Name: פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: למדו את פרוטוקול תצוגת הפאג לזיהוי אינטראקציות חלבון באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי קשורים. שיטה זו מאפשרת בחירת זיקה יעילה וזיהוי אינטראקטורים ספציפיים במחקר ביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

פרויקט זה מומן באופן חלקי על ידי IOS NSF (0849230); האץ&#39;, McIntire-סטניס (AD421 קריס), גרנט USDA זרע (2011-04,375), וסר פרדריק מקמאסטר מחקר מלגה לABD.

<ol><li>Georgieva, Y., Konthur, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+screening+of+M13+phage+display+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Design and screening of M13 phage display cDNA libraries.</a> Molecules. 16, 1667-1681 (2011).</li>
<li>Beghetto, E., Gargano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lambda-display%3A+a+powerful+tool+for+antigen+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery.</a> Molecules. 16, 3089-3105 (2011).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORF+phage+display+to+identify+cellular+proteins+with+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">ORF phage display to identify cellular proteins with different functions.</a> Methods. 58, 2-9 (2012).</li>
<li>Willats, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display%3A+practicalities+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phage display: practicalities and prospects.</a> Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).</li>
<li>Konthur, Z., Crameri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+applications+of+phage+display+in+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Targets%22%5BJournal%5D)">High-throughput applications of phage display in proteomic analyses.</a> Targets. 2, 261-270 (2003).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+of+the+Arabidopsis+thaliana+protein+isoaspartyl+methyltransferase+1+identified+using+phage+display+and+biopanning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning.</a> J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).</li>
<li>Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+for+improved+protein+stability+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selection for improved protein stability by phage display.</a> J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).</li>
<li>Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+LEA+proteins+and+other+hydrophilins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins.</a> Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).</li>
<li>Egli, D. B., Bruening, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source-sink+relationships%2C+seed+sucrose+levels+and+seed+growth+rates+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean.</a> Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).</li>
<li>Badotti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+the+mode+of+sucrose+utilization+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae.</a> Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).</li>
<li>Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Late+Embryogenesis+Abundant+%28LEA%29+Protein+Putative+Interactors+Using+Phage+Display%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display.</a> Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).</li>
<li>Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+expression+of+recombinant+proteins+in+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli.</a> Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).</li>
<li>Gasser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+conformational+stress+in+microbial+cells+producing+recombinant+proteins%3A+a+host+comparative+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview.</a> Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).</li>
<li>Daly, R., Hearn, M. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+heterologous+proteins+in+Pichia+pastoris%3A+a+useful+experimental+tool+in+protein+engineering+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.</a> J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).</li>
<li>Davis, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+recombinant+protein+production+of+eight+insect+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+protein+microarrays+for+the+high-throughput+identification+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Behav%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions.</a> Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).</li>
<li>Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cold-shock+response+in+cultured+mammalian+cells%3A+Harnessing+the+response+for+the+improvement+of+recombinant+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production.</a> Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

על ידי הפעלת הניסוי בשלוש בארות משוכפלים, ניתן להבחין הפאג שנרכש באופן עצמאי של אותו החלבון מחייב את הפיתיון גם אם הם זהה שיבוט (כלומר אין הבדל ברצף נוקליאוטידים של אזור CDS שכבר נרכש, אבל אלה היו נאסף מבארות עצמאיות). אחרת, הדרך היחידה להבחין בין הפאג קידוד אותו החלבון מחייב את הפיתיון היא אם הם באופן עצמאי להפוך אזורים עיבד שונים בחלק כלשהו של רצף נוקליאוטידים. השימוש באחד בקבוק Fernbach לגדול בה כל הח...

