Name: ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למד שיטת הכלאה כולה-הר לוויזואליזציה של מיקרוביוטה חיה במעיי קרציות. שיטה זו מאפשרת הערכה מרחבית וזמנית של חיידקים ללא ציוד יקר, ומסייעת לחוקרי אנטומולוגיה להבין אינטראקציות בין קרציות לחיידקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר מוסטפא Khokha, אוניברסיטת ייל, למתן את השימוש במשאבים המעבדה שלו. אנו מודים על מר מינג-ג'יאה-וו לסיוע טכני מעולה. EF הוא חוקר HHMI. עבודה זו נתמכה על ידי מתנה ג'ון Monsky ואת קרן המחקרים של מחלת ליים Monsky של ג'ניפר וייס.

<ol><li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission%3A+Translational+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).</li>
<li>Hooper, L. V., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+host-bacterial+relationships+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commensal host-bacterial relationships in the gut.</a> Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).</li>
<li>Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worlds+within+worlds%3A+evolution+of+the+vertebrate+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota.</a> Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).</li>
<li>Narasimhan, S., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+microbiome%3A+the+force+within%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Tick microbiome: the force within.</a> Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).</li>
<li>Weiss, B., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome+influences+on+insect+host+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitoly%22%5BJournal%5D)">Microbiome influences on insect host vector competence.</a> Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).</li>
<li>Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+microbiome+of+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The functional microbiome of arthropods.</a> PLoS One. 12 (5), e0176573(2017).</li>
<li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+ticks%2C+mice+and+men%3A+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li>
<li>Sojka, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+machinery+of+blood+digestion+by+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">New insights into the machinery of blood digestion by ticks.</a> Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).</li>
<li>Grigor'eva, L. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1134/S0013873810030073">Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle.</a> Entomological Review. 90, 405-409 (2010).</li>
<li>Goodrich, J. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25036628">Conducting a microbiome study.</a> Cell. 158 (2), 250-262 (2014).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biology. 12, 87(2014).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+specific+mRNAs+in+Xenopus+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Development. 110 (2), 325-330 (1990).</li>
<li>Frank, D., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+XMyoD+in+non-somitic+mesoderm+of+Xenopus+gastrulae%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae.</a> Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).</li>
<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kernohan, K. D., Berube, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+dual+labelled+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+analysis+in+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections.</a> MethodsX. 1, 30-35 (2014).</li>
<li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+ticks%22">Biology of ticks</a>. , Oxford University Press. (1991).</li>
<li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+tick+vector+Ixodes+scapularis+modulate+colonization+of+the+lyme+disease+spirochete%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete.</a> Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).</li>
<li>Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+lato+by+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+on+whole-body+sections+of+Ixodes+ricinus+ticks+and+gerbil+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies.</a> Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).</li>
<li>Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+set+of+16S+rRNA-based+probes+for+detection+of+bacteria+in+human+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces.</a> Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).</li>
<li>Quast, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+ribosomal+RNA+gene+database+project%3A+improved+data+processing+and+web-based+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools.</a> Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).</li>
<li>Yilmaz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SILVA+and+%26%2334%3BAll-species+Living+Tree+Project+%28LTP%29%26%2334%3B+taxonomic+frameworks%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The SILVA and &#34;All-species Living Tree Project (LTP)&#34; taxonomic frameworks.</a> Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((probeBase--an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+new+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).</li>
<li>Narasimhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+tick+gut+milieu+by+a+secreted+tick+protein+favors+Borrelia+burgdorferi+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization.</a> Nature Communication. 8 (1), 184(2017).</li>
<li>Bryant, S., Manning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+gel+electrophoresis+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Bioliogy%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA.</a> Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+ribosomopathy+genes+during+Xenopus+tropicalis+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis.</a> BMC Development Biology. 16 (1), 38(2016).</li>
<li>Khokha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+probes+for+the+study+of+Xenopus+tropicalis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development.</a> Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).</li>
<li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).</li>
<li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+DOPE+%28double+labeling+of+oligonucleotide+probes%29-FISH+%28fluorescence+in+situ+hybridization%29+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li>
<li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057(2013).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

