהוא מתקרר, חתוך את הרשת העודפת וודא שאין פערים. הכינו 24 מהסלים הללו כך שיתאימו לצלחת של 24 בארות. לאחר מכן, חותכים חורים לכיסוי של צלחת 24 בארות, כך ששפת סל הדגימה תתפוס את החור ולא תיפול.
בסיום, סלי הדגימה המורכבים צריכים לשבת כל הדרך לבארות. כעת, השתמש במחזיק סל מצויד זה כדי להעביר סלים מצלחת אחת לאחרת בקלות יחסית לאורך כל ההכלאה באתר. השתמש בשתי צלחות כאלה כך שבזמן שהדגימה דוגרת באחת, השנייה תוכל להתכונן לכביסה הבאה.
סעיף זה מכסה שלבים מסוימים של הכלאה באתר. עיין בפרוטוקול הטקסט לתיאור מלא. כדי להתחיל, העבירו כל דגימת רקמה קבועה לסל דגימות מסומן.
ארגן את הצלחת לפי תנאי ניסוי, וצבוע לפחות חמישה מעיים בכל מצב. ראשית, החזר בעדינות את הדגימות. הימנע מהכנסת בועות אוויר על ידי הגדלה הדרגתית של היחס בין PBS-T לאתנול בכל שטיפה.
במהלך היום הראשון, לאחר שלב ההיברידיזציה של שעתיים, במקום להשליך את מאגר ההכלאה, אחסן אותו לשימוש עתידי במהלך הבדיקה. מאוחר יותר, כאשר מטפלים בדגימות בתמיסת הכלאה של בדיקה, יש לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי של התמיסה. ביום השני, טען את מאגר ההכלאה השמור לצלחת 24 הבארות, וחמם את הצלחת עד 60 מעלות צלזיוס.
מאוחר יותר באותו יום, כדי להסיר את כל עקבות הבדיקה ומאגר ההכלאה, שטפו את הדגימות פעמיים עם 2x SSC למשך שלוש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם 2x SSC למשך 20 דקות לכל שטיפה ב-60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכן את הנוגדן העיקרי במאגר חוסם.
טען 500 מיקרוליטר מהתערובת הזו לכל באר. לאחר שלב החסימה יש לדגור בטמפרטורת החדר כארבע שעות או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום השלישי, הפעל את תגובת הצבע במצע כרומוגני.
מכסים את צלחת הדגימה בנייר אלומיניום. ובמהלך התגובה, בדוק מעת לעת אם יש מכתים יתר במיקרוסקופ הדיסקציה. ביום הרביעי חשוב לדגור ולהלבין על קופסת אור מכיוון שהדבר מאפשר להסיר כל פיגמנטציה בדגימות או בצבע מהתמיסה של בואן, ומשפר את אות הבדיקה להדמיה ברורה.
לאחר מכן לאחר שטיפה עם SSC, העבירו בזהירות את דגימות המעיים על ידי היפוך הסל לצלחת חדשה של 24 בארות. בזמן שהייה בבארות, שטפו היטב את הסלים באמצעות אתנול 70%. לאחר מכן הקדימו בהדמיית הדגימות.
זה קריטי להעריך את איכות בדיקות ה-RNA לפני השימוש בהן. ניתן לבדוק את הבדיקות על ג'ל פורמלדהיד. אם הם מופיעים כרצועות בהירות ונפרדות הם באיכות טובה.
בעת צביעה שונות מסוימת בפיזור היא נורמלית בין שכפולים ביולוגיים כמו גם בין שבעת זוגות הדיברטיקולות של מעיים בודדים. לכן, עדיף להכתים לפחות חמישה מעיים בכל מצב כדי לקבל מושג על דפוס צביעה ממוצע. ההצלחה הכוללת נמדדת בצורה הטובה ביותר על ידי השוואת הצביעה של דגימות חושים ואנטי-סנס עבור כל מצב.
יש לפתח את שניהם לאותו פרק זמן. דגימות החישה צריכות להיות בעלות צבע סגול מינימלי עד ללא צבע, בעוד שדגימות האנטיסנס צריכות להציג צביעה חזקה עם רקע מינימלי. באופן קריטי, הרקמות חייבות להיות במלואן בכתם לחשיפה אחידה.
חשוב להימנע מהתפתחות יתר של תגובת הצבע. זה יכול לגרום לכמות גבוהה של כתמי רקע, ודגימות החישה עשויות להתחיל להיראות כמו דגימות אנטיסנס. גורם נוסף שמשפיע על התוצאות הוא כמה הקרציות מוזנות מראש.
