Name: ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למדו לנתח נפח טריטוריה וחפיפת טריטוריות של אסטרוציטים ברקמת מוח עבה של עכברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וקוד מותאם אישית. שיטה זו מאפשרת חקירת תפקידי חלבונים בפיתוח אסטרוציטים ובאינטראקציות ביניהם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מיקרוסקופיה בוצעה בליבת המיקרוסקופיה של UNC Neuroscience (RRID:SCR_019060), הנתמכת בחלקה על ידי מימון ממענק התמיכה של מרכז מדעי המוח NIH-NINDS P30 NS045892 ומענק התמיכה של מרכז המחקר למוגבלויות שכליות והתפתחותיות של NIH-NIH-NICHD U54 HD079124. איור 1 נוצר עם BioRender.com. התמונות והנתונים באיור 4 מודפסים מחדש מפרסום קודם9 באישור המו"ל.

<ol><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytogenesis%3A+where%2C+when%2C+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Astrocytogenesis: where, when, and how.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+individual+astrocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy.</a> Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92(2020).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemico-genetic+discovery+of+astrocytic+control+of+inhibition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo.</a> Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).</li>
<li>Baldwin, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepaCAM+controls+astrocyte+self-organization+and+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling.</a> Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).</li>
<li>Amberg, N., Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+candidate+genes+in+mice+using+mosaic+analysis+with+double+markers%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100939(2021).</li>
<li>Dumas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+of+multiaddressable+genome-integrating+color+%28MAGIC%29+markers+to+individualize+cortical+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110(2020).</li>
<li>Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-glia+from+pallial+progenitors+produce+the+largest+clonal+clusters+of+the+brain%3A+time+frame+of+clonal+generation+in+cortex+and+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communication. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+states+of+astrocytes+during+sleep+and+wakefulness%3A+Is+norepinephrine+the+master+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Sleep+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator.</a> Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת לניתוח נפח שטח אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים בקליפת המוח של העכבר, המפרט את כל השלבים העיקריים המתחילים בזלוף ומסתיימים בניתוח תמונה. פרוטוקול זה דורש מוחות מעכברים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים באוכלוסייה דלילה או פסיפס של אסטרוציטים. מחוץ לדרישה זו, ניתן להשתמש בעכברים בכל גיל עבור פרוטוקול זה, עם התאמות קלות בלבד להגדרות הזלוף ונפח המדיה המקפיאה שנוספו לתבנית ההטבעה. בעוד ששיטות אחרות פורסמו לניתוח המורכבות והנפח של הסתעפות אסטרוציטים בקטעי רקמת המוח 7,11<...

