ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא להראות כיצד נורמליזציה של ארכיטקטורת התא והמיקום המושגת על דפוסי מיקרו דבק ספציפיים מאפשרת אוטומציה קלה של רכישת תמונה ועיבוד תמונה פשוט עם כימות רגיש וחזק של השפעות התרופות, דבר שאינו ניתן להשגה על תומכי החלקה של כיסוי זכוכית קונבנציונליים. זה מושג על ידי זריעת תאי הלי על SI שני שבבים הנושאים תבניות מיקרו SI בצורת L. התאים מאמצים את הצורה המשולשת ובונים סיב מתח עיקרי המשתרע על פני שני קצוות ה-L.תאי התבנית מודגרים לאחר מכן עם סטטין לבוס או נותרים ללא טיפול, ואז מקובעים וצבועים כדי לדמיין את השלד הציטולוגי והגרעינים.

לאחר מכן נרכשות ומעובדות תמונות של תאי המיקרו-דפוס באמצעות מאקרו ref התא כדי ליצור ערימת תמונות לניתוח ומקרו ההיפוטנוזה לכימות פנוטיפים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות השפעה משמעותית של מינונים נמוכים של סטטין BLEs על תאי HELOC מיקרו-דפוסיים, דבר שאינו ניתן לגילוי בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. היי, ברוכים הבאים.

אנו כאן היום כדי להדריך אתכם בפרוטוקול הניסוי שלנו המסביר כיצד להשתמש בתבניות מיקרו דביקות לניתוח תאים, כמו גם להראות לכם נתונים ניסיוניים הממחישים את הכימות הקל של מינונים נמוכים מאוד של תרופות על דפוסי מיקרו דביקים אלה. אז כשאתה רואה לראשונה את דפוסי המיקרו הללו, תבין מיד כיצד זה יכול לפתור בעיות שונות בלכידת תמונה במהלך ניתוח תאים. מכיוון שעל ידי מערך אמיתי של תאים, בדומה למערך מיקרו, אתה יכול בקלות להעביר את שלב המיקרוסקופ מתא לתא כדי להיות מסוגל לצלם תמונות בצורה מדורגת.

אבל זה כמובן לא היתרון היחיד של דפוסי מיקרו שהוא מציע. זה מציע הרבה יותר שיפורים מכיוון שלמעשה, בדפוסי מיקרו טיפוסיים מסוימים כמו הקרוסבו או ה-Y, אנו למעשה מנרמלים את ארכיטקטורת התאים הפנימית, כלומר אברונים, הציר המיטוטי, השלד הציטוטי ורשתות חלבונים שונות נמצאים כולם באותם מיקומים מתא לתא או באותו כיוון מתא לתא, מה שמקל בהרבה על חיזוי וכימות ההשפעות של תרופות על דפוסים מסוימים אלה. עכשיו זה עשוי להיראות די מנוגד לאינטואיציה ממה שנעשה בדרך כלל בצלחת פטרי קלאסית או במיקרופלייט.

ובכן, מכיוון שלעתים קרובות אתם רואים כמובן תאים נעים ומאמצים מורפולוגיות שונות. ואילו בתבניות המיקרו הדביקות, כל התאים יתחילו להיראות דומים מכיוון שהם מגיבים לדפוס המיקרו הדביק הזה ומארגנים את הארכיטקטורה שלהם באותו אופן. זה אולי נראה למעשה קצת מלאכותי, אבל כשבאים להסתכל על זה מקרוב, האם צלחת הפטרי לא מלאכותית עוד יותר?

מכיוון שברקמות, התאים מוגבלים על ידי התאים השכנים כמו גם על ידי המטריצה החוץ-תאית. אז הם מקבלים הרבה מידע מרחבי, שמכוון את ארכיטקטורת התא. וזה באתר למודעה של דפוסי מיקרו זה מה שאנחנו עושים.