זהו השימוש הראשון טכניקה הכלאה (WMISH) כולה-הר בחיי עיר ללמוד את microbiota של וקטור arthropod של פתוגנים. פרוטוקול שלנו הותאם מאחד המשמשות ללימוד פיתוח בדרוזופילה וב -צפרדע עוברי25,26. RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר נעשה שימוש באופן שגרתי כדי להתאים לשפה ג'ין תעתיקים במרחב, חנותם27 והדמיה של תעתיקים יכול להיעשות על-ידי שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אימצנו לשעבר לקראת זיהוי של microbiota במעיים שנתות. חשוב לציין...

האדם ובעלי פתוגנים ששודרו על-ידי וקטורים arthropod מצויים ברחבי העולם בחשבון כ- 20% של מחלות זיהומיות ברחבי העולם1, אך יעיל ואני בטוח חיסונים נגד רוב פתוגנים אלה אינן זמינות. הבנתנו תפקידה החשוב של מיקרואורגניזמים commensal, סימביוזה, פתוגניים, המכונה באופן קולקטיבי microbiome2, להתכוונן בעיצוב הבריאות של metazoans כמעט כל3 מתרחבת. עכשיו זה ברור arthropod וקטורים של פתוגנים הנמל גם בטן microbiota microbiota הקשורות וקטור אלה הוכחו השפעה מגוונים פתוגנים בעקיצות וקטור4,5. Microbiome arthropod מורכב eubacteria, ארכאונים, וירוסים, חיידקים האיקריוטים כגון חד-תאיים, נמטודות פטריות6. עם זאת, מוקד מחקר השולט כבר ב eubacteria נובע, בין השאר, את הזמינות של סמן גנים ובסיסי התייחסות לזהות חברי חיידקי ספציפי.
עם דגש על Ixodes scapularis, וקטור שנתות של פתוגנים האנושי מרובים כולל Borrelia burgdorferi7, סוכן סיבתי של מחלת ליים, אופטימיזציה של טכניקה ויזואליזציה מיקרוביאלי היה מכוון שיפור ההבנה שלנו של microbiota בטן שנתות בהקשר של אינטראקציות פתוגן-וקטור. מספר שאלות נותרו להיענות בשדה microbiome שנתות. הוא האתר של המורחבת המפגש הראשון בין השניה את הפתוגן נכנסות בהקשר של פתוגנים המועברים אופקית; לכן, להבין את התפקיד של וקטור microbiota בטן ב להתכוונן פתוגן-וקטור אינטראקציות תחשוף תובנות משמעותיות. קרציות יש מצב ייחודי של עיכול ארוחת דם, עיבוד של ארוחת דם רכיבים לוקח המקום intracellularly8. לומן מעיים לכאורה משמש קיבול להכיל את ארוחת דם כמו ההזנות שנתות, והוא מזין עיכול והטמעה ensue לאורך מספר ימים של האכלה ולהמשיך כסיגנל שלאחר. פתוגנים שרכשה את תקתוק שהאכילה הזן לומן הבטן יחד עם bloodmeal והופך ובכך לומן אתר ראשי של אינטראקציות בין שנתות, הפתוגן, תושב microbiota. כמו עיכול ממשיך דרך כסיגנל שנתות Ixodid משיר, הבטן עובר שינויים מבניים ופונקציונליים9. את ההרכב ואת הארגון המרחבי של חיידקים במעיים סביר גם משתנים בתיאום עם הבטן משתנה הסביבה שבה התרחשה. חשוב, לכן להבין את הארכיטקטורה של תושב חיידקים בבטן שנתות כדי להבין באופן מלא את הגומלין של שנתות הפתוגן, הבטן microbiota.
