פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את מורפולוגיית האסטרוציטים על ידי ניתוח תמונות תלת-ממדיות של אסטרוציטים שנרכשו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ניתן להשתמש בשיטה זו להערכת שינויים מורפולוגיים שעשויים להופיע בסוגי תאים שונים, הן בתנאים פתולוגיים והן כתוצאה מאסטרטגיית התערבות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לחקור בו-זמנית פרמטרים רבים הקשורים לארכיטקטורה התאית.

ד"ר Mariam Bodel תדגים הליך זה. לאחר הכנת השקיפות לצביעה אימונוהיסטוכימית, בצעו דפראיזציה (deparization) לחתכים על ידי טבילה ב-xylene פעמיים למשך 10 דקות. הדגרי את השקיפות למשך 10 דקות בכל אחת מהתמיסות הבאות: ethanol בריכוזים של 99.8%, 95% ו-70% כדי להחזיר את הלחות לחתכים לאחר השטיפה. הדגרי את השקיפות ב-PBS עם תמיסת נוגדן ראשוני ל-glial fibrillary acidic protein או GFAP בדילול של 1:1500, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר הדגירה, שטפו את החתכים ב-PBS 3 פעמים למשך חמש דקות. לאחר מכן, דגרו את השקופיות עם תמיסת נוגדן משני המשורשר לפוספטאז השכי (alkaline phosphatase) בדילול של 1:100 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו שוב את החתך ב-PBS 3 פעמים למשך חמש דקות, פחות מ-30 דקות לפני השימוש.

הוסיפו טיפה אחת של תמיסת כרומוגן אדום לשלושה מיליליטרים של בופר סובסטרט. דגרו כל שקופית ב-100 µL מהתמיסה הזו במשך 15 עד 20 דקות בחושך. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-PBS שלוש פעמים למשך חמש דקות.

לבסוף, צבעו את הגרעינים באמצעות DPI המדולל ביחס של 1:500 ב-PBS. טפטפו אחת עד שתיים טיפות של תוך Antifa על החיתוך וסגרו מיד עם זכוכית כיסוי. דגרו את השקופיות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות לפני המיקרוסקופיה כדי להבטיח את האיטום.

כדי להתחיל במיקרוסקופיה קונפוקלית, הנח זכוכית על במה המיקרוסקופ ובחר בעדשה 63x. לאחר פתיחת תוכנת הרכישה, לחץ על smart setup בלשונית הרכישה ובחר את מערכת הפילטרים המתאימה. במקרה זה, נעשה שימוש ב-dappy וב-Alexa Fluor 555.

בשלב הבא, לחצו על best signal ולאחר מכן על apply. לאחר מכן לחצו על set exposure כדי לאפשר למחשב לקבוע את פרמטרי החשיפה האופטימליים. כדי למקסם את איכות התמונה, פתחו את חלון הערוצים (channels) והעבירו את התמונה למצב live. כוונו את המיקוד במידת הצורך.

לאחר מכן, לחצו על חלקיק au אחד כדי למטב את חור הפינוהול (pinhole), וכוון את ההגבר (gain) לקבלת העוצמה המיטבית. לבסוף, הגדירו את ההגבר הדיגיטלי בין שניים לשלושה. לאחר אופטימיזציה זו, הפסיקו את התמונה החיה ופתחו את חלון מצב הרכישה (acquisition mode).

כוון את גודל המסגרת על ידי לחיצה על X על ידי Y ובחר 10 24 על ידי 10 24. כמו כן, בחר במהירות איטית. לאחר מכן, פתח את לשונית הממוצעים ובחר מספר הגדול או שווה לארבעה.

לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-snap ושמרו את תמונת ה-2D שצולמה. כדי להגדיר דימות בתלת-ממד, פתחו את לשונית ה-smart setup וסמנו את הפריט ZS stack, פעולה שתגרום לפתיחת חלון ה-Zs stack. כדי לקבוע את המיקומים הראשונים והאחרונים עבור ה-Zack, לחצו שוב על live וכווני את הפוקוס למיקום העליון ביותר של האסטרוציט.

לחצו תחילה על set first. כעת כווןו את המיקוד למ position הנמוך ביותר של האסטרוציט, ולחצו על set last, ולאחר מכן הפסיקו את תצת ה-live view. לאחר מכן, בחרו את המרווח על ידי לחיצה על optimal.