קשה לעבוד עם קרציות שלא ניזונו, או שניזונו במשך 24 שעות בלבד. המעיים שלהם נפגעים ביתר קלות ואינם מוכתמים היטב. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים וחצי עד שלושה אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל האספקה המפורטת בטבלת הריאגנטים והחומרים מוכנה לפני תחילת הניסוי. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להערכת מיקרוביוטה חיה במעי של קרציות באמצעות גישה מותאמת של היברידיזציה באתר (in situ hybridization) של דגימה שלמה. השיטה מאפשרת ויזואליזציה מרחבית וזמנית של תמלילי גנים ללא צורך בציוד יקר או בביצוע חיתוכים של הקרציות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוביולוגיה
- אנטומולוגיה
- ניתוח ביטוי גנים
רקע
- הבנת המיקרוביוטה של הקרציות חיונית לחקר הביולוגיה של הקרציות.
- נוכחות של חיידקים חיוניים עשויה להשפיע על התנהגותם ופיזיולוגייתם של קרציות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לספק את הנתונים המרחביים והזמניים הדרושים.
- פרוטוקול זה שואף למלא פער זה באמצעות גישה פשוטה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להדמיה של מיקרוביוטה חיה במעיים של קרציות.
- הערכת נוכחות של חיידקים באופן מרחבי וזמני.
- אספקת טכניקה נגישה לחוקרים החדשים בתחום זה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקה משופרת של היברידיזציה במקום (in situ hybridization) על דגימה שלמה.
- הכנת קרציות באמצעות האכלה למשך 48 עד 72 שעות לפני איסוף המעי.
- ויזואליזציה של תמלילי גנים במעיים של קרציות.
- שלבים מרובים הכוללים ריאגנטים, אך אינם דורשים עבודה מאומצת.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של מיקרוביוטה חיה במעי של קרציות.
- יכולות מוכחות להערכה מרחבית וזמנית.
- פרוטוקול המושלם בכשלושה ימים עם זמן עבודה מעשי מינימלי.
- שיטה נגישה לחוקרים בתחום האנטומולוגיה של קרציות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק כלי בעל ערך לחקר המיקרוביוטה של קרציות.
- הוא משפר את ההבנה של האינטראקציות בין קרציות לחיידקים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול מחקרים אקולוגיים ובריאותיים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה מרחבית וזמנית של המיקרוביוטה במעיים של קרציות באמצעות היברידיזציה in situ של דגימות שלמות (whole-mount) מאפשרת הערכה ישירה של אינטראקציות בין הווקטור, הפתוגן והמיקרוביוטה. יכולת זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית במחקר של מחלות המועברות על ידי וקטורים ומספקת מידע לתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים עבור התערבויות המשפיעות על העברת הפתוגן. התוצרים האיכותיים וההתפלגותיים של השיטה רלוונטיים מאוד למחקר תרגומי ולסננון תיקי פיתוח בקווי ייצור למחלות זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של אינטראקציות בין מיקרוביוטה לפתוגנים בתוך רקמות שלם של וקטורים.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת ההתפלגות המרחבית של מיני חיידקים.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור התערבויות המשנות את המיקרוביוטה של הוקטור.
- מספק נתונים איכותיים לשיפור רמת הביטחון בחיזויים בשלבי הגילוי המוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סריקה של תרכובות המשנות את המיקרוביוטה בשלבים הבאים.
- מספק תוצאות מרחביות וזמניות הניתנות לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר השוואה חסונה של תנאי ניסוי באמצעות ויזואליזציה איכותית.
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור מחקרי וקטורים ופתוגנים מגוונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות מידול של סביבות טבעיות של וקטור-פתוגן-מיקרוביוטה.
- מספק המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות המכוונות למיקרוביוטה.
- מסייע בקבלת החלטות מותאמות סיכון לגבי קידום תוכניות למחלות המועברות על ידי וקטורים.
- משפר את צמצום הסיכונים החזוי (predictive de-risking) באמצעות ויזואליזציה של שינויים במיקרוביוטה במהלך הזנת הווקטור.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline & Workflow Integration)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קלייני במחקר של מחלות המועברות על ידי וקטורים, ותומכת בבחינת השערות ובמחקרים מכניסטיים לפני זיהוי מובילים (leads).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת הערכה מבוססת השערות של השפעת המיקרוביוטה על העברת פתוגנים.
- סריקה: מספקת תוצאות איכותניות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והשוואה בין תנאים.
- אנליטיקה: תומכת במדידה מרחבית וזמנית של התפלגות חיידקים ברקמות של הווקטור.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי הגילוי למודלים פרה-קליניים של אינטראקציה בין ווקטור לפתוגן.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר עבור יוזמות מחקר מגוונות של ווקטורים ומיקרוביוטה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים של וקטור-פתוגן.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי העבודה של הוויזואליזציה ומשפר את השחזוריות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח של מחלות זיהומיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של התערבויות המכוונות למיקרוביוטה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנתיחת קרציות ובפרוטוקולי היברידיזציה in situ.
- נשען על מכשור מעבדה סטנדרטי ותשתיות דימות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של תהליכי הכנת הדגימות ופרוטוקולי הצביעה.
- ניתן להתאימה למערכות וקטורים אחרות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי באיכות הגשש (probe) ובבקרה קפדנית של תנאי הצביעה לקבלת תוצאות מהימנות.
