פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגלות אינטראקציות של חלבונים עם מולקולות פיתיון (bait) מקובעות. זאת מושג תחילה על ידי השגה וקיבוע של הפיתיון. השלב השני הוא הכנסת ספריית הפאג'ים המיועדת לסריקה אל הפיתיון, תחת תנאים המעודדים קישור.

בשלב הבא, הפאגים שאינם קשורים מוסרים באמצעות שטיפה מחמירה. בעוד שהפאגים הקשורים משמשים להדבקת החיידקים לפני שהם מופקים מחדש. השלב הסופי הוא הגברת הפאגים הקשורים לקראת האיטרציה הבאה של סלקציית זיקה.

בסופו של דבר, כאשר תיתור הפאגים מגיע למישור, נבחרים פלאקים בודדים ומסננתרים כדי להראות לאילו חלבונים יש את זיקת הגבוהה ביותר לליגנד המקובע תחת תנאי הקשירה הניסיוניים. תהליך זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנושא אינטראקציות בין חלבונים. הליך זה מתחיל בהנחת חלבון רקומביננטי מטוהר בתחתית של פלטות מיקרוטיטר, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.

השלב הבא הוא להנחית מושבה בודדת, שגודלה קודם לכן כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, לתוך מבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של מצע Luria burani עם 100 מיקרוגרם למיליליטר של ampicillin. יש לדגרה בטמפרטורה של 37 °C, במהירות של 200 RPM במנער אופקי, ולהשתמש בספקטרופוטומטר למעקב אחר צפיפות התאים עד לקבלת צפיפות אופטית (OD) של 0.5 עד 0.6 באורך גל של 600 ננומטר. לאחר מכן, יש להעביר את התאים לשפופרת Falcon בנפח 50 מיליליטר או לשפופרת דומה ולשמור בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש; התאים יישארו בדרך כלל חיוניים למשך כשבוע. ביום הראשון, יש להיערך לבחירת זיקה (affinity selection) כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, בבוקר היום השני.

הניחו תשעה בקבוקי ארלנמאייר ריקים בנפח 250 מיליליטר שעברו עיקור באוטוקלאב בתפסנים של שייקר אינקובטור. זרעו 500 מיליליטר של lal burani עם 500 מיקרוליטר מאחד מתרביות הלילה של תאי BLT 5 4 0 3 שנדבקו בפאג' שהוכנו בלילה שלפני. לאחר הנחת הבקבוק באינקובטור, הפעילו את הספקטרופוטומטר והגדירו אותו לקריאת בליעה ב-600 ננומטר. בינתיים, הוציאו את פלטת המיקרוטיטר מ-4 מעלות צלזיוס והסירו את קולט הפלסטיק. הסירו כל חלבון שאינו קשור מהפלטה על ידי שטיפה 10 פעמים עם 200 מיקרוליטר לבאר של 1X tris buffered saline או TBS pH 7.5, והקשת הפלטה כשהיא הפוכה על מגבת נייר בין השטיפות.

בצע חסימה באמצעות 200 µL למבבור של 5% חומר חסימה ב-TBS למשך שעה אחת. כאשר הפלטה עטופה בנייר נשבך, שטוף את תמיסת החסימה 10 פעמים עם 200 µL של 1X T-B-S-T, תוך써 הפכה של הפלטה והקשתה על ארבע שכבות של נייר סופג בין השטיפות.

מנקודה זו, השתמשו בטיפים עם פילטר מגן כדי למנוע זיהום צולב של פאגים. פפלו 100 microliters של ספריית הפאגים יחד עם החלבונים. אטמו שוב את הפלטה בעזרת ניילון נצמד והדגירו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

בסוף שעה אחת, הסירו את ניילון הנצמד מהפלטה ושטפו אותה מיד על ידי שפיכת הפאגים לתוך מיכל הפסולת הביולוגית. לאחר מכן, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להוסיף במהירות 200 µL של 1X TBST לכל באר. כוונו טיימר לדקה אחת.