טכניקות מולקולריות כדי לתאר microbiota מארח-הקשורים באופן שגרתי לנצל אסטרטגיות רצפי מקביל בתפוקה גבוהה10 כדי להגביר את רצף ה-DNA חיידקי מטוסי אף-16 30s ריבוזומלי (rDNA). אלה אסטרטגיות רצפי לעקוף את הצורך להשיג axenic תרביות של חיידקים מסוימים מספקים תיאור מעמיק של כל חברי חיידקי ייצג במדגם. למרות זאת, אסטרטגיות מעין אלו הם מבולבל על ידי חוסר היכולת להבחין בין הסביבה מציג מתושבים bona פיד ה . עוד יותר, כאשר הערכת במדגמים, כגון קרציות, הינם קטני מידות ומכילות ומכאן DNA ספציפיים microbiota נמוך התשואות, הסבירות של הגברה של מזהמים סביבתיים מוגברת11 ותוצאות של פרשנות חד משמעיים של ההרכב microbiome. אפיון פונקציונלי בשיתוף עם הפריט החזותי של חיידקים קיימא ספציפי, לכן, תהיה קריטית כדי להגדיר ולהבחין את microbiome של שנתות חנותם והמרגשים. לעבר המטרה הזו, אנחנו ניצלו את העובדה RNA כולה-הר בחיי עיר הכלאה. טכניקה זו משמשת באופן שגרתי כדי להעריך את ג'ין תבניות ביטוי איברים, העוברים12,13,14 ומאפשר ניתוח semiquantitative של הביטוי על המדגם בכל עניין. זה שונה מסורתי בחיי עיר טכניקות הכלאה אשר לנצל את מקטעי רקמת ולעיתים קרובות דורשים ניתוח מקיף של חומר משרטוטי עם אסיפה חישובית לחזות ביטוי איברים כל15. בעוד כולה-הר מתייחס בדרך כלל אורגניזמים כל12, כאן כולה-הר מתייחס כל אומץ או איברים. יתרונות השימוש כולה-הר RNA בחיי עיר הכלאה הגישה כדי להעריך את הארכיטקטורה של שנתות בטן microbiota הם multifold. הבטן שנתות מורכב 7 זוגות diverticula, כל זוג משתנה גודל16. ההבדלים פונקציונלי, אם בכלל, בין אלה diverticula, אינם מובנים בהקשר של שנתות ביולוגיה, לתקתק אינטראקציות microbiota או פתוגן-שנתות. המניפולציות של המעיים, זה קרע את diverticula בטן תחסיר microbiota נוכח לומן מעיים או אלה הקשורים באופן רופף הבטן ואת התוצאה פירוש מוטעה של לוקליזציה המרחבי של microbiota. התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה יש כבר מנוצל קודם לבחון שנתות בטן תעתיקים17 על-ידי תיקון ופתיחה diverticula בטן בודדים כדי להבטיח בדיקה הכלאה וכדי להתאים לשפה burgdorferi דרב תעתיקים באמצעות חלוקתה פרפין-מוטבע כל קרציות18. שתי גישות אלה דורשים מניפולציות של הרקמות שנתות לפני הכלאה שישפיעו על הארכיטקטורה microbiota בטן.
בדו ח זה, נתאר בפירוט את פרוטוקול לבחון microbiota בטן שנתות קיימא באמצעות כולה-הר בחיי עיר הכלאה (WMISH). השימוש של ה-RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר מאפשר הבנה גלובלית של נוכחות ושפע של הבטן ספציפי חיידקים באזורים שונים של המעיים, עשויה לדרבן תובנות חדשות שנתות ביולוגיה בטן בהקשר של פתוגן קולוניזציה ושידור. עוד יותר, השימוש של הגששים RNA נגד RNA חיידקי ספציפי מאפשר זיהוי של קיימא חיידקים בבטן שנתות.

