פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגלות אינטראקציות חלבון עם מולקולות פיתיון משותקות. זה מושג על ידי רכישה ושיתוק של הפיתיון. השלב השני הוא להציג את ספריית הפאג'ים להקרנה לפיתיון בתנאים המקדמים כריכה.

לאחר מכן, הפאג 'הלא קשור מוסר על ידי כביסה קפדנית. בעוד שפאג'ים קשורים משמשים להדביק את החיידקים לפני שהם מתאוששים. השלב האחרון הוא להגביר את הפאג' הקשור לאיטרציה הבאה של בחירת זיקה.

בסופו של דבר, כאשר טיטר הפאג'ים מתרומם, פלאקים בודדים נבחרים ומרוצפים כדי להראות לאילו חלבונים יש את הזיקה הגבוהה ביותר לפיגור המשותק בתנאי הקישור הניסיוניים. תהליך זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח באינטראקציות חלבון. הליך זה מתחיל בהנחת חלבון רקומביננטי מטוהר בתחתית לוחות המיקרוטיטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

השלב הבא הוא לחסן 50 מיליליטר של מדיום לוריא בוראני ב-100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין בבקבוק ארלנמאייר של 250 מיליליטר עם מושבה אחת שגדלה בעבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט לדגור ב-37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד בשייקר אופקי ולהשתמש בספקטרופוטומטר כדי לנטר את צפיפות התאים עד לקבלת צפיפות אופטית ב-600 ננומטר של 0.5 עד 0.6. לאחר מכן שפכו את התאים לתוך שפופרת פלקון של 50 מיליליטר או דומה ושמרו על ארבע מעלות צלזיוס עד שתאי השימוש יישארו בדרך כלל ברי קיימא במשך כשבוע ביום הראשון. התכוננו לבחירת זיקה כמתואר בפרוטוקול הטקסט בבוקר היום השני.

הניחו תשע צלוחיות חיטוי ריקות, 250 מיליליטר ארלנמאייר במלחציים של שייקר דגירה חסנו 500 מיליליטר של לאל בוראני עם 500 מיקרוליטר מאחת מתרביות הלילה של תאים נגועים בפאג'ים BLT 5 4 0 3 שהתחילו בלילה הקודם לאחר הנחת הבקבוק באינקובטור, הפעילו את הספקטרופוטומטר והגדירו אותו לקרוא ספיגה ב-600 ננומטר. בינתיים, הסר את צלחת המיקרוטיטר מארבע מעלות צלזיוס והסר את סרט הפלסטיק. הסר כל חלבון לא קשור מהצלחת על ידי שטיפה 10 פעמים עם 200 מיקרוליטר לבאר של תמיסת מלח אחת או TBS pH 7.5 והטיח את הצלחת הפוכה על מגבת הנייר בין השטיפות.

חסום עם 200 מיקרוליטר לבאר של 5% חסימת מגיב ב-TBS למשך שעה. כשהצלחת עטופה בניילון, שטפו את תמיסת החסימה 10 פעמים עם 200 מיקרוליטר של X-T-B-S-T אחד שמטיח את הצלחת הפוכה על ארבע שכבות נייר. מגבת בין כביסות.

מכאן, השתמש בטיפים למחסום מסנן כדי למנוע זיהום צולב של פאג'ים. פיפטה 100 מיקרוליטר מספריית הפאג'ים עם החלבונים. אוטמים מחדש את הצלחת בניילון נצמד ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה.

בתום שעה, הסר את הניילון מהצלחת ושטוף מיד על ידי ניעור הפאג' לתוך הפסולת הביולוגית המסוכנת. לאחר מכן השתמש במולטי-פיפטר כדי להוסיף במהירות 200 מיקרוליטר של X-T-B-S-T אחד לכל אחד. ובכן הגדר טיימר לדקה אחת.

לאחר דקה אחת, נערו את המאגר לתוך הפסולת המסוכנת ביולוגית, היכו את הצלחת הפוכה על מגבת נייר והניחו אותה בחזרה על הספסל. חזור על שלבי הכביסה 10 פעמים לאחר הכביסה העשירית. קח 200 מיקרוליטר של BLT 5 4 0 3 תאים מצינור הבז של 50 מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס והעביר לתחתית כל אחת מתשע הבארות שמהן הוסרה השטיפה האחרונה.

עטפו את הצלחות בניילון נצמד והניחו אותו 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי שכל פאג' שעדיין נדבק לפיתיון כדי להדביק את החיידקים בתום 20 דקות. פרקו את הצלחות. לאחר מכן, הסר 10 מיקרוליטר של חיידקים מה-BSA בשכפול של 25 מעלות צלזיוס באר אחת והעביר ל-990 מיקרוליטר של בינוני מסומן.

חזור על תהליך זה פעמיים נוספות עבור אותה באר וכתוצאה מכך שלושה משולשים של 1 עד 100 דילו של הפאג' מאותה באר זהו שכפול BSA אחד שנדגם שלוש פעמים. דילול זה ישמש להערכת הטיטר הממוצע, פלוס או מינוס שגיאת התקן של הממוצע, עבור שכפול זה של BSA, עשו את אותו הדבר עבור שכפול שתיים ושלוש של BSA, עבור שלוש הבארות המשוכפלות של חלבון הפיתיון המורעל, ועבור חלבון הפיתיון, הניחו את 27 צינורות ה-EOR הללו בצד. אם החיידקים בבקבוק נמצאים בצפיפות אופטית של 0.6 עד 1.0, שפכו 50 מיליליטר מהתאים מבקבוק השרך לכל אחת מ-9 צלוחיות ארלנמאייר בנפח 250 מיליליטר.