לאחר דקה אחת, שפכו את הבופר לסל פסולת ביולוגית מסוכנת, הקישו עם הפלטה הפוכה על נייר סופג והניחו אותה בחזרה על השולחן. חזרו על שלבי השטיפה 10 פעמים. לאחר השטיפה ה-10, קחו 200 µL של תאי BLT 5 4 0 3 מהמבחנה (falcon tube) בנפח 50 mL בטמפרטורה של 4 °C והעבירו לתחתית כל אחת מתשע הבארים מהן הוסר השטיפה האחרונה.

עטפו את הצלחות בנייר נשבך (plastic wrap) והניחו אותן בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 20 דקות, כדי שכל פאג שעדיין דבוק לפיתיון ידביק את החיידקים בתום 20 הדקות. הסירו את העטיפה מהצלחות. לאחר מכן, העבירו 10 µL של חיידקים מבאר השכפול הראשונה ב-BSA בטמפרטורה של 25 degrees Celsius אל 990 µL של מצע המסומן כמספר אחת.

חזור על תהליך זה פעמיים נוספות עבור אותה באר, כך שיתקבלו שלושה כפילויות (triplicates) של דילול 1:100 של הפאג מאותה באר; זוהי שחזור BSA אחד שנדגם שלוש פעמים. דילולים אלו ישמשו להערכת התיתר הממוצע פלוס או מינוס השגיאה התקנית של הממוצע עבור אותו שחזור של BSA. בצע את אותו הדמה עבור שחזורים שניים ושלושה של BSA, עבור שלוש הבארים המשוכפלות של חלבון הפיתיון המורעל ועבור סט חלבון הפיתיון. הset של 27 מבחנות ה-EOR יש להניח בצד. אם הבקטריות בבקבוק נמצאות בצפיפות אופטית של 0.6 עד 1.0, העבר 50 milliliters של התאים מבקבוק ה-fern לתוך כל אחד מ-9 בקבוקי ארלנמאייר בנפח 250 milliliters.

קחו את 170 µL הנותרים של חיידקי BLT 5 4 0 3 שהודבקו בפאג מבאר השכפול BSA replication one והוסיפו אותם ל-50 mL של תאים המסומנים BSA rep.One. בצעו זאת עבור כל תשע הבארות לפני ניעור הבקבוקים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. במקביל, בצעו דילולות מהדילולות הראשוניות 27 על ידי לקיחת 100 µL של LB עם חיידקים מתוך מבחנת Einor 1 והוספתם ל-900 µL של LB במבחנת einor.

עבור הדילול של 10 למינוס שלישית, השליכו את טיפ המסנן והשתמשו בטיפ חדש לפני שאיבת 100 µL של LB עם חיידקים ממבחנה מספר ארבע והוספתם ל-900 µL של LB במבחנה השביעית. עבור הדילול של 10 למינוס רביעית, המשיכו בביצוע הדילול עבור כל השלישייה של כל החזרות של כל החלבונים והטיפולים. בסך הכל צריכות להיות 135 מבחנות לאחר ליזת התאים.

הבאו את התרבית לריכוז של 0.5 molar sodium chloride על ידי הוספה של חמישה milliliters ממלאי של five molar sodium chloride, והעבירו את הדגימה לבקבוק צנטריפוגה מסומן; צנטריפוגו ב-8,000 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. לאחר מכן, שפכו את supernatant המכיל את הנגיף לתוך מבחנה מסוג falcon של 50 milliliter נקייה וסטרילית. הוסיפו מספר טיפות של chloroform ל-supernatant שנשפך למבחנת ה-Falcon.