אסטרוציטים הם תאים מסועפים בצורה משוכללת המבצעים תפקודים חשובים רבים במוח1. בקליפת המוח של העכבר, תאי גזע גליאליים רדיאליים מעוררים אסטרוציטים בשלב העוברי המאוחר ובשלבים המוקדמים שלאחר הלידה2. במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה, האסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם, ומפתחים אלפי ענפים עדינים המתקשרים ישירות עם סינפסות1. במקביל, אסטרוציטים מקיימים אינטראקציה עם אסטרוציטים שכנים כדי ליצור טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחוץ את המוח3, תוך שמירה על תקשורת באמצעות ערוצי צומת פער4. המורפולוגיה והארגון של אסטרוציטים משתבשים במצבי מחלה רבים בעקבות עלבון או פציעה5, מה שמעיד על חשיבותם של תהליכים אלה לתפקוד תקין של המוח. ניתוח תכונות מורפולוגיות של אסטרוציטים במהלך התפתחות תקינה, הזדקנות ומחלות יכול לספק תובנות חשובות על ביולוגיה ופיזיולוגיה של אסטרוציטים. יתר על כן, ניתוח מורפולוגיה של אסטרוציטים בעקבות מניפולציה גנטית הוא כלי רב ערך להבחנה במנגנונים התאיים והמולקולריים השולטים בהקמה ובתחזוקה של מורכבות מורפולוגית של אסטרוציטים.
ניתוח המורפולוגיה של אסטרוציטים במוח העכבר מסובך הן על ידי מורכבות הסתעפות האסטרוציטים והן על ידי ריצוף האסטרוציטים. צביעת נוגדנים באמצעות החלבון החומצי של נגיף גליה (GFAP) כסמן ספציפי לאסטרוציטים לוכדת רק את הענפים העיקריים, וממעיטה במידה ניכרת במורכבות המורפולוגיתשל האסטרוציטים 1. סמנים ספציפיים לתאים אחרים כגון גלוטמט טרנספורטר 1 (GLT-1; slc1a2), גלוטמין סינטאז או S100β עושים עבודה טובה יותר בתיוג ענפי אסטרוציטים6, אך מציגים בעיה חדשה. שטחי אסטרוציטים אינם חופפים ברובם, אך קיימת מידה קטנה של חפיפה בקצוות ההיקפיים. בגלל המורכבות של הסתעפות, כאשר אסטרוציטים שכנים מסומנים באותו צבע, אי אפשר להבחין היכן מסתיים אסטרוציט אחד והשני מתחיל. תיוג דליל או פסיפס של אסטרוציטים עם חלבונים פלואורסצנטיים אנדוגניים פותר את שתי הבעיות: הסמן הפלואורסצנטי ממלא את התא כדי ללכוד את כל הענפים ומאפשר הדמיה של אסטרוציטים בודדים שניתן להבחין ביניהם לבין שכניהם. מספר אסטרטגיות שונות שימשו להשגת תיוג פלואורסצנטי דליל של אסטרוציטים, עם או בלי מניפולציה גנטית, כולל הזרקה נגיפית, אלקטרופורציה של פלסמיד או קווי עכברים מהונדסים. פרטים על ביצוע אסטרטגיות אלה מתוארים במחקרים ופרוטוקולים שפורסמו בעבר 1,7,8,9,9,10,11,12,13.
מאמר זה מתאר שיטה למדידת נפח טריטוריית אסטרוציטים ממוחות של עכברים באמצעות תיוג פלואורסצנטי באוכלוסייה דלילה של אסטרוציטים (איור 1). מאחר שהקוטר הממוצע של אסטרוציט בקליפת המוח של העכבר הוא כ-60 מיקרומטר, חלקים בעובי של 100 מיקרומטר משמשים לשיפור היעילות בלכידת אסטרוציטים בודדים בשלמותם. חיסון אינו נדרש, אך מומלץ לשפר את האות הפלואורסצנטי האנדוגני להדמיה וניתוח קונפוקליים. חיסון עשוי גם לאפשר זיהוי טוב יותר של ענפי אסטרוציטים עדינים ולהפחית את ההלבנה הפוטו-אקונומית של חלבונים אנדוגניים במהלך רכישת התמונה. כדי לשפר את חדירת הנוגדנים למקטעים העבים, וכדי לשמור על נפח הרקמה מחתך דרך הדמיה, נעשה שימוש בקטעי רקמות צפים בחופשיות. ניתוח נפח שטח אסטרוציטים מבוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה זמינה מסחרית. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח ריצוף אסטרוציטים בקטעי רקמות עם תיוג פסיפס, שבו אסטרוציטים שכנים מבטאים תוויות פלואורסצנטיות שונות. פרוטוקול זה שימש בהצלחה במספר מחקרים אחרונים 1,8,9 כדי לאפיין את צמיחת האסטרוציטים במהלך התפתחות המוח התקינה, כמו גם את ההשפעה של מניפולציה גנטית על התפתחות אסטרוציטים.