כדי לקבוע את מספר הפרוסות כאן, המרווח הוא 1.01 micrometers. לבסוף, לחצו על start, experiment, ושמרו את התמונות לאחר השלמת הסריקה. כמו כן, רכשו תמונה דו-ממדית (2D) באמצעות עדשה אובייקטיבית של 10x או 20x.

עבור מדידות של עוצמת פלואורסצנציה, בחרו בכלי המלבן או העיגול בחלון התמונה וסמנו אזור למדידה כדי לכמת את הנפח ואת שטח הפנים של גוף התא (soma) של גרעין האסטרוציט והטריטוריה שלו. העבירו את תמונות התלת-ממד לתוכנת ניתוח מתאימה, כגון Velocity 6.1 בתוכנת הניתוח. צרו ספרייה חדשה וגררו את כל התמונות לעמודה האפורה השמאלית.

בחרו תמונה תלת-ממדית אחת והפעילו את אחד הערוצים שנרכשו שמעניינים אתכם, כגון dapi. עבור מדידות גרעיניות, כווננו ידנית את הבהירות כדי למקסם את הניגודיות. כעת בחרו בתפריט הכלים (tools menu).

בחרו ב-make volume, והפיקו תמונה תלת-ממדית אחת מתמונות ה-Zack. פתחו את תפריט העריכה (edit) ולחצו על properties. ודאו שהמאפיינים X, Y ו-Z מוצגים.

לאחר מכן, בחרו את כלי ה-ROI החופשי (freehand ROI tool) מסרגל הכלים. בעזרת הכלי שנבחר, שרטטו קו מסביב לגרעין המסומן ב-DPI כדי למדוד את הנפח ואת שטח הפנים של גרעין האסטרוציט. שוב, בעזרת כלי ה-ROI החופשי, מדדו את הנפח ואת שטח הפנים של האסטרוציט כולו על ידי שרטוט קו מסביב לסומה תוך מעקב אחר פני השטח של כל הענפים.

לחצו על תפריט המדידות (measurements) בחלק העליון של חלון התמונה, גררו את האפשרות "find objects" לראש החלון ותנו שם תיאורי לאוכלוסייה אחת (population one), בחרו את הצבע המתאים ולחצו על "measure", פעולה שתפתח חלון חדש. בחלון זה, בחרו בנפח (volume) או בשטח פנים (surface area) כפרמטר ולחצו על אישור (okay).

כדי לשמור את הנתונים, לחץ על תפריט המדידות ובחר בפריט "צור מדידה" (make measurement). בחר מהחלון פריט מדידה חדש בשם. הזן שם קובץ עבור הנתונים ולחץ על אישור.

לבסוף, ייצאו את נתוני המדידה לחבילת תוכנה מתאימה כדי לבצע ניתוח סטטיסטי וליצור גרפים של הנתונים. במקרה זה, החוקרים השוו בין אסטרוציטים ברקמת מוח מקובעת של חולדות שטופלו ב-amyloid beta one 40 או ב-amyloid beta one 40 ו-Ian. הזרקת טיפול בחלבון האמילואיד הובילה לאסטרוציטים עם ענפים עבים וארוכים יותר.

אסטרוציטים אלו מבעלי חיים שקיבלו טיפול ב-Ian הפגינו צורה כוכבית עם ענפים קצרים ודקים. חולדות שקיבלו טיפול ב-Ian הראו גם ירידה בفلורסנציה חיובית ל-GFAP באסטרוציטים בחתכי מוח. ניתוח מורפומטרי של נפחים ספציפיים של אסטרוציטים גילה כי נפח הגרעין של האסטרוציט, גוף התא, האסטרוציט כולו וטריטוריית האסטרוציט פחתו בטיפול ב-Ian בהשוואה לטיפול באמילואיד בלבד.

לאחר השליטה בעיבוד התמונה, ניתן להשלים את טכניקת הניתוח בתוך מספר דקות לכל תא, אם היא מבוצעת כראוי. במהלך ביצוע הליך זה, חשוב לסמן את המבנה בדיוק גבוה. מומלץ להתאמן על סימון המבנה הרלוונטי באופן ידני לפני תחילת הניסוי לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הביולוגיה של התא, ההיסטולוגיה והפתולוגיה לבחון את מבנה התא במצב בריא או במצב מחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי מדידה של 12 פרמטרים שונים לתא בודד באמצעות תמונות בתלת-ממד.