<table><tbody><tr><td>Sefar NITEX ניילון רשת, 110 מיקרון</td><td>אמזון</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ניו אינגלנד Biolabs&nbsp;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (ללא RNAse)</td>ערכת סינתזת RNA של <td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 ערכת סינתזת RNA</td> של <td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 ערכת סינתזת RNA בעלת תפוקה גבוהה</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>מים, ללא RNase, מטופל ב-DEPC</td><td>ביואנליטי אמריקאי</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M, pH 8.0</td><td>אמריקן ביואנליטי</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד, 37%</td> <td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>ביואנליטי אמריקאי</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>טריאתנולאמין הידרוכלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>אנהידריד אצטי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>320102-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>RNA משמרי</td> <td>טורולהסיגמא אולדריץ'</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>הפרין, מלח נתרן</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>הפתרון של דנהרדט, 50X</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS הידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>מגיב חוסם</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-דיגוקסיגנין-AP, שברי פאב</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>לבמיסול הידרוכלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>מצע כרומוגני לפוספטאז אלקליין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>הפתרון</td></tr><tr><td>של</td><td>11442074001 Bouin Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>סולם RNA חד גדילי</td><td>אמביון -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;#11 להבי פלדה עתירי פחמן&nbsp;</td><td>C ו-A בכורה מדעית</td> <td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>VWR</td><td>DS-500E שייקר</td><td></td>אורביטלי</tr><tr><td>דיגיטלי רועד אמבט מים BELLCO</td><td>Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Gel&nbsp; מערכת תיעוד</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ מערכת</td><td></td>תיעוד ג'ל</tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה בהיר&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; קופסת אור</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת לכידת תמונות</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת עריכת תמונה&nbsp;</td><td>אדובי&nbsp;</td><td>Adobe Photoshop CS4 גרסה 11.0</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>מכשור תואם אוטומציה</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).&nbsp;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

מחלות זיהומיות המועברת על ידי וקטורים arthropod ימשיכו להוות איום משמעותי על בריאות האדם ברחבי העולם. פתוגנים גרימת מחלות אלו, אינם קיימים בבידוד כאשר הם ליישב את הווקטור; במקום זאת, הם כנראה לעסוק אינטראקציות עם מיקרואורגניזמים תושב ב לומן מעיים. Microbiota וקטור הוכח כדי לשחק תפקיד חשוב בפתוגן שידור עבור מספר מחלות נישאות וקטור. בין אם תושב חיידקים בבטן של השניה Ixodes scapularis , הוקטור של מספר פתוגנים האנושי כולל Borrelia burgdorferi, להשפיע על השידור שנתות של פתוגנים לא נקבע. אנחנו דורשים שיטות עבור אפיון ההרכב של חיידקים הקשורים עם הבטן שנתות כדי להקל על הבנה טובה יותר של פוטנציאל אינטראקציות בין זנים בבטן שנתות. שימוש כולה-הר בחיי עיר הכלאה להמחיש תעתיקים RNA הקשורים למין מסוים חיידקי מאפשר האוסף של נתונים איכותיים לגבי שפע והפצה של microbiota בתוך הרקמה ללא פגע. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבחון שינויים וחשש microbiota הבטן במהלך שנתות האכלה, ניתן להחיל גם לנתח את הביטוי של גנים שנתות. צביעה של כל שנתות אומץ התשואה מידע אודות התפלגות מרחבית ברוטו היעד RNA ברקמה ללא צורך שחזור תלת מימדי, מושפע פחות זיהום סביבתי, אשר לעיתים קרובות מבלבל את מבוסס על רצף שיטות שימוש תכוף ללמוד קהילות מיקרוביאלי מורכבים. בסך הכל, טכניקה זו היא כלי רב ערך שיכול לשמש טוב יותר להבין וקטור-פתוגן-microbiota אינטראקציות ותפקידם העברת מחלות.