<table><tbody><tr><td>#5 מלקחיים</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק TB</td><td>בקטון דיקינסון (BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS (תמיסת מלח עם tris-buffered)</td><td></td><td></td><td>30 גרם Tris, 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, HCl עד pH 7.4, dH2O עד 1 ליטר; אחסן בטמפרטורת החדר (RT)</td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-106MP</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS</td><td></td><td></td><td>100 מ"ל 10x TBS + 900 מ"ל dH2O; אחסן ב-RT</td></tr><tr><td>1x TBS + Heparin</td><td></td><td></td><td>28.2 מ"ג הפרין + 250 מ"ל 1x TBS; אחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107MP</td><td></td></tr><tr><td>30% סוכרוז ב-TBS</td><td></td><td></td><td>15 גרם סוכרוז, 1x TBS עד 50 מ"ל; אחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>4% PFA (פרפורמלדהיד) ב-TBS</td><td></td><td></td><td>40 גרם PFA, 4-6 כדורי NaOH, 100 מ"ל 10x TBS, dH2O עד 1 ליטר; אחסן ב-4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Avertin</td><td></td><td></td><td>0.3125 גרם tri-bromoethanol, 0.625 מ"ל מתילבוטנול, dH2O עד 25 מ"ל; יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C; יש להשליך שבועיים לאחר הכנת</td></tr><tr>סרום<td>עיזים חוסם ונוגדנים</td><td></td><td></td><td>10% ב-TBST; יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>CD1 עכברים</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון איסוף למוח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-337-20</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישה קונפוקלית</td><td>אולימפוס</td><td>FV31S-SW</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td>FV3000RS</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat להב</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>הטמעת עובש</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>הקפאה בינונית</td><td></td><td></td><td>2:1 30% סוכרוז: OCT; אחסן</td></tr><tr><td>בנוגדנים RT GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP1010</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Thermo Scientific</td><td>158920010</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עוף 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N / A</td><td>גרסה 9.8.0</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>פח ארוחת צהריים מתכת</td><td>AQUARIUS</td><td>N / A</td><td>מאמזון, "קופסת כיף גדולה DIY"</td></tr><tr><td>Methylbutanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו ניתוחי</td><td>Roboz</td><td>RS-5921</td><td></td></tr><tr><td>מדיום</td><td></td><td></td> <td>הרכבה20 מ"מ טריס pH 8.0, 90% גליצרול, 0.5% N-פרופיל גלאט; יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C; מתאים עד חודשיים</td></tr><tr><td>לק</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>N-פרופיל גלאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>02370-100G</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>שמן</td><td>אולימפוס</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td>ספציפי למיקרוסקופ/מספריים הפעלה אובייקטיביים</td></tr><tr><td>6 אינץ'</td> <td>Roboz</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>שייקר פלטפורמה מסלולית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>88861043</td><td>מהירות מינימלית נדרשת: 25 סל"ד</td></tr><tr><td>מברשת צבע</td><td>Bogrinuo</td><td>N/A</td><td>מאמזון, "מברשות צבע מפורטות - מברשות מיניאטוריות "</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet (5.75 ")</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipet (9 ")VWR</td><td></td> <td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RFP נוגדן</td><td>רוקלנד</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>מדיום</td><td></td><td></td> חתך <td>1:1 גליצרול: 1x TBS; אחסן ב- RT</td></tr><tr><td>Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כרלואיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TBST (TBS + Triton X-100)</td><td></td><td></td><td>0.2% טריטון ב-1x TBS; אחסן ב-RT</td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td></td></tr><tr><td>Tri-bromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Thermo Scientific</td><td>424570025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 ( איכות גבוהה)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-489-120</td><td></td></tr><tr><td>XTsסיריםקמוריםHull</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A XTension מותאם אישית לספק כחומר משלים</td></tr></tbody></table>

ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

לאסטרוציטים יש מידה מדהימה של מורכבות מורפולוגית המאפשרת להם לתקשר כמעט עם כל סוג של תא ומבנה במוח. באמצעות אינטראקציות אלה, אסטרוציטים מווסתים באופן פעיל תפקודי מוח קריטיים רבים, כולל היווצרות סינפסות, העברה עצבית והומאוסטזיס של יונים. במוח המכרסמים, אסטרוציטים גדלים בגודלם ובמורכבותם במהלך שלושת השבועות הראשונים שלאחר הלידה ויוצרים טריטוריות נפרדות ולא חופפות כדי לרחף את המוח. פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת לניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף אסטרוציטים באמצעות מקטעי רקמה צפים בחופשיות ממוח העכבר. ראשית, פרוטוקול זה מתאר את השלבים לאיסוף רקמות, קריו-אקטציה ושמירה חיסונית של מקטעי רקמה צפים בחופשיות. שנית, פרוטוקול זה מתאר רכישת תמונות וניתוח של נפח שטח אסטרוציטים ונפח חפיפת שטח, באמצעות תוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית. לבסוף, כתב יד זה דן ביתרונות, בשיקולים החשובים, במלכודות הנפוצות ובמגבלות של שיטות אלה. פרוטוקול זה דורש רקמת מוח עם תיוג פלואורסצנטי דליל או פסיפס של אסטרוציטים, והוא מיועד לשימוש עם ציוד מעבדה משותף, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת ניתוח תמונות הזמינה מסחרית.

