שימוש בתצוגת Phage לפיתוח אפננים משתנים של אוביקוויטין עבור ליגות E3
August 27th, 2021
בכל מקום הוא שינוי חלבון קריטי לאחר התרגום, dysregulation אשר היה מעורב במחלות אנושיות רבות. פרוטוקול זה מפרט כיצד ניתן להשתמש בתצוגת פאג ' כדי לבודד וריאנטים חדשניים בכל מקום שיכולים לאגד ולווסת את הפעילות של רצועות E3 השולטות על הספציפיות, היעילות והדפוסים של כל מקום.
תצוגת פאג ' לא רק מסייעת לנו לחקור את המאפיינים המחייבים של אנזימים חשובים מבחינה קלינית, אלא גם לפתח אפננים לאותם אנזימים ולמחלות המתאימות. תצוגת Phage יכולה לשמש לפיתוח קלסרים חדשניים עבור מגוון רחב של חלבוני יעד והיא גם קלה יותר לביצוע מאשר שיטות תצוגה קונבנציונליות אחרות. הליך זה כלל הרבה פעולה חוזרת ונשנית, ולכן המפתח הוא לא טייס אוטומטי ולהישאר ממוקד לאורך כל הדרך.
התחל על ידי חנק 30 מיליליטר של ציר טטרציקלין 2YT עם 200 microliters של תרבות הזרעים. לדגור אותו במשך כשלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולי עד החיידקים נמצאים בשלב אמצע היומן. יש להשליך את תמסת הציפוי מהצלחת לכיור.
יבש אותו בעדינות עם מגבות נייר. לאחר מכן להוסיף 200 microliters של חוצץ PB לכל באר מצופה. יש להשליך את חיץ ה-PB מהצלחת ולייבש אותו על מגבות נייר.
מוסיפים עוד 200 מיקרוליטרים של חוצץ PB לכל באר מצופה של הצלחת. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי. להפשיר את ספריית הפאג' על הקרח, ואז לדלל אותה לפי 100 מהמגוון בספרייה ב-PBS.
מוסיפים את תמיסת הנתרן כלורי פוליאתילן גליקול בחמישית מנפח הספרייה המדוללת ודגרים את הפתרון על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הפתרון ב 11, 000 פעמים G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant צנטריפוגה אותו עוד שתי דקות כדי למשוך את supernatant הנותרים ולרכז את גלולה פאג '.
בעדינות resuspened את גלולה פאג במיליליטר אחד של חוצץ PBT לכל חלבון היעד להיות מנותח, בדרך כלל ארבעה בסך הכל. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ספריית פאג' לכל באר מצופה בלוח הבקרה. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי.
יש להשליך את חיץ ה-PB מצלחת היעד לכיור ולייבש את הצלחת על מגבות נייר. מעבירים את כל 100 המיקרו-לייטרים של ספריית הפאג' בלוח הבקרה לכל באר מצופה של לוחית המטרה. לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה עם 300 סל"ד רעד מסלולי.
לאחר מכן, להסיר את ספריית פאג מהצלחת ולשטוף את הבארות מצופות ארבע פעמים עם חוצץ PT. הפוך את הצלחת והקש על מגבת נייר כדי להסיר את טיפות החיץ האחרונות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית טוחנת 0.1 לכל באר מצופה כדי לחמוק מהפיג'.
לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות עם 300 סל"ד רעד מסלולי. לאחר מכן, לנטרל את ה- pH על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטרים של pH 11 טריס הידרוכלוריד טוחנת אחת לכל באר מצופה. מעבירים את הפאג' הנבה מכל שמונה בארות לצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מיליליטר.
פיפטה למעלה ולמטה במהלך ההעברה כדי להפוך פתרונות הומוגניים ושאיפה כל נוזל מן בארות. הוסף 10% BSA ל phage eluted כדי להפוך את הריכוז הסופי 1%לאחסן את צינור microcentrifuge בארבע מעלות צלזיוס. זהו הפלט העגול הראשון.
הכן תרבות זרעים לפולחן קלט הפאג ' לסיבוב הבחירה הבא על ידי חנק חמישה מיליליטרים של תרבות זרעי טטרציקלין 2YT עם מושבת E.coli מבודדת מצלחת אגר. לדגור אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולית. לדלל את חלבון היעד בסיבובים שניים ושלוש צינור עם כמות מתאימה של PBS.
יש ליטול מחצית מתכולת הסיבובים 2 ו-3 צינור ומצפה ארבע בארות לכל חלבון יעד בלוח כריכה של 96 בארות לסיבוב הבא. לאחר מכן, השתמש בחצי מהפלט העגול כדי לחסן שלושה מיליליטרים של תאי פאזה באמצע יומן הרישום. לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם 200 סל"ד רעד מסלולית.
הוסף M13KO7 עוזר פאג לריכוז סופי של 10 מיליארד PFU למיליליטר. לדגור אותו שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה עם 200 סל"ד רעד מסלולי. לאחר שעה, להעביר את כל שלושת מיליליטר של תרבות ל 30 מיליליטר של פתרון 2YT carbenicillin kanamycin.
לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 200 סל"ד רעד מסלולית. התוצאות הייצוגיות לבחירה בגרסה בכל מקום מול UBE4B מוצגות כאן. UBVs הוזמנו מהתדירות הגבוהה ביותר לנמוכים ביותר.