מדידה, הערכה של איכות הגששים RNA הם קריטיים לפני תחילת ההכתמה. במבחנה שעתוק יעילות מאוד תלוי כמות ואיכות תבנית ה-DNA. אנחנו באופן שגרתי דמיינו את הגששים RNA על ג'ל פורמלדהיד כדי לאמת את הטוהר ואת כמות בדיקה שנוצר על ידי התגובות שעתוק. הגששים אמור להופיע כרצועות בהיר, דיסקרטית (איור 2). מדידות spectrophotometric ריכוז ה-RNA היו מאוד מעידה על איכות המכשיר מתואם היטב עם המראה של הלהקות הג'ל. לפיכך, הצעד ויזואליזציה ג'ל ייתכן יבוצע במידת הצורך לאחר היכרו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי אנטומולוגיה של קרציות, כגון הערכת נוכחות של חיידקים ברי קיימא בקרצייה מרחבית וזמנית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא אינה דורשת חתך של הקרציות או ציוד יקר, ושהיא מאפשרת הדמיה מרחבית וזמנית של תעתיקי גנים. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שהיא כרוכה במספר שלבים וריאגנטים.עם זאת, טכניקה זו אינה מייגעת. למרות שזה יכול לקחת כשלושה ימים, הזמן המעשי הוא רק כמה שעות בכל יום. כהכנה, האכילו את הקרציות שנאספו במשך 48 עד 72 שעות לפני איסוף המעיים.כדי לנתח את המעיים מהקרצייה, הוסיפו 20 עד 30 מיקרוליטר של תמיסת MEMFA למגלשת זכוכית נקייה. לאחר מכן הניחו את הקרצייה ב-MEMFA, והתאימו את המיקוד לראש הקרצייה. כעת, באמצעות זוג סכיני גילוח סטריליים מפלדת פחמן גבוהה חותכים את אזור הראש בשקע ומשאירים את גוף הקרצייה בטקט.לאחר מכן, לחץ בעדינות על הגוף כדי לדחוף את דיברטיקולת המעי ובלוטות הרוק אל מחוץ לקוטיקולה של הגוף. לאחר מכן, מבלי לפגוע במעיים, הפרד אותם בזהירות מבלוטות הרוק וגרף בזהירות את החתכים על סכין גילוח. אסוף את כל המעיים שנקטפו בצינור של 1.5 מיליליטר ב-500 מיקרומטר של MEMFA.לאחר מכן דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדינה למשך שעה. למחרת יש לייבש את הרקמה כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט ולאחסן אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס. להכנת סל רשת, ראשית, השתמש בלהב קצה יחיד מחומם על אזמל כדי לחתוך את התחתית מצינור צנטריפוגה עליון של שני מיליליטר או חמישה מיליליטר.ייתכן שיהיה צורך לחמם את הלהב מספר פעמים לפני השלמת החיתוך. לאחר מכן, חותכים ריבוע של רשת ניילון 110 מיקרון שהיא מעט גדולה יותר מהפתחים החדשים. לאחר מכן, הצמידו את הרשת לפתח על ידי לחיצה קלה של הצינור לתוך הרשת על פלטה חמה המוגדרת לחום בינוני/נמוך עד לקבלת סל טוב.לאחר שהוא מתקרר, חתוך את הרשת העודפת וודא שאין פערים. הכינו 24 מהסלים הללו כך שיתאימו לצלחת של 24 בארות. לאחר מכן, חותכים חורים לכיסוי של צלחת 24 בארות, כך ששפת סל הדגימה תתפוס את החור ולא תיפול.בסיום, סלי הדגימה המורכבים צריכים לשבת כל הדרך לבארות. כעת, השתמש במחזיק סל מצויד זה כדי להעביר סלים מצלחת אחת לאחרת בקלות יחסית לאורך כל ההכלאה באתר. השתמש בשתי צלחות כאלה כך שבזמן שהדגימה דוגרת באחת, השנייה תוכל להתכונן לכביסה הבאה.סעיף זה מכסה שלבים מסוימים של הכלאה באתר. עיין בפרוטוקול הטקסט לתיאור מלא. כדי להתחיל, העבירו כל דגימת רקמה קבועה לסל דגימות מסומן.