איור 1 מציג חלוקה סכמטית של השלבים העיקריים וזרימת העבודה עבור פרוטוקול זה. איור 2 מציג צילומי מסך של שלבים מרכזיים באמצעות תוכנת ניתוח התמונה כדי ליצור משטח, ליצור כתמים קרובים לפני השטח וליצור גוף קמור. איור 3 מדגים את היישום של טכניקה זו כדי לקבוע חפיפה/ריצוף של טריטוריית אסטרוציטים. באיור 4, תוצאות מייצגות מכתב יד9 שפורסם בעבר מדגימות את היישום של פרוטוקול זה. <strong class="...

פרוטוקול זה מתאר שיטות לחתך, צביעה והדמיה של מקטעי רקמה צפים בחופשיות במוח העכבר, ולאחר מכן תיאור מפורט של ניתוח נפח טריטוריית האסטרוציטים וחפיפת שטח האסטרוציטים או הריצוף.

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

הבנת האופן שבו אסטרוציטים מפתחים ומבססים את המורפולוגיה המורכבת שלהם חיונית להבנת האופן שבו המוח מתפתח ומתפקד. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח היבטים מרכזיים של מורפולוגיה של אסטרוציטים ברקמת המוח. פרוטוקול זה משתמש בקוד מותאם אישית למדידת נפח שטח האסטרוציטים בקטעי רקמה עבים.ניתן ליישם אסטרטגיה זו גם כדי למדוד את כמות החפיפה בשטח בין אסטרוציטים שכנים. על ידי שילוב פרוטוקול זה עם מניפולציה גנטית של אסטרוציטים, חוקרים יכולים לחקור ישירות את תפקידם של חלבונים ומסלולים ספציפיים בהתפתחות אסטרוציטים ובאינטראקציה בין אסטרוציטים לאסטרוציטים כדי להתחיל, להכין פתרון חדש של TBST על ידי הוספת 1 מיליליטר של 10%Triton X לצינור 50 מיליליטר ומילוי הצינור ל -50 מיליליטר עם TBS. הכינו 2 מיליליטרים של פתרונות חסימה ונוגדנים לכל מוח על ידי שילוב סרום עיזים ושחפת ב- TBST צינור 15 מיליליטר.לאחר מכן, סמן לוחית של 24 בארות כדי למקם דוגמאות שונות בשורות שונות בפתרונות שונים בעמודות שונות, ולאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של TBST לשלוש העמודות הראשונות המסומנות ככביסה 1, שטיפה 2 ושטיפה 3, והוסף 1 מיליליטר של תמיסת חסימה לעמודה הרביעית. מכינים קטיף זכוכית על ידי המסת הקצה של פיפטת פסטר בגודל 5.75 אינץ' לתוך וו קטן באמצעות מבער בונזן, ואז מעבירים קטעי רקמות מהצלחת בת 12 הבארות לתוך עמוד הכביסה 1 של הצלחת בת 24 הבארות באמצעות הפיק, ואז שוטפים את החלקים במשך 10 דקות כל אחד בכביסה 1, 2, ו-3 בארות על ידי שימוש באיסוף הזכוכית כדי להעביר את החלקים מבאר אחת לאחרת, ולאחר מכן דגירה של המקטעים למשך שעה אחת בתמיסת החסימה. הכן q מיליליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית על ידי הוספת הנוגדן לתמיסת הנוגדן, ולאחר מכן מערבולת לזמן קצר וצנטריפוגה במשך 5 דקות בסכום גדול או שווה ל- 4, 000 פעמים גרם ב 4 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, דגירה את החלקים בנוגדן ראשוני במשך 2 עד 3 לילות ב 4 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד. לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, שאפו את ה-TBST של היום-1 מבארות הכביסה, ואז הוסיפו 1 מיליליטר של TBST חדש לכל באר שטיפה והעבירו את החלקים לבאר הכביסה הראשונה. לאחר מכן, דגירה של מקטעים בנוגדן משני במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.