אנו משחזרים את המידע המרחבי הזה לתאים וכל התאים מגיבים לכך ומתארגנים באותו אופן. ועכשיו מכיוון שכל התאים דומים, אנו יכולים להציג את המושג של תא הייחוס, כלומר אנו יכולים לממוצע את כל התמונות ולקבל תמונה אחת, שבאמת מייצגת את איך התא נראה במצב נתון. לאחר מכן אתם יכולים להוסיף תרופה ולהסתכל שוב על תא הייחוס הזה ולראות כיצד הוא שינה את המורפולוגיה או את הארגון של התא בתגובה לתרופה הזו.

הנח שני שבבים באתרם בנפרד לתוך שתי בארות עצמאיות של צלחת שש בארות, וודא שהלוגו של שני האתרים קריא. לשני השבבים באתרם המשמשים לניסוי זה יש דפוסי מיקרו מוכתמים ב-FibroGen SI 3 ויש לשמור אותם בחושך לפני השימוש. אספו תאי הלה שהם בערך 80% מתכנסים על ידי טריפסין ובדקו שהם מותאמים כראוי תחת צנטריפוגה מיקרוסקופית ב-300 גרם למשך ארבע דקות והחזירו את התאים לספור בעדינות ולדלל את התאים לריכוז של 15,000 תאים למיליליטר.

במדיית תרבית D-M-E-M-F 12 לא שלמה מחלקים 60,000 תאים לבאר. יש להזיז את הצלחת כמה שפחות כדי להימנע מהכנסת תנועות סיבוביות במדיום, אשר נוטות לרכז את התאים במרכז. אפשרו לתאים לשקוע במשך 10 דקות מתחת למכסה המנוע, ואז העבירו אותם לחממת התאים.

תוך 10 עד 20 דקות בחממת התאים, התאים יתחילו להיצמד לאחר 10 דקות, בדקו באופן קבוע במיקרוסקופ מתי התאים התחברו. שנה את מדיום התא והסר עודף תאים על-ידי חזרה על ההליך הבא ארבע פעמים. שמירה על הצלחת שטוחה, שאפו בעדינות את המדיום מצד הבאר.

הקפד לשמור מספיק מדיה כדי למנוע מהשבב להתייבש. הוסף ארבעה מיליליטר PBS ושאף החל ממרכז השבב. לאחר מכן עוברים לצד הבאר כדי לשאוב את רוב ה-PBS כמו קודם, בדקו במיקרוסקופ אם יש תאים צפים.

אם נותרה כמות גדולה של תאים צפים, חזור על הליך הכביסה. אם קיימים מעט מאוד תאים, שאפו חלק מה-PBS והחליפו אותו בשני מיליליטר של שאיבה בינונית טרייה והוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום טרי פעמיים. דגרו על התאים במשך שלוש שעות בחממת תאים כדי לאפשר לתאים להתפשט במלואם.

בשיטה זו, בין 10 ל-30% מתבניות המיקרו יהיו תפוסות על ידי תא בודד, בעוד שתבניות אחרות יהיו ריקות או תפוסות על ידי תאים מרובים. כדי לטפל בתאים עם סטטינים של BLEs, יש לדלל את תמיסת מלאי התרופה של 17 מילי-מולרית לריכוז סופי של חמישה מיקרו-מולרים עם 0.1% DMSO בארבעה מיליליטר של מדיום. לבקרה הכינו מדיום עם 0.1% DMSO שאבו רק את מדיום התא והחליפו אותו במהירות בסטטין BLEs או בתמיסות הבקרה כדי למנוע מהשבב להתייבש.

דגרו על התאים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה הזו, הכינו את מאגר השלד הציטוטי. הוסף גרם אחד של סוכרוז לשני מיליליטר cb.

זה עוזר לשמר את מבני התאים הפנימיים. מערבבים מיליליטר אחד של סוכרוז CB עם ארבעה מיליליטר של 5% PFA. הוסף שני מיליליטר PFA בתמיסת סוכרוז CB.