למה להשתמש בתצוגת הפאג ובחירת זיקה במקום טכניקות אחרות עצום זמינות לגילוי וחקירת אינטראקציות חלבון עם מולקולות אחרות? תצוגת הפאג יכולה לטעון כמה יתרונות ייחודיים על פני שיטות אחרות לזיהוי אינטראקציות חלבון ליגנד 1-3 כוללים את הפעולות הבאות: רפרטואר רחב מאוד של מולקולות פיתיון הסיבה החשובה ביותר היא בגיוון של מולקולות מסוגלות לפעול כפיתיון בבחירת זיקת 4. תצוגת הפאג היא אמצעי חזק מאוד של בידוד שברי חלבון הפועלים באינטראקציה עם חלבונים אחרים, נוקלאוטידים, פחמימות, וכו &#39;5 בעיקרו של דבר, אם פולימר / מולקולה יכולה להיות מחוברת לתמיכת ההשבה, זה יכול להיות מוקרן לזיקה עם חלבונים המוצגים הפאג. בנוסף, מולקולת הפיתיון ניתן לגשת כדי לקבוע אם הוא שומר על פעילות ביולוגית כאשר משותק 6, אם תנאים המשמשים לrלהסיק / לחסל את פעילותו יעיל 6 או, להציג את השינויים שלאחר translational לפיתיון לפני בחירת זיקה. התנגדות הפאג לגורמים חיצוניים סיבה שנייה לשימוש בתצוגת הפאג, היא שזה אפשרי כי כמה פיתיונות עשויים לדרוש לחץ סביבתי (חום, ריכוזי osmolyte גבוהים, cofactors הספציפי, וכו &#39;.) כדי ללכוד חלבוני האינטראקציה שלהם, או החלבונים המוצגים הפאג ייתכן שיהיו הצורך לשנות איכשהו לפני בחירת זיקה. הגורם העיקרי שלמד הוא האינטראקציה בין הפיתיון וחלבון, לא המצב שמאפשר האינטראקציה להתרחש או אם הוא קטלני לאורגניזם המבחן. הפאג T7 הוא גם מתאים במיוחד למחקרים כאלה, כי זה יכול לעמוד בתנאי ניסוי קשים שניהם שלמים ובת קיימא (למשל מרבי התרמית פורסם לכדאיות T7 הוא ~ 60 ° C 7). כדוגמא לשינוי הפאג מוצג פרוteins, כאשר בוחן את proteome זרע thaliana ארבידופסיס למצעי חלבון של אנזים התיקון, חלבון Isoaspartyl תיל Transferease (PIMT), הווירוס המשמש במחקרים אלה היה &quot;בני&quot; במשך שבוע אחד, לפני כל בחירת זיקה עגולה, כדי לעודד הקדמה של isoaspartate (isoAsp) שאריות צמחים בחלבונים רגישים 6 דבר שאינו אפשרי באורגניזמים שיכולים לזהות ולתקן / לעכל מומים כאלה. מטבולית אינרטי יתר על כן, הפאג הם בדרך כלל עמיד בפני רעלים מטבוליים ומפריע מולקולות קטנות שהייתי, לכל הפחות, לגרום לתופעות pleiotropic על אורגניזמים בדיקה פעילים מטבולית. בעקבות שטיפות חומרא, הרעל מוסר לפני נפח גדול של חיידקים הם הציגו לזיהום כל כך הרעל מדולל למגוון בלתי מזיק לחיידקים או שכפול הפאג שלאחר מכן. בעוד חקירת מטרות חלבון של תיקון PIMTאנזים, S-Adenosyl מתיונין (AdoMet) שימש כדי להפעיל את האנזים משותק מייקר כייל צלחת היטב כדי לאפשר לכידת חלבון מטרה תוך הסתמכות על S-Adenosyl הומוציסטאין (AdoHcy) כדי להשבית את האנזים ולספק שליטה שלילית שימושית לאבטח ב הידיעה שהווירוס לא להיות מושפע לרעה על ידי אחד AdoMet או AdoHcy 6. בנוסף, בני משפחות מסוימות המאוחר עובר חלבון נפוץ (LEA), נחקרו במעבדה זו, ידועים לשנות את צורתם בנוכחות תוספים כגון סוכרוז 8, שיכול להשיג ריכוזים גבוהים ככל 200 מ&quot;מ בזרעי סויה בנקודה בשלות פיזיולוגית 9. הווירוס לא צפוי להיות מושפע על ידי תוספת של 200 סוכרוז מ&quot;מ בכל סיבוב זיקת בחירה, אולי הכרחי לאינטראקציות חלבון LEA לקוח מסוימות, וזה לא במקרה של אורגניזמים מבחן מעשי באופן אוטונומי 10. מעבדה זו מתמקדת בdiscoverinאינטראקציות בין חלבונים G בזרעים בוגרים, מיובשים או נובטים העומדים בבסיס המנגנון של הגנת proteome המאוחסנת במהלך התייבשות 11 או תיקון של רכיבים של proteome המאוחסנת, כי הם רגישים להיווצרות isoAsp פעם הזרע ספג 6. לפיכך, הייצור והטיהור של החלבונים רקומביננטי הנדרשים כפיתיון במצב פעיל, ולהבטיח שהם יישארו כך, לפני ואחרי שהם משותקים, אם כי קשים לעתים קרובות, הוא אבן יסוד לעבודה שלנו. עם זאת, כמו כל תרחיש ייצור חלבון רקומביננטי הוא שונה, תנאי אופטימיזציה לייצור חלבון רקומביננטי לא התייחסו כאן. משתמשים מתבקשים לנסות, בכל מקום אפשרי, כדי לקבוע אם החלבון המשותק הוא עדיין פונקציונלי (למשל, אם זה הוא אנזים, לעשות assay אנזים בבארות צלחת microtiter). זה יספק קצת ביטחון שהפיתיון הוא פעיל מבחינה ביולוגית ואם כן, כי כל אינטראקציות שהתגלו הןקצת יותר סיכוי יש להם שייכות ביולוגית.