לאחר דגירה משנית של נוגדנים, שאפו את ה-TBST של היום-2 מבארות הכביסה, ואז הוסיפו 1 מיליליטר של TBST חדש לכל באר שטיפה והעבירו את החלקים לבאר הכביסה הראשונה. במהלך הכביסה האחרונה, מוציאים את מדיית ההרכבה מ-4 מעלות צלזיוס ומאפשרים לה להתחמם לטמפרטורת החדר, ואז מכינים תערובת של 2 ל-1 של TBS ומים שעברו דה-יוניזציה ומוסיפים אותה לצלחת פטרי. לאחר מכן, הכינו שקופית מיקרוסקופ על ידי הוספת 800 מיקרוליטרים של תערובת 2 ל-1 של TBS ומים שעברו דה-יוניזציה לפני השטח.מעבירים את החלקים מהכביסה 3 היטב לצלחת הפטרי, ואז באמצעות מכחול דק, מעבירים את החלקים בזה אחר זה מצלחת הפטרי לנוזל שעל המגלשה. לאחר מכן, סדרו בזהירות את החלקים כך שיהיו שטוחים על השקופית באמצעות המכחול. בזהירות, הסר נוזל עודף מהמגלשה עם פיפטה P-1000, ואחריו שאיפת ואקום.לאחר הסרת כל הנוזל העודף מהמגלשה, השתמש בפיפטת העברה כדי להוסיף מיד טיפה אחת של מדיית הרכבה לכל מקטע ולהניח בעדינות כיסוי מעל המגלשה. אפשרו למדיית ההרכבה להתפשט למשך מספר דקות ולאחר מכן הסירו את כל מדיית ההרכבה העודפת שיוצאת מתחת לכיסוי על ידי שאיפת ואקום. לאחר מכן, אטמו את כל ארבעת הקצוות של החלקת הכיסוי בלק שקוף.תנו לשקופיות להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן אחסנו אותן שטוחות ב-4 מעלות צלזיוס. באמצעות מטרה של פי 10, אתר תאים בודדים להדמיה ושים לב לאזור המוח או תת-האזור הספציפי הרלוונטי לניסוי, ולאחר מכן באמצעות ידית המיקוד, לקבוע אם האסטרוציט כולו נמצא בתוך הקטע. לאחר מכן, עברו ליעד שמן הגדלה גבוה יותר והביאו את התא לפוקוס.תוך כדי התבוננות דרך פיסת העין, השתמש בידית המיקוד כדי לנוע מהחלק העליון לתחתון של התא, ולאחר מכן בדוק חזותית את התא כדי לוודא שהתא כולו נמצא בתוך המקטע. באמצעות תוכנת הרכישה הקשורה למיקרוסקופים הקונפוקליים, התאם את פרמטרי הרכישה כדי לקבל יחס אות לרעש ורמת פירוט מתאימים, ולאחר מכן השתמש בזום 2x עבור מטרה של 40x וללא זום אם אתה משתמש במטרה של 60x או 63x. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת Z עם גודל צעד של 0.5 מיקרומטרים, מה שמבטיח שכל האסטרוציט נלכד עם התמונות הראשונות והאחרונות ללא כל תיוג פלואורסצנטי של התא.לפני תחילת הניתוח, התקן את קובץ סיומת הגוף הקמור, XtspotsConvexHull, על-ידי הדבקת הקובץ בתיקיית המשנה rtmatlab של תיקיית XT. באמצעות ממיר הקבצים של אימריס, המר תמונות לפורמט IMS. לאחר מכן, פתח קובץ תמונה בתוכנת ניתוח התמונה ובחר בלחצן תצוגה תלת-ממדית כדי להציג את התמונה במצב תלת-ממד, תוך הקפדה על כך שהתא עומד בקריטריוני ההכללה.כדי ליצור משטח, לחץ על הסמל הכחול הוסף משטחים חדשים, ולאחר מכן צור אזור עניין סביב התא על-ידי הזנת ממדים לתוך התיבות מתחת לגודל כלי יצירת המשטח או גרירת הקצוות של התיבה הצהובה. לאחר מכן, התאם את העוצמה המוחלטת של הסף על-ידי גרירת הסרגל הצהוב או הזנת הערכים בתיבה כך שהמשטח האפור ימלא כמה שיותר מאותות התא מבלי לחרוג מגבולות התא. לאחר מכן, לחץ על החץ הירוק כדי לסיים את יצירת המשטח.