פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את המורפולוגיה של אסטרוציטים על ידי ניתוח תמונות תלת מימדיות של אסטרוציטים שנרכשו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך שינויים מורפולוגיים שיכולים להופיע בסוגי תאים שונים, בין אם בתנאים פתולוגיים או כהשפעה של אסטרטגיית התערבות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ללמוד בו זמנית פרמטרים רבים הקשורים לארכיטקטורה סלולרית.

ד"ר מרים בודל תדגים הליך זה לאחר הכנת שקופיות לצביעה אימונוהיסטוכימית דה פריז קטעי דה פריז על ידי טבילתם בקסילן פעמיים למשך 10 דקות. דגרו את המגלשות למשך 10 דקות בכל אחת מ-99.8%95% ו-70% אתנול כדי להחזיר לחות לחלקים לאחר הכביסה. PBS מדגרים את השקופיות בדילול של 1 עד 1500 של חלבון חומצי סיבי גליה או תמיסת נוגדנים ראשונית GFAP בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

לאחר הדגירה יש לשטוף את החלקים ב-PB S3 פעמים למשך חמש דקות. לאחר מכן דגרו את השקופיות עם תמיסת נוגדנים משנית מצומדת פוספטאז אלקליין למשך שעה בטמפרטורת החדר. שוב, שטפו את החלק ב-PB S3 פעמים למשך חמש דקות, פחות מ-30 דקות לפני השימוש.

הוסף טיפה אחת של תמיסת כרומוגן אדומה לשלושה מיליליטר של מאגר מצע. דגרו כל שקופית ב-100 מיקרוליטר של תמיסה זו למשך 15 עד 20 דקות בחושך. לאחר מכן שטפו את השקופיות ב- PB S3 פעמים למשך חמש דקות.

לבסוף, צבעו את הגרעינים עם DPI מדולל אחד עד 500 ב-PBS. מרחו טיפה אחת עד שתיים של מדיום אנטיפה על החלק ואטמו מיד עם החלקת כיסוי. דגרו את המגלשות בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות לפני המיקרוסקופיה כדי להבטיח איטום.

כדי להתחיל במיקרוסקופיה קונפוקלית, הנח שקופית על שלב המיקרוסקופ ובחר את המטרה פי 63. לאחר פתיחת תוכנת הרכישה, לחץ על הגדרה חכמה בלשונית הרכישה ובחר את הקומה המתאימה של ארבע. כאן משתמשים בדאפי ואלכסה, קומה 5 55.

לאחר מכן, לחץ על האות הטוב ביותר, ואחריו החל. לאחר מכן לחץ על הגדר חשיפה כדי לאפשר למחשב לקבוע את פרמטרי החשיפה האופטימליים כדי לייעל את התמונה, פתח את חלון הערוצים והעביר את התמונה לחיות. כוונן את המיקוד במידת הצורך.

לאחר מכן לחץ על au אחד כדי לייעל את חור הסיכה, להתאים את הרווח לעוצמה הטובה ביותר. לבסוף, הגדר את הרווח הדיגיטלי בין שניים לשלוש. לאחר אופטימיזציה זו, עצור את התמונה החיה ופתח את חלון מצב הרכישה.

התאם את גודל המסגרת על ידי לחיצה על X על Y ובחר 10 24 על 10 24. בחר גם מהירות איטית. לאחר מכן, פתח את כרטיסיית המיצוע ובחר מספר גדול או שווה לארבע.

לאחר מכן לחץ על כפתור הצמד ושמור את התמונה הדו-ממדית שצולמה. כדי להגדיר הדמיה תלת-ממדית, פתח את כרטיסיית ההגדרות החכמות וסמן את פריט המחסנית ZS, מה שיגרום לחלון המחסנית Zs להיפתח. כדי להגדיר את המיקום הראשון והאחרון עבור Zack, שוב, לחץ בזמן אמת והתאם את המיקוד למיקום העליון ביותר של האסטרוציטים.

לחץ על הגדר תחילה. כעת כוונן את המיקוד למיקום הנמוך ביותר של האסטרוציטים, ולחץ על הגדר אחרון, ולאחר מכן עצור את התצוגה החיה. לאחר מכן, בחר את המרווח על ידי לחיצה על אופטימלי.