ארגן את הצלחת לפי תנאי ניסוי, וצבוע לפחות חמישה מעיים בכל מצב. ראשית, החזר בעדינות את הדגימות. הימנע מהכנסת בועות אוויר על ידי הגדלה הדרגתית של היחס בין PBS-T לאתנול בכל שטיפה.במהלך היום הראשון, לאחר שלב ההיברידיזציה של שעתיים, במקום להשליך את מאגר ההכלאה, אחסן אותו לשימוש עתידי במהלך הבדיקה. מאוחר יותר, כאשר מטפלים בדגימות בתמיסת הכלאה של בדיקה, יש לכסות את הצלחת היטב בנייר אלומיניום כדי למנוע אידוי של התמיסה. ביום השני, טען את מאגר ההכלאה השמור לצלחת 24 הבארות, וחמם את הצלחת עד 60 מעלות צלזיוס.מאוחר יותר באותו יום, כדי להסיר את כל עקבות הבדיקה ומאגר ההכלאה, שטפו את הדגימות פעמיים עם 2x SSC למשך שלוש דקות לכל שטיפה. לאחר מכן שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם 2x SSC למשך 20 דקות לכל שטיפה ב-60 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכן את הנוגדן העיקרי במאגר חוסם.טען 500 מיקרוליטר מהתערובת הזו לכל באר. לאחר שלב החסימה יש לדגור בטמפרטורת החדר כארבע שעות או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום השלישי, הפעל את תגובת הצבע במצע כרומוגני.מכסים את צלחת הדגימה בנייר אלומיניום. ובמהלך התגובה, בדוק מעת לעת אם יש מכתים יתר במיקרוסקופ הדיסקציה. ביום הרביעי חשוב לדגור ולהלבין על קופסת אור מכיוון שהדבר מאפשר להסיר כל פיגמנטציה בדגימות או בצבע מהתמיסה של בואן, ומשפר את אות הבדיקה להדמיה ברורה.לאחר מכן לאחר שטיפה עם SSC, העבירו בזהירות את דגימות המעיים על ידי היפוך הסל לצלחת חדשה של 24 בארות. בזמן שהייה בבארות, שטפו היטב את הסלים באמצעות אתנול 70%. לאחר מכן הקדימו בהדמיית הדגימות.זה קריטי להעריך את איכות בדיקות ה-RNA לפני השימוש בהן. ניתן לבדוק את הבדיקות על ג'ל פורמלדהיד. אם הם מופיעים כרצועות בהירות ונפרדות הם באיכות טובה.בעת צביעה שונות מסוימת בפיזור היא נורמלית בין שכפולים ביולוגיים כמו גם בין שבעת זוגות הדיברטיקולות של מעיים בודדים. לכן, עדיף להכתים לפחות חמישה מעיים בכל מצב כדי לקבל מושג על דפוס צביעה ממוצע. ההצלחה הכוללת נמדדת בצורה הטובה ביותר על ידי השוואת הצביעה של דגימות חושים ואנטי-סנס עבור כל מצב.יש לפתח את שניהם לאותו פרק זמן. דגימות החישה צריכות להיות בעלות צבע סגול מינימלי עד ללא צבע, בעוד שדגימות האנטיסנס צריכות להציג צביעה חזקה עם רקע מינימלי. באופן קריטי, הרקמות חייבות להיות במלואן בכתם לחשיפה אחידה.חשוב להימנע מהתפתחות יתר של תגובת הצבע. זה יכול לגרום לכמות גבוהה של כתמי רקע, ודגימות החישה עשויות להתחיל להיראות כמו דגימות אנטיסנס. גורם נוסף שמשפיע על התוצאות הוא כמה הקרציות מוזנות מראש.קשה לעבוד עם קרציות שלא ניזונו, או שניזונו במשך 24 שעות בלבד. המעיים שלהם נפגעים ביתר קלות ואינם מוכתמים היטב. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים וחצי עד שלושה אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל האספקה המפורטת בטבלת הריאגנטים והחומרים מוכנה לפני תחילת הניסוי. תודה על הצפייה, ובהצלחה בניסויים שלך.