ניתן לשמור את העליון בטמפרטורה של 4 °C לסבב הבא של ברירה על בסיס זיקה (affinity selection) ביום השלישי; העבר בפיפט 250 µL של תאי VLT 5 4 0 3 מ-4 °C לכל אחת מבחנות הבורו-סיליקט הממוספרות שהוכנו מראש. לאחר מכן, העבר בפיפט 100 µL מהדילול שבמבחנה אחת לתוך 250 µL של תאים במבחנת בורו-סיליקט אחת. חמם קצרה את חמש השניות הראשונות של הפיפט מעל הלהבה וטבול אותה בתוך ה-top aros המותך.

שאבו שלושה מיליליטרים והעבירו במהירות למבחנה מעל התאים והפאג'. ערבבו על ידי נקישה עם אצבע בזמן החזקת המבחנה ביד השנייה, ולאחר מכן שפכו את התוכן על הצלחת. הטו את הצלחת והשתמשו במבחנה כדי להסיר בועות ואזורים יבשים עד שכל הצלחת תכוסה בשכבת ה-agar העליונה.

הניחו את המבחנה במצב אנכי על השולחן להתרשות. השליכו את מבחנת הבורוסיליקט. הוציאו את טיפ המסנן (filter barrier tip), השתמשו בטיפ חדש והמשיכו כך עד שכל סדרת המהלולים תועבר לצלחות.

הוציאו את המנות המוכנות מהאינקובטור ככל שהן נגמרות, אך לא יותר משיש בבת אחת כדי למנוע קירור והתמצקות מהירה מדי של שכבת האגר העליונה; בחנו את הפלאקים שהיווצרו במנות והשליכו את אלו עם ליזיס קונפלואנטית. קבעו אילו מהדילולים הסדרתיים שנותרו הניבו מספר פלאקים נמוך מספיק כדי לאפשר ספירה מדויקת. רשמו את מספר הפלאקים ממנות אלו והמשיכו בחישוב הטיטר כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט בסוף שלב הבחירה האפיניטית. בשלב רביעי, בחרו 18 מושבות פלאק בודדות ומוגדרות היטב באמצעות טיפ צהוב סטרילי.

הרט את פנים הטיפ באמצעות tris hydrochloride pH 8.5 בתוך מבחנת einor. לאחר מכן, בצע דגימת ליבה (core) של פלאקים מלוחות הטיטרציה על ידי דחיפת הטיפ דרך פלאק מבודד היטב ישירות אל צלחת הפטרי מפלסטיק שמתחתיו ושאיבת הליבה; פלט את הליבה אל תוך 100 µL של tris hydrochloride pH 8.5 במבחנה המתאימה לפני ערבוב ב-vortex. חמם בקצרה 20 µL מנפח זה בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות והמשך ב-PCR ובריצוף כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט; המוצגים כאן הם תוצאות טיטר typical על ידי דגימה מספר פעמים; הסכומים הסופיים המוערכים פחות רגישים לשגיאות פיפטינג ומהווים הערכה מדויקת יותר של הטיטר בפועל ושל השונות סביבו.

הערכות בין באור לבאור מראות עלייה בתיתר הפאג'ים, באופן מועדף עבור הפיתי הלא-מורעל, ככל שמספר סבבי סלקציית זיקה עולה. נתון זה מספק גם ביטחון בכך שהטכניקה פועלת. שימור של אחוז גדל והולך של פאג'ים המכילים אינסרט בבאורי הפיתי הלא-מורעל, ככל שמספר סלקציות הזיקה עולה, הוא סימן מבשר לטוב גם לאחר סבבים מתקדמים של סלקציית זיקה.

עלייה במספר הפאג'ים שהופקו באופן עצמאי ובעלי רצף מושבט (insert) ביחס לסבב הראשון, וריכוז של אמפליקונים אלו במספר רב של פסים בעלי גודל זהה, מהווים אינדיקציה טובה לכך שקלונים ספציפיים נבחרים בתהליך הברירה על בסיס זיקה (affinity selection) בעקבות פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Yeast Two-Hybrid, על מנת לתקף את האינטראקציות שהתגלו באמצעות תצוגת פאג'ים (phage display).