Rapid and Specific Detection of <em>Acinetobacter baumannii</em> Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Xia Zhang; Meina Duan; Yuzhe Zhao; Kaifeng Zhang; Fei Liu; Jing Jie; Chunxiuli Li; Dong Chen; Dan Li; Shucheng Hua; Chunyan Wang; Qingtian Guan; Jing Wu; Bing Liu; Lei Song

doi:10.3791/67542

זיהוי מהיר וספציפי של זיהומי אצינטובקטר באומני באמצעות הגברת פולימראז רקומבינאז/מערכת מב...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Immunology and Infection

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

זיהוי מהיר וספציפי של זיהומי אצינטובקטר באומני באמצעות הגברת פולימראז רקומבינאז/מערכת מבוססת Cas12a

Full Text

1,489 Views

07:59 min

April 25, 2025

DOI: 10.3791/67542-v

Xia Zhang¹, Meina Duan², Yuzhe Zhao², Kaifeng Zhang², Fei Liu², Jing Jie², Chunxiuli Li², Dong Chen², Dan Li², Shucheng Hua², Chunyan Wang¹, Qingtian Guan³, Jing Wu¹, Bing Liu², Lei Song²

¹Department of General Practice,The First Hospital of Jilin University, ²Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases,The First Hospital of Jilin University, ³Bioinformatics Laboratory,The First Hospital of Jilin University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for the rapid and precise detection of Acinetobacter baumannii using Recombinase Polymerase Amplification (RPA) combined with LbaCas12a endonuclease. The method addresses limitations of traditional diagnostic techniques, providing a more efficient approach to identifying infections.

Key Study Components

Area of Science

Microbiology
Infectious Diseases
Diagnostic Techniques

Background

Acinetobacter baumannii is a significant pathogen in respiratory infections.
Current diagnostic methods are often slow and culture-based.
Advancements in CRISPR and RPA technologies offer potential improvements.
Rapid detection is crucial for effective treatment and management of infections.

Purpose of Study

To develop a rapid detection protocol for A. baumannii.
To enhance specificity and sensitivity in identifying infections.
To overcome limitations of existing diagnostic methods.

Methods Used

Design of primer pairs using standard design principles.
Utilization of CRISPR RNA with LbaCas12a for target detection.
Implementation of RPA for amplification of target DNA.
Evaluation of specificity and sensitivity through fluorescence quantitative PCR.

Main Results

The optimal primer pair F3-R3 was identified for RPA.
The system demonstrated high specificity for A. baumannii DNA.
Detection sensitivity reached as low as one copy per microliter.
The method showed no cross-reactivity with other bacterial species.

Conclusions

The developed protocol is effective for rapid detection of A. baumannii.
It provides a robust alternative to traditional diagnostic methods.
Future applications could enhance infection control and treatment strategies.

Frequently Asked Questions

What is the significance of detecting Acinetobacter baumannii?

A. baumannii is a major cause of hospital-acquired infections, making rapid detection critical for patient management.

How does the RPA method compare to traditional techniques?

RPA is faster and does not require culture-based methods, allowing for quicker diagnosis.

What role does CRISPR play in this detection method?

CRISPR RNA guides the detection system to specifically target A. baumannii DNA.

What are the limitations of current diagnostic methods?

Current methods are often time-consuming and may miss low-level infections.

Can this method detect other bacterial species?

No, the method is designed to specifically detect A. baumannii without cross-reactivity.

What is the optimal reaction time for the RPA process?

The optimal reaction time identified in the study is 20 minutes.

כדי להקל על הזיהוי המהיר והמדויק של Acinetobacter baumannii, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש בהגברה רקומבינאז פולימראז (RPA) בשילוב עם אנדונוקלאז LbaCas12a לזיהוי זיהומי A. baumannii .

המחקר שלי מתמקד במחלות נשימה ובזיהומים. אתייחס לטכנולוגיות הנוכחיות המתקדמות בתחום זה ולפערי המחקר של תחום הפרויקט כולו. טכנולוגיות מפתח שאנו מדברים עליהן כאן כוללות ריצוף מהדור הבא, CRISPR, ריצוף RNA של תא בודד ומודלים לניתוח איברים. יש להם נתון קשה בכל הנוגע לאבחון על מחלות לב סטנדרטיות, לעבוד ולהגיע לטיפול טוב יותר. הפרוטוקול שלי עונה על הצורך בזיהוי מהיר וספציפי של Acinetobacter baumannii, תוך התגברות על מגבלות בענייני אבחון עכשוויים כמו טכניקות גוזלות זמן ומבוססות תרבית.

[קריין] כדי להתחיל, תכנן 12 זוגות פריימרים באמצעות כלי תכנון פריימרים המבוססים על עקרונות עיצוב סטנדרטיים. השג ארבעה פריימרים קדימה ושלושה פריימרים הפוכים כדי להרכיב 12 זוגות פריימרים. העריכו כל זוג פריימר לספציפיות ויעילות באמצעות הכלי Primer-BLAST מהמרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי. לאחר מכן תכנן את ה-CRISPR RNA או ה-RNA המנחה או ה-gRNA באמצעות רצף פיגומי ה-RNA LbaCas12a CRISPR כרצף הקבוע. שלב קטע ספציפי למטרה, וודא שהמוטיב הסמוך לפרוטו-ספייסר או PAM ממוקם בקצה חמשת הראשונים של הגדיל הלא משלים. לבניית הפלסמיד הרקומביננטי החיובי, הגבירו תחילה את מקטע ה-acinetobacter baumannii 16S rDNA באמצעות ערכות הפריימר קדימה ואחורה. הכן את תערובת תגובת ה-PCR בנפח 50 מיקרוליטר כפי שמופיע על המסך. הגדר את תנאי הרכיבה של PCR במכשיר ה-PCR. לאחר טיהור תוצר ה-PCR החיובי, שכפל אותו לווקטור PUC57 שעוכל עם אנזימי BamHI ו-SalI. לדלל את הפלסמיד הרקומביננטי החיובי באופן סדרתי במרווחים של פי עשרה במים מזוקקים כפולים מעוקרים. אחסן את הפלסמיד המדולל במינוס 20 מעלות צלזיוס לניסויים נוספים. לאחר מכן, ערבבו יחד מאגר התייבשות ללא פריימר, פריימרים קדימה ואחורה של A. baumannii ומים מזוקקים כפולים לנפח סופי של 465 מיקרוליטר. מערבולת וסובב בקצרה את התערובת לפני העברתה לצינורות תגובת אנזים מערכת ה-RPA. מערבבים היטב ומוסיפים 25 מיקרוליטר של 280 מילי-מולרי מגנזיום אצטט. לאחר מכן, פיפטה מיקרוליטר אחד של הפלסמיד הרקומביננטי החיובי, המכיל 10⁷ עותקים למיקרוליטר לתמיסה A עם זוגות פריימר שונים. דגרו את התמיסה בחום של 