כדי להגדיר את מספר הפרוסות כאן, המרווח הוא 1.01 מיקרומטר. לבסוף, לחץ על התחל, התנסה ושמור את התמונות לאחר השלמת הסריקה. כמו כן, רכשו תמונה דו-ממדית באמצעות מטרה של 10 x או 20x.

למדידות עוצמת הקרינה, בחרו בכלי המלבן או העיגול בחלון התמונה וסמנו אזור למדידה כדי לכמת את הנפח ושטח הפנים של גוף התא והטריטוריה של גרעין האסטרוציטים. העבר את התמונות התלת מימדיות לתוכנת ניתוח מתאימה, כגון Velocity 6.1 בתוכנת הניתוח. צור ספרייה חדשה וגרור את כל התמונות לעמודה האפורה השמאלית.

בחר תמונה תלת-ממדית אחת והפעל את אחד מערוצי העניין שנרכשו, כגון dapi. עבור מדידות גרעיניות, התאם ידנית את הבהירות כדי לייעל את הניגודיות. כעת בחר בתפריט הכלים.

בחר צור נפח והפק תמונה תלת מימדית אחת מתמונות Zack. פתח את תפריט העריכה ולחץ על מאפיינים. ודא שהמאפיינים X, Y ו- Z מוצגים.

לאחר מכן, בחר בכלי החזר ROI ביד חופשית מסרגל הכלים. באמצעות הכלי שנבחר, ציירו קו סביב הגרעין המסומן ב-DPI כדי למדוד את הנפח ושטח הפנים של גרעין האסטרוציטים. שוב, באמצעות כלי החזר ההשקעה ביד חופשית, מדדו את הנפח ואת שטח הפנים של האסטרוציט כולו על ידי ציור קו סביב הסומה בעקבות פני השטח של כל הענפים.

לחץ על תפריט המדידות בחלק העליון של חלון התמונה גרור אובייקטים לראש החלון ותן שם תיאורי לאוכלוסייה אחת, בחר את הצבע המשויך ולחץ על מדידה, שיפתח חלון חדש. בחלון חדש זה. בחר נפח או שטח פנים כפרמטר ולחץ על אישור.

כדי לשמור את הנתונים, לחץ על תפריט המדידה ובחר הפוך פריט מדידה. בחר פריט מדידה חדש שנקרא מהחלון. הזן שם קובץ עבור הנתונים ולחץ על אישור.

לבסוף, ייצא את נתוני המדידה לחבילת תוכנה מתאימה לביצוע ניתוח סטטיסטי וליצירת עלילות נתונים. כאן, החוקרים השוו אסטרוציטים ברקמת מוח קבועה מחולדות שטופלו בעמילואיד בטא אחד 40 או עם עמילואיד בטא אחד 40 ואיאן. הזרקת טיפול בחלבון העמילואיד הביאה לאסטרוציטים עם ענפים עבים וארוכים יותר.

אסטרוציטים אלה מבעלי חיים שטופלו על ידי איאן הציגו צורת כוכב עם ענפים קצרים ודקים. חולדות שטופלו על ידי איאן הראו גם פלואורסצנטיות חיובית מופחתת של אסטרוציטים GFAP בפרוסות המוח. הניתוח המורפומטרי של נפחי אסטרוציטים ספציפיים גילה כי נפח גוף התא של גרעין האסטרוציטים כולו וטריטוריית האסטרוציטים ירד עם הטיפול באיאן בהשוואה לטיפול בעמילואיד בלבד.

לאחר שליטה בתמונה זו, ניתן להשלים את טכניקת הניתוחים תוך מספר דקות לכל תא אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לסמן את המבנה בדיוק גבוה. עדיף לתרגל סימון ידני של מבנה העניין לפני תחילת הניסוי לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא, היסטולוגיה ופתולוגיה לחקור מבנה של תא בסביבה בריאה או מחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב למדוד 12 פרמטרים שונים עבור תא בודד באמצעות תמונות תלת מימד.