בשתי בארות של צלחת שש בארות טרייה. כדי לתקן את התאים השתמש במלקחיים כדי להרים את שבב CY שני ולהניח אותו בצלחת שש הבארות המכילה שני מיליליטר PFA בתמיסת סוכרוז CB. דגרו את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הסירו את ה-PFA ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS ואז שטפו את התאים בשני מיליליטר של אמוניום כלוריד 100 מילי-מולרי למשך 10 דקות.

כדי להרוות את פעילות הקישור הצולב של PFA שנותרה, חדיר את התאים על ידי הוספת שני מיליליטר PBS המכילים 0.1% טריטון X 100 למשך שלוש דקות, נשטף פעמיים עם חוטי אקטין כתמים PBS עם שני מיליליטר של ZI מצומד באחד עד 2000 ב-PBS עם דגירה של 1.5% BSA למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם שני מיליליטר PBS. לאחר מכן, שמור על הגרעינים.

הוסף שני מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר שנמכר ב-PBS ודגירה במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים פעמיים עם שני מיליליטר PBS. הרכיבו את שני השבבים הצדדיים על שקופית סטנדרטית באמצעות 25 עד 30 מיקרוליטר של פתרונות הרכבה כגון al.

כדי לרכוש תמונות בשלושה אורכי גל, אנו משתמשים בתוכנת הדמיה Metamorph ובמיקרוסקופ T של ליקוי אייקון NIK. מצויד במצלמת CCD Hema Matsu ותאורת סיבי כספית לייט אינטנסיבית. תחילה בחר הגדלה של פי 20.

הבא בשורת התפריטים, פתח רכישה רב-ממדית. להגדיר את הפרמטרים השונים של הניסוי. ראשית ציין היכן לשמור את הנתונים שלך.

הגדר את מספר אורכי הגל לשלושה, בחר את אורך הגל SI שלוש ומקם את שקופית החלקת הכיסוי כך ש-12 דפוסי מיקרו מרוכזים בשדה המצלמה. מספר דפוסי המיקרו המוצגים בכל שדה ישתנה בהתאם להגדרות המצלמה והמטרה. הגדר את זמן החשיפה עבור כל אורך גל ומיקוד אוטומטי.

עבור PS 3, צור יומן המריץ רכישה רב-ממדית ושמור אותו כ-MDA jnl. פתח את פונקציית שלב הסריקה כדי לקבל 24 תמונות שכל אחת מהן מכילה 12 תבניות מיקרו. הזן שש עמודות וארבע שורות עם גודל צעד של מינוס 400 מיקרון x וגודל צעד של 300 מיקרון y ביומן מוגדר לביצוע, העלה את סריקת העיתונות של היומן MDA jnl כדי להתחיל ברכישה האוטומטית של 24 התמונות בשלושת אורכי הגל.

בסרטון זה, תבניות מיקרו L משמשות כדי לעורר היווצרות של סיב מתח אקטין עיקרי יחיד המקיים את החלק הלא מחובר של התא ומפשט את ההדמיה והמדידה של השפעת סטטין BLEs על תאים בהשוואה לתאים היושבים על פיברונקטין רגיל. לעיבוד וניתוח תמונה אוטומטיים, אנו מתארים שתי פקודות מאקרו בהתאמה אישית שנכתבו עבור תוכנית הקוד הפתוח תמונה J מערימה של תמונות גולמיות, המאקרו הראשון מחלץ תאים בודדים ויוצר תא התייחסות. המאקרו השני מודד קריסה של קרום התא.

השלב הראשון הוא פילוח של תאים בודדים מתמונות גולמיות. תמונות דפוס המיקרו המסומנות פלואורסצנטיות משמשות למחיקה של אזורים שבמרכזם דפוסי המיקרו שנחתכים בתמונות עבור כל אורך גל ומורכבים מחדש לערימות עבור כל אורך גל. כדי לבחור תבניות מיקרו עם תאים בודדים, המאקרו מזהה את מספר הגרעינים בכל תמונה ומבטל בכל הערימות את אלה המכילים יותר מגרעין אחד או ללא גרעינים.