<table><tbody><tr><td>טריפטון</td><td>בקטון דיקינסון ושות'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>211705 תמצית שמרים</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר מדעי</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>מגיב</td><td>חוסם EMD כימיקלים בע"מ</td><td>69064</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BLT5403</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>BLT5403</td><td>גנוטיפ: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)</td></tr><tr><td>Ampicillin, מוצרי מחקר מלח</td><td>נתרן בינלאומי</td><td>A40040</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP102-1</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-9647</td><td></td></tr><tr><td>הנוגדן העיקרי Penta-HIS</td><td>Qiagen Inc.</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכברים אלקליין פוספטיז מצומד</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>A-5153</td><td></td></tr><tr><td>para-Nitrophenylphosphate</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td>N-7653</td><td></td></tr><tr><td>T7-UP פריימר</td><td>EMD כימיקלים בע"מ</td><td></td><td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN</td></tr> <tr><td>פריימר</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td></td><td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick</td></tr> <tr><td>PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen Inc.</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל Qiaquick </td><td>Qiagen Inc.</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>4336917</td><td></td></tr><tr><td>חימום בלוק</td><td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td><td>18780</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחות תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>קוסטאר 3590</td><td></td></tr><tr><td>תנור חממה איזוטמפ</td><td>פישר מדעי</td><td>516D</td><td></td></tr><tr><td>פסטר פיפטות, 5 & # 190; בפישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>ChromaView Transilluminator</td><td>UVP Inc.</td><td>TS-15</td><td></td></tr><tr><td>UV Shield</td><td>Oberon</td><td>071AF</td><td></td></tr><tr><td>כפפות, ניטריל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-170-010C</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סטריליים 1.5 מ"ל</td><td>ארה"ב סיינטיפיק בע"</td>מ <td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל בורוסיליקט פיפטס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-25E</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית בורוסיליקט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-961-27</td><td></td></tr><tr><td>Uniskan I, קורא לוחות ELISA</td><td>מעבדות Labsystem ו-Flow, הלסינקי, פינלנד</td><td>Type 362</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

שימוש הפאג רקומביננטי כפיגום להציג מנות חלבון שונות המקודדים על ידי ספריית cDNA המשובטת directionally למולקולות פיתיון משותקים הוא אמצעי יעיל כדי לגלות אינטראקציות. הטכניקה במידה רבה נעשתה שימוש כדי לגלות אינטראקציות בין חלבונים אבל מולקולת הפיתיון להיות אתגר לא צריכה להיות מוגבלת לחלבונים. הפרוטוקול המובא כאן בצורה מיטבית כדי לאפשר למספר צנוע של פיתיונות שיוקרנו בחזרות על מנת למקסם את זיהוי של שיבוטים עצמאיים המציגים אותו החלבון. זה מאפשר ביטחון רב יותר שחלבוני אינטראקציה שזוהו הם interactors הלגיטימי של מולקולת הפיתיון. ניטור כייל הפאג לאחר כל בחירת זיקה עגולה מספק מידע על אופן בחירת הזיקה מתקדמת, כמו גם על יעילותן של בקרות שליליות. אמצעי אחד titering הפאג, ואיך ומה להכין מראש כדי לאפשר את התהליך הזה כדי להתקדם בצורה יעילה ככלאפשרי, מוצג. תכונות של amplicons לאחזר הבאים בידוד של פלאק העצמאי מודגשות כי ניתן להשתמש כדי לברר כיצד גם מבחר הזיקה התקדם. פתרון בעיות טכניקות כדי למזער את התוצאות החיוביות שגויות או לעקוף בהתמדה התאושש הפאג מוסברים. אמצעי להפחתת זיהום נגיפית התלקחות הם דנו.