visualization-microbiota-tick-guts-whole-mount-situ

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

ליים מחלות מחקר מחקרים לעיתים קרובות דורשים דור של קרציות נגוע הפתוגן Borrelia burgdorferi, תהליך זה לוקח בדרך כלל מספר שבועות. כאן אנו מדגימים microinjection מבוססי זיהום סמן הליך זה יכול להתבצע תוך שעות ספורות. אנחנו גם להדגים שיטה immunofluorescence עבור בלוקליזציה באתרו של B. burgdorferi בתוך קרציות.

שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק

Visualizing חיידקים בנמטודות באמצעות מיקרוסקופיה פלורסנט

מקור: נג, ק. מ., טרופיני, ק. הדמיית אינטראקציות בין מיקרוביוטה במעי למארח באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית במקום , צביעת לקטין והדמיה. J. Vis. Exp. (2021).סרטון זה מדגים את תהליך היברידיזציה פלואורסצנטית במקום (FISH) לצביעת מיקרוביום המעי ברקמת מעי העכברים על ידי היברידיזציה של גלאי פלואורסצנטיים ל-rRNA חיידקי (חומצה ריבונוקלאית ריבוזומלית) וצביעה נגד מבני המארח לניתוח מיקרוסקופי.

היברידיזציה פלואורסצנטית במקום של חיידקי מעי בחתכי מעי בעכברים

סרטון זה מדגים הדמיה של חיידקים ברקמת שלפוחית השתן מחולה נגוע בדרכי השתן. בדיקה בעלת תווית פלואורסצנטית המשולבת עם רנ"א ריבוזומלי חיידקי 16s חושפת את החיידקים הקשורים לרקמות ואת תפוצתם, ומספקת תובנות מרחביות יקרות ערך לגבי צפיפותם בתוך הדגימה.

הדמיה של חיידקים במקטעי ביופסיה של שלפוחית השתן באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

מחלת ליים היא המחלה וקטור הנישא ביותר המדווח בדרך כלל בצפון אמריקה. הסוכן סיבתי, Borrelia burgdorferi הוא חיידק החיידק מועבר על ידי קרציות Ixodid. הילוכים וזיהוי של זיהום במודלים של בעלי חיים מותאם על ידי השימוש בהאכלה לתקתק, שאנו מתארים כאן.

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

כאן אנו מציגים פרוטוקול הדור הבא רצפי עבור מטוסי אף-16 rRNA רצף המאפשרת זיהוי ואפיון של קהילות חיידקים בתוך וקטורים. שיטה זו כרוכה DNA החילוץ, הגברה, barcoding דגימות באמצעות PCR, רצף תאים זרימה, ביואינפורמטיקה כדי להתאים את רצף נתונים למידע פילוגנטי.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש את הצורה של קנדידה אלביקנס תא ולוקליזציה במערכת העיכול היונקים.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

פרוטוקול יעיל זה מפרט זרימת עבודה לזיהוי ותמונה של חיידקים בדגימות רקמות מורכבות, החל מתיקון הרקמה ועד להכתמת חיידקים עם פלואורסצנטיות בהכלאה במקום .

הדמיה של אינטראקציות מארחות מיקרוביוטה במעיים באמצעות פלואורסצנטיות בהכלאה במקום , כתמי לטין והדמיה

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

במאמר זה אנו מתארים הליך המאפשר זיהוי כלל איברי של חיידקים פתוגניים במהלך ההדבקה וכימות של פעילות המדווח הפלואורסצנטי.

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף רוק, המולימפה, בלוטות הרוק והמעי האמצעי, לאחר דיסקציה של קרצייה בודדת שניזונה, כדי לחקור לוקליזציה ספציפית לרקמה של פתוגנים הנישאים על ידי קרציות כדי לקדם את ההבנה של יכולת הווקטור ואינטראקציות פתוגן-מיקרוביום.

מיצוי רוק, המולימפה, בלוטות רוק ומעי תיכון מקרציות בודדות (Acari: Ixodidae)

למד שיטת הכלאה כולה-הר לוויזואליזציה של מיקרוביוטה חיה במעיי קרציות. שיטה זו מאפשרת הערכה מרחבית וזמנית של חיידקים ללא ציוד יקר, ומסייעת לחוקרי אנטומולוגיה להבין אינטראקציות בין קרציות לחיידקים.

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

גלה סרטונים נוספים