לבסוף, התוסף image J multi-stack reg משמש ליישור מחדש של כל התמונות שנאספו וכל הערוצים על סמך מיקום המיקרו-תבנית. שלב זה יוצר ערימות שורות של תמונות בודדות שניתן להשתמש בהן כעת לניתוח תא בודד או ליצירת תא ייחוס. בתמונה J, תא הייחוס נבנה על ידי ביצוע הקרנה של התמונות המסוננות והמיושרות מערימה.

ניתן ליישם מספר שיטות הקרנה, אך בדרך כלל נבחרת הטלה חציונית כדי לבטל חריגים של ערימת התמונות. תא הייחוס הוא כלי ייחודי ושימושי לייצוג וניתוח תמונה המתקבל רק עם תאי מיקרו-תבנית. כדי להקל על בדיקתו, מוחלת טבלת חיפוש או LUT כדי להמיר את תמונת הצבע המונו למפת תדרים מקודדת.

כדי לאפיין את אפקט הסטטינים של BLEs, נותחו הקשיחות והקריסה של התא באמצעות מאקרו J תמונה שנייה. בקצרה, תמונות סף של דפוס המיקרו L משמשות להגדרת היפוטנוזה תיאורטית של צורת משולש התא. הסף הבא של תמונות כתם האקטון מבוצע כדי להגדיר את צורת התא.

ההבדל בשטח בין ההיפוטנוזה התיאורטית לקרום התא הקעור בפועל נמדד לאחר מכן תאים המציגים אזור מתחת להיפוטנוזה התיאורטית נחשבים לקריסה. ההשפעה של חמישה סטטינים מיקרו-מולאריים של BLEs התאפיינה בהשוואת מספר התאים שקרסו בתנאים מטופלים ובמצבי ביקורת. תמונות אופייניות של תאי מיקרו-דפוס L שטופלו בסטטין BLEs או שנותרו ללא טיפול מוצגות תאים קבועים ומוכתמים.

אקטין וגרעינים מוצגים באדום, ירוק וכחול בהתאמה. שימו לב להשפעה של סטטיני BLEs על צורת התא בהשוואה לתנאי הבקרה. תאים מייצגים לאחר דגירה עם סטטין BLEs או בקרות על פיברונקטין רגיל מוצגים כאן.

התאים היו קבועים ומוכתמים אקטין וגרעינים הם בירוק וכחול בהתאמה. שימו לב לדמיון בין מצבים מטופלים ומבוקרים. מוצגות תמונות אופייניות של תאי ייחוס המתקבלים מתאים שטופלו בסטטינים של BLEs או שלא טופלו.

שימו לב לפוטנציאל של גישה זו להתבוננות קלה בפנוטיפ הנחקר. להלן דוגמה לניתוח ההשפעות של סטטינים BLEs על תאים באמצעות היפוטנוזה מאקרו. בעוד ש-25% מתאי הביקורת קרסו, זה גדל פי שלושה ב-75% בחמשת התאים שטופלו בסטטינים מיקרו-מולאריים המשקפים את רשת התכווצות האקטינין המוחלשת.

לאחר צפייה בזה, כעת אתה אמור להבין היטב כיצד דפוסי מיקרו דביקים פותרים מספר צווארי בקבוק בניתוח תוכן גבוה. ראשית, השימוש בתבניות מיקרו דביקות הפך את ניתוח עיבוד לכידת התמונה להרבה יותר פשוט. שנית, דפוסי מיקרו מאפשרים לזהות השפעות עדינות מאוד של תרופות במינונים נמוכים מאוד מכיוון שאתה מפחית את השונות בין תא לתא על ידי נורמליזציה של המורפולוגיה וההתנהגות שלהם.

ולבסוף, בהשוואה לאלפי התאים הנחוצים בדרך כלל כדי לקבל תוצאה טובה בניתוח תאים, אתה צריך רק כמה עשרות תאים כדי לקבל תוצאה חזקה ומשמעותית באמצעות תא הייחוס שלנו.