היכולת לפגוע ביכולתו של הפיתיון כדי לקיים אינטראקציה עם חלבונים המוצג הפאג (מטבולית מרעיל את הפיתיון) מספקת שליטה שלילית חזקה לטכניקה זו. כמו כן, מומלץ לקבוע אם הפיתיון, כאשר חייב צלחת microtiter היטב, שומר על תפקודו. שתי בדיקות אלה יגבירו את הביטחון כי חלבונים התאוששו על ידי פיתיון nonpoisoned אינטראקציה, המוצג הפאג הם לגיטימיים. דגימת שלושה triplicates מכל טוב, מוסיפה במידה ניכרת לזמן והעבודה הכרוך בבחירת הזיקה...

תצוגת הפאג היא טכניקה רבת עוצמה כדי ללכוד חלבונים או moieties חלבון הפועלים באינטראקציה עם מולקולה משותקת של עניין. ברגע שהחלטה מהסוג של ספריית cDNA הפאג ליצור והמסך נעשתה, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בחירת זיקה יעילה שמוביל לזיהוי של interactors.

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגלות אינטראקציות של חלבונים עם מולקולות פיתיון (bait) מקובעות. זאת מושג תחילה על ידי השגה וקיבוע של הפיתיון. השלב השני הוא הכנסת ספריית הפאג'ים המיועדת לסריקה אל הפיתיון, תחת תנאים המעודדים קישור.בשלב הבא, הפאגים שאינם קשורים מוסרים באמצעות שטיפה מחמירה. בעוד שהפאגים הקשורים משמשים להדבקת החיידקים לפני שהם מופקים מחדש. השלב הסופי הוא הגברת הפאגים הקשורים לקראת האיטרציה הבאה של סלקציית זיקה.בסופו של דבר, כאשר תיתור הפאגים מגיע למישור, נבחרים פלאקים בודדים ומסננתרים כדי להראות לאילו חלבונים יש את זיקת הגבוהה ביותר לליגנד המקובע תחת תנאי הקשירה הניסיוניים. תהליך זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנושא אינטראקציות בין חלבונים. הליך זה מתחיל בהנחת חלבון רקומביננטי מטוהר בתחתית של פלטות מיקרוטיטר, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.השלב הבא הוא להנחית מושבה בודדת, שגודלה קודם לכן כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, לתוך מבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 מיליליטר המכיל 50 מיליליטר של מצע Luria burani עם 100 מיקרוגרם למיליליטר של ampicillin. יש לדגרה בטמפרטורה של 37 °C, במהירות של 200 RPM במנער אופקי, ולהשתמש בספקטרופוטומטר למעקב אחר צפיפות התאים עד לקבלת צפיפות אופטית (OD) של 0.5 עד 0.6 באורך גל של 600 ננומטר. לאחר מכן, יש להעביר את התאים לשפופרת Falcon בנפח 50 מיליליטר או לשפופר

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

AVEXIS הוא קצב העברת נתונים גבוה חלבון אינטראקציה assay פותח מסך באופן שיטתי על הרומן רצפטור ליגנד בזוגות המעורבים בתהליכים תאיים זיהוי סלולריים. היא תוכננה במיוחד כדי לזהות אינטראקציות חלבון חולפות שקשה לזהות באמצעות גישות אחרות קצב העברת נתונים גבוה.

הלהיטות מבוסס אינטראקציה הקרנת תאיים (AVEXIS) לאיתור Scalable זיקה נמוכה קולטן ליגנד אינטראקציות תאיים

בסרטון זה אנו מדגימים את טכניקת תצוגת הפאגים לבידוד פאגים מהונדסים מראש המבטאים חלבונים בעלי זיקה גבוהה לחלבון המטרה.

שימוש בתצוגת פאגים לבחירת חלבונים בעלי זיקה גבוהה לחלבון מטרה

שיטה מתוארת בליווי חזותי לניהול בחירות להרחבה, תפוקה גבוהות מספריות נוגדן סינתטיות קומבינטורית-מוצג הפאג נגד מאות אנטיגנים בו-זמנית. שימוש בגישה זו במקביל, יש לנו מבודד שברי נוגדן שמפגינים זיקה גבוהה וספציפיות לאנטיגנים שונים כי הם פונקציונליים בimmunoassays הסטנדרטי.