רצפים מייצגים את אזור היוביקוויטין המגוון ב- UBV עם כל השאריות האקראיות. הזיקה המחייבת היחסית של הקלסרים לחלבון היעד של סוג הבר, חלבון היעד שעבר מוטציה, כמו גם חלבונים מחוץ למטרה נמדדת על ידי חיסון הקשור לאנזים או ELISA. כל ספיגות ELISA היו מנורמלות מול 96 ציוני BSA ELISA בממוצע ו 96 ציונים ממוצעים GST ELISA.
ירוק כהה יותר מייצג את הכריכה היחסית החזקה יותר. GST נכלל כפקד עבור כריכה לא מינית מכיוון שחלבון היעד מתויג GST. תוצאות ELISA מוצגות כאן באופן גרפי.
ציר ה- x מייצג את ה- UBVs וציר ה- y מייצג את הספיגה המנורמלת המתאימה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב כי אתה לא להשליך את הפתרון בצלחת לאחר הוספת חומצה הידרוכלורית. הפאג'ים מושעים כעת בפתרון וברצונך לשמור אותם כך שתוכלו לבצע ניתוחים אחרונים של העשרה או שניהם.
לאחר הליך זה, יש לבצע רצף כדי לקבוע תדרי UBV. ELISAs ובבדיקות IC50 ניתן לעשות כדי לקבוע יעילות מחייבת ויעילות מעכבות בהתאמה וגם כדי לעזור לקבוע אילו UBVs לאפיין עוד יותר.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה דן בשימוש בתצוגת בקטריופאג כדי לבודד וריאנטים חדשים של אוביקוויטין שיכולים לווסת ליגזות E3 המעורבות באוביקוויטיניזציה. אוביקוויטיניזציה היא שינוי פוסט-תרגומי חיוני המקושר למחלות אנושיות שונות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביוכימיה
- הנדסת חלבונים
רקע
- אוביקוויטיניזציה היא חיונית לויסות פירוק חלבונים ותהליכים תאיים.
- ויסות לקוי של אוביקוויטיניזציה קשור למחלות רבות.
- תצוגת בקטריופאג היא טכניקה חזקה לגילוי אינטראקציות חלבונים.
- שיטה זו מאפשרת פיתוח של מודולטורים ספציפיים לאנזימים.
מטרת המחקר
- לבודד וריאנטים חדשים של אוביקוויטין באמצעות תצוגת בקטריופאג.
- להבין כיצד וריאנטים אלו יכולים להשפיע על פעילות ליגזות E3.
- לחקור את ההשלכות של ויסות אוביקוויטיניזציה בהקשרים של מחלות.
שיטות ששימשו
- חסינה של תרבויות חיידקים בציר 2YT טטרציקלין.
- דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור מסלולי.
- שימוש בטכניקות תצוגת בקטריופאג למבחני קישור.
- בידוד ואופיין של וריאנטים של אוביקוויטין.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של וריאנטים חדשים של אוביקוויטין.
- מאפייני קישור מופגנים לליגזות E3.
- פוטנציאל לווריאנטים אלו לווסת דפוסי אוביקוויטיניזציה.
- תובנות לגבי תפקיד האוביקוויטיניזציה במנגנוני מחלות.
מסקנות
- תצוגת בקטריופאג היא שיטה יעילה לגילוי וריאנטים של אוביקוויטין.
- ויסות פעילות ליגזות E3 עשוי להיות בעל השלכות טיפוליות.
- יש צורך במחקר נוסף כדי לחקור את היישומים הקליניים של ממצאים אלו.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Phage display-driven engineering of ubiquitin variants (UbVs) enables precise modulation of E3 ligases, a critical inflection point for target validation in ubiquitin-proteasome system research. This approach enhances predictive confidence in early discovery by generating high-affinity, specific binders for mechanistic de-risking and functional interrogation of E3 ligase biology. The resulting UbVs support portfolio triage and prioritization by providing robust tools for downstream assay development and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of E3 ligase function using engineered UbVs with improved affinity and specificity.
- Supports biological de-risking by isolating variants that discriminate between wildtype and mutant or off-target proteins.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and mechanistic studies through iterative selection and enrichment.
Screening & Assay Development
- Provides validated UbVs for use in ELISA and IC50 assays to quantify binding and inhibitory efficacy.
- Enables reproducible, quantitative assessment of UbV-target interactions across multiple rounds of selection.
- Supports assay standardization and scalability for reliable compound evaluation and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered UbVs with disease-relevant E3 ligases for translational biomarker studies when supported by downstream characterization.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling further functional and inhibitory profiling of selected UbVs.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical models by providing specific molecular tools for pathway interrogation.
Pipeline & Workflow Integration
This phage display platform integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and quantitative assay development for E3 ligase modulators.
- Discovery Biology: Iterative selection and enrichment clarify E3 ligase binding pathways and validate target engagement.
- Screening: ELISA and IC50 assays with UbVs deliver reproducible, quantitative outputs for downstream evaluation.
- Analytics: Sequencing and absorbance normalization enable robust comparison of UbV binding profiles and selection frequencies.
- Translational Research: Characterized UbVs can be advanced for further disease-relevant studies as supported by binding and inhibition data.
- Enterprise Reuse: The phage display workflow is adaptable for diverse E3 ligases and other protein targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in E3 ligase target validation.
- Operational Value: Standardizes binder selection and assay development for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of validated targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of E3 ligase modulators across discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, protein engineering, and quantitative binding assays.
- Demands access to bacterial culture, phage handling, and ELISA instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of selection, washing, and analytical protocols.
- Adaptable to various E3 ligases and target proteins with appropriate library design.
- Dependent on rigorous washing and selection to avoid enrichment of weak or promiscuous binders.