קח את 170 המיקרוליטרים הנותרים של חיידקי BLT 5 4 0 3 נגועים בפאג 'באר אחת בשכפול BSA והוסף אותם ל -50 מיליליטר התאים המסומנים בנציג BSA. אחד. עשו זאת עבור כל תשע הבארות לפני ניעור הצלוחיות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. בינתיים, בצע דילולים מ-27 הדילולים הראשוניים על ידי לקיחת 100 מיקרוליטר של ה-LB עם חיידקים מצינור איינור 1 והוספתו ל-900 מיקרוליטר של LB בצינור עינור.

ארבעה עבור 10 עד מינוס דילול שלישי, השליכו את קצה מחסום המסנן לאחד חדש לפני שתקבלו 100 מיקרוליטר של ה-LB עם חיידקים מצינור איינור ארבע והוסיפו אותו ל-900 מיקרוליטר של LB בצינור eph. שבע עבור הדילול של 10 עד מינוס 4, המשך את הדילול עבור כל המשולש של כל השכפולים של כל החלבונים והטיפולים. צריכים להיות 135 צינורות בסך הכל לאחר שהתאים שוכבים.

הביאו את התרבית ל-0.5 נתרן כלורי מולארי על ידי הוספת חמישה מיליליטר ממלאי נתרן כלורי מולארי והעברת הדגימה לצנטריפוגה של בקבוק צנטריפוגה מסומנת ב-8,000 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שפכו את הסופרנטנט המכיל את הנגיף לתוך שפופרת בז נקייה וסטרילית של 50 מיליליטר. הוסף כמה טיפות של כלורופורם לסופרנטנט המרוקן בצינור הבז.

ניתן לאחסן את הסופרנטנט בארבע מעלות צלזיוס לסבב הבא של בחירת הזיקה ביום השלישי, פיפטה 250 מיקרוליטר של VLT 5 4 0 3 תאים מארבע מעלות צלזיוס לכל אחת ממבחנות הסיליקט הממוספרות שהוכנו בעבר. לאחר מכן פיפטה 100 מיקרוליטר מהדילול בצינור איינור אחד לתוך 250 מיקרוליטר של תאים במבחנה בור סיליקט. אחד. מחממים לזמן קצר את חמשת הסנטימטרים הראשונים של הפיפטה מעל הלהבה וצוללים אותה לתוך החלק העליון המותך.

משוך שלושה מיליליטר והעביר במהירות למבחנה על גבי התאים והפאג'. מערבבים על ידי החלקה באצבע תוך כדי החזקת הצינור ביד השנייה, ואז יוצקים את התכולה על הצלחת. הטה את הצלחת והשתמש במבחנה כדי לרדוף אחר בועות וכתמים יבשים עד שכל הצלחת מכוסה על ידי האגרוס העליון.

הניחו אותו בצד זקוף על הספסל להתקררות. השלך את צינור הסיליקט של הבורוס. הוציאו את קצה מחסום המסנן וקבלו אחד טרי והמשיכו עד שכל הדילול מצופה.

הוציאו צלחות מוכנות מהחממה כשהן מתרוקנות, אך לא יותר משש בכל פעם או שהן מתקררות והאגרוס העליון מתמצק מהר מדי, בדוק את הפלאק שנוצר על הצלחות והשליך את אלה עם ליזה משולבת. קבע אילו מהדילולים הסדרתיים הנותרים הניבו מספיק לוחות כדי לאפשר קאלי מדויק רשום את מספר הפלאק מלוחות אלה והמשך לחישוב טיטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט בסוף בחירת הזיקה. בסיבוב הרביעי, בחר 18 מושבות פלאק בודדות מוגדרות היטב באמצעות קצה פיפטה צהוב סטרילי.

הרטיבו את החלק הפנימי של הקצה עם tris hydrochloride pH 8.5 בצינור einor. לאחר מכן גרעין את הפלאקים הללו מלוחות הטיטרינג על ידי דחיפת הקצה דרך רובד מבודד היטב ישירות לצלחת הפלסטיק פטרי שמתחתיו ושאיבת הליבה, הוצא את הליבה לתוך 100 מיקרוליטר של טריס הידרוכלוריד pH 8.5 בצינור המתאים לפני המערבולת. בקצרה, מחממים 20 מיקרוליטר מנפח זה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וממשיכים עם PCR וריצוף כמתואר בפרוטוקול הטקסט המוצג כאן הן תוצאות טיטר אופייניות על ידי דגימה מספר פעמים המספרים הסופיים המשוערים אינם רגישים כל כך לשגיאות פיפטינג והערכה מדויקת יותר של הטיטר בפועל והשונות סביב זה.

הערכה טובה לבאר מתקבלים הגדלת טיטר הפאג'ים בעדיפות עבור הפיתיון הלא מורעל ככל שמספר סבבי בחירת הזיקה גדל. מספק גם ביטחון שהטכניקה עובדת. השמירה על אחוז הולך וגדל של פאג'ים המכילים הכנסה בבארות פיתיון לא מורעלות ככל שמספר בחירות הזיקה גדל היא גם מבשרת טובות לאחר סבבים מתקדמים של בחירת זיקה.

עלייה במספר הפאג'ים ששוחזרו באופן עצמאי שיש להם הכנסה ביחס לסיבוב הראשון והתייצבות האמפליקונים הללו על כמה רצועות בגודל זהה היא אינדיקציה טובה לכך ששיבוטים מסוימים נבחרים בבחירת הזיקה בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קלות שתי היברידיות על מנת לאמת את האינטראקציות שהתגלו על ידי תצוגת פאג'ים.