בדוק היטב את המשטח החדש שנוצר ומחק את כל חלקי המשטח שאינם חלק מהתא על-ידי בחירתם, ולאחר מכן לחץ על הכלי עריכת עיפרון ואחריו על האפשרות מחק. כדי לאחד את חלקי השטח הנותרים, לחץ על סמל מסנן המשפך כדי לבחור הכל, ולאחר מכן לחץ על סמל עריכת העיפרון ובחר באפשרות איחוד. לחץ על הסמל הכתום הוסף כתמים חדשים ובחר את ערוץ המקור הנכון מהרשימה הנפתחת, ולאחר מכן הזן ערך קוטר XY מוערך של 0.400 מיקרומטר בתיבה.לאחר מכן, לחץ על החץ הירוק כדי לסיים את יצירת הכתמים ולאחר מכן בחר מחדש את הכתמים. לחץ על סמל המסנן ובחר את המרחק הקצר ביותר למשטחים משטחים משטחים X כאשר משטחים X הוא המשטח המנותח מהרשימה הנפתחת, כדי להבטיח שגם לחצני ההפעלה של הסף התחתון וגם הסף העליון יהיו ירוקים. לאחר מכן, הזן מרחק מינימלי של מינוס 1.0 מיקרומטר בתיבת הסף התחתונה ומרחק מרבי של 0.1 מיקרומטר בתיבת הסף העליונה, ולאחר מכן לחץ על לחצן מקטע כפול לנקודות חדשות, כדי להבטיח שהכתמים החדשים שנוצרו נבחרו בחלונית השמאלית העליונה של חלון התוכנה.לאחר מכן, לחץ על סמל כלי ההילוכים ולאחר מכן לחץ על תוסף ה- Convex Hull רק פעם אחת והמתן עד שחלון MATLAB יופיע ואז ייעלם וכתוצאה מכך גוף מוצק בתצוגת התלת-ממד. בחלונית השמאלית העליונה, ודא שגוף קמור של ספוטים X בחירה, המרחק הקצר ביותר שבו בחירת ספוטים X היא הכתמים החדשים שנוצרו נבחרה ולאחר מכן לחץ על הגוף כדי לבחור אותו. לאחר מכן, לחץ על סמל סטטיסטיקת גרפים.בכרטיסיה בחירה, ודא שערכים ספציפיים נבחרים מהרשימה הנפתחת העליונה ולאחר מכן בחר אמצעי אחסון מהרשימה הנפתחת התחתונה, ולאחר מכן תעד את עוצמת הקול של גוף הספינה ושמור את הקובץ, תוך המשך לתמונה הבאה. נפח שטח האסטרוציטים נמדד באסטרוציטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום ממוקד ממברנה. פירוק של מולקולת הידבקות התאים המועשרה באסטרוציטים, hepaCAM, מפחית באופן משמעותי את נפח שטח האסטרוציטים.ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים שימש ליצירת עכברים שבהם אסטרוציטים מסוג בר מבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום ואסטרוציטים של hepaCam נוקאאוט מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק. אחוז החפיפה בשטח בין זוגות אסטרוציטים פלואורסצנטיים של חלבונים פלואורסצנטיים אדומים וירוקים שכנים חושב. העכברים שעברו שינוי גנטי של hepaCAM ואסטרוציטים ירוקים הראו עלייה משמעותית באחוזים של נפח חפיפת שטחים עם שכניהם האדומים מסוג בר בהשוואה לזוגות אסטרוציטים מסוג פרא בלבד.תוצאה זו מדגימה כי hepaCAM נדרש עבור נפח שטח אסטרוציטים רגיל, וריצוף אסטרוציטים. זה קריטי כדי להבטיח שהתא עומד בקריטריוני ההכללה. לתא לא שלם יהיה נפח שטח קטן יותר והוא עשוי להשפיע על התוצאות והמסקנות הכוללות שלך.