גבוהה Scalable תפוקה בחירה מספריות נוגדן סינטטיים-מוצג הפאג

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת על גילוי של פפטיד זיקה ריאגנטים, אלטרנטיבה איתנה נוגדנים. בשיטת המיון האוטומטי למחצה בזאת יש יעיל biopanning כדי להקטין את המופע של תוצאות חיוביות שגויות. כאן אנו ממחישים את התהליך המחשבתי וטכניקות מתבצעת הערכת המועמדים וצמצום ניתוח במורד הזרם.

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

הפרוטוקולים תיאר מאפשרים אפיון ובניה, מבחר (נגד המטרה של הבחירה) ספרייה "domainome" גרם מכל מקור ה-DNA. זו מושגת על ידי צינור מחקר המשלב טכנולוגיות שונות: phage התצוגה, כתב מתקפלים, רצף הדור הבא עם כלי אינטרנט לניתוח נתונים.

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט להקמת ספרייה המוצג phage נוגדן סינתטי עם גיוון מחויטת. נוגדנים סינתטי יש יישומים רבים של מחקר בסיסי אבחון המחלה, הרפוי.

בניית Phage סינתטי מוצגת ספריית Fab עם גיוון המותאמים

כאן אנו מציגים שיטה לבחור עבור גרסאות הרומן של E. coli biotin-חלבון ליגאז בירה כי הביוטיטים מטרה מסוימת פפטיד. הפרוטוקול מתאר את בניית הפלסמיד לתצוגה החיידקית של פפטיד היעד, הדור של ספריית בירה, בחירה ואפיון של משתני בירה.

התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים

יצירת מערכות דימרזציה בתחום החלבונים עם הזיקה הרצויה וספציפיות לכל מולקולה קטנה שניתנה לפני הרבה מולקולות ובקשות חישה והגשמה. כאן, אנו מתארים שיטה יעילה, הניתן להכליל עבור דה נובו הנדסה של מערכות דימריזציה הנגרמת כימית דרך הבחירה החורגת של קומבינטורית הציג phage בספרייה נוגדן יחיד בתחום.

יצירת חלבון מאוד ספציפי הנגרמת כימית מערכות דימריזציה על ידי בחירת בחירה באמצעות מבחר של קומבינטורית מתחם יחיד בספריית הנוגדן

מחקר זה נועד להציג אסטרטגיה לזיהוי אינטראקציות תרופתיות פפטיד. האסטרטגיה כוללת ביופאנינג של פפטידים קצרים לזיהוי תרופות המבוססים על מיקרו-איזון של גביש קוורץ (QCM), ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה להערכת כמותיות של המידע המתקבל להכרה בסמים וביאור של אתרי איגוד התרופות בחלבונים.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת למדידת איזולבוגלנדינים ברקמות על ידי אימונופלואורסנציה באמצעות נוגדן ScFv D11 מצומד אלקליין פוספטאז. מודלים של יתר לחץ דם הן בעכברים והן בבני אדם משמשים כדי להסביר את ההליכים שלב אחר שלב ואת עקרונות היסוד הקשורים למדידת איזולבוגלנדין בדגימות רקמות.

זיהוי ישיר של איזולבוגלנדינים ברקמות באמצעות חלבון היתוך D11 scFv-אלקליין פוספטאז ואימונופלואורסנציה

בכל מקום הוא שינוי חלבון קריטי לאחר התרגום, dysregulation אשר היה מעורב במחלות אנושיות רבות. פרוטוקול זה מפרט כיצד ניתן להשתמש בתצוגת פאג ' כדי לבודד וריאנטים חדשניים בכל מקום שיכולים לאגד ולווסת את הפעילות של רצועות E3 השולטות על הספציפיות, היעילות והדפוסים של כל מקום.

שימוש בתצוגת Phage לפיתוח אפננים משתנים של אוביקוויטין עבור ליגות E3

למדו את פרוטוקול תצוגת הפאג לזיהוי אינטראקציות חלבון באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי קשורים. שיטה זו מאפשרת בחירת זיקה יעילה וזיהוי אינטראקטורים ספציפיים במחקר ביולוגי.

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

גלה סרטונים נוספים