analysis-astrocyte-territory-volume-tiling-thick-free-floating-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את ההליך לצביעה חיסונית של קטע קבוע של רקמת מוח של עכבר עם אסטרוציטים מסומנים פלואורסצנטיים באמצעות נוגדנים ראשוניים ומשניים ולכידת התמונות של האסטרוציטים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

צביעה חיסונית של אסטרוציטים בעלי תווית פלואורסצנטית בקטע רקמת מוח של עכבר

מקור: Moye, S. L., et.al.  ויזואליזציה של מורפולוגיה של אסטרוציטים באמצעות יונטופורזיס צהוב של לוציפר. J. Vis. exp. (2019).  סרטון זה מדגים את השימוש ביונטופורזיס בצבע פלואורסצנטי כדי לחקור מורפולוגיה של אסטרוציטים בפרוסות מוח קבועות. הוא מפרט את הניקוב של סומה האסטרוציטים עם אלקטרודה כדי להעביר צבע אניוני, הידרופילי לתוך הציטופלזמה תחת זרם מתח נמוך, מה שמאפשר לצבע לפזר ולתייג את הסומה והענפים. לאחר מכן משתמשים במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להמחיש את האסטרוציטים המסומנים ולספק תובנות מורפולוגיות.

הדמיה של מורפולוגיה של אסטרוציטים באמצעות יונטופורזה של צבע פלואורסצנטי בפרוסת מוח קבועה של עכבר

מקור: Bagheri, M., et. al. פרוטוקול לניתוח מורפומטרי קונפוקלי תלת מימדי של אסטרוציטים. J. Vis. Exp. (2015).סרטון זה מדגים הדמיה של אסטרוציטים עם תווית פלואורסצנטית בקטע מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. חלק המוח ממוקם תחת עדשת האובייקט המתאימה, ונבחרים פלואורופורים ומסננים מתאימים. לאחר אופטימיזציה של החשיפה באופן אוטומטי, פרמטרי הסריקה מוגדרים כדי להבטיח תמונות דו-ממדיות ברזולוציה גבוהה. פרמטרים של מחסנית Z מוגדרים, ותמונות תלת מימד מתקבלות.

הדמיה תלת מימדית של אסטרוציטים בעלי תווית חיסונית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית משנים את תכונותיהם התפקודיות והמבניות בתגובה לגירויים מזיקים. דוח זה מציג פרוטוקול להערכת מורפולוגיה תלת מימדית של אסטרוציטים במצבי מחלה או לאחר התערבויות טיפוליות.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את הארגון של רשתות astrocytic. השיטה המתוארת ממזער הטיה לספק מדדים תיאוריים של רשתות אלה כגון ספירת תאים, גודל, שטח, מיקום בתוך גרעין. . בנוגע למקורו שקובעת עם ניתוח וקטורי.

ניתוח של גודל, צורה, כיוון של רשתות של האסטרוציטים בשילוב

קו הצינור המתואר מיועד לפילוח של נתונים מיקרוסקופ אלקטרונים הגדולים יותר מאשר ג'יגה-בתים, כדי לחלץ מורפולוגיות תא שלם. לאחר התאים משוחזרים ב-3D, תוכנה מותאמת אישית שתוכננה סביב צרכים בודדים ניתן להשתמש כדי לבצע ניתוח איכותי כמותי ישירות ב-3D, גם באמצעות מציאות וירטואלית כדי להתגבר על החסימה השקפה.

שיטה לניתוח שחזור תלת מימד ומציאות וירטואלית של תאים גליאל ונוירוונאליות

האסטרולוגים הם תאים מורכבים מורפולוגית, לידי ביטוי על ידי התהליכים המרובים שלהם בשטחים סבוך. כדי לנתח את המבנה המשוכלל שלהם, אנו מציגים פרוטוקול אמין כדי לבצע לוציפר תאיים ביוטופהורזיס צהוב בעדינות רקמה קבועה.

המחשה מורפולוגיה באמצעות לוציפר ביוטופזיס צהוב

כאן אנו מתארים בשיטת הדמיה לחיות מחוץ לתמונה כדי להמחיש הובלה תאיים של אורגלים וסחר של חלבונים קרום פלזמה ב astrocytes מורטין. פרוטוקול זה מציג גם מתודולוגיה לניתוח תמונה כדי לקבוע מסלולים להובלת מטענים וקינטיקה.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

אסטרוציטים לפרוש את קליפת המוח באופן אחיד, מה שהופך את הניתוח של המורפולוגיה המורכבת שלהם מאתגר ברמה התאית. הפרוטוקול המסופק כאן משתמש בתיוג צבעוני המבוסס על אלקטרופורציה ברחם כדי לבודד אסטרוציטים קליפתיים ולנתח את נפחם ומורפולוגיה שלהם עם צינור ניתוח תמונה ידידותי למשתמש.

ב אלקטרופולציה הרחם של גנום רב-תכליתי שילוב צבע (MAGIC) סמנים כדי להתאים אישית אסטרוציטים עכבר קליפת המוח

שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.

חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים לנוירונים במוחות מנוקים

למדו לנתח נפח טריטוריה וחפיפת טריטוריות של אסטרוציטים ברקמת מוח עבה של עכברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וקוד מותאם אישית. שיטה זו מאפשרת חקירת תפקידי חלבונים בפיתוח אסטרוציטים ובאינטראקציות ביניהם.

ניתוח נפח טריטוריית אסטרוציטים וריצוף בקטעי רקמה עבים שצפים בחופשיות

גלה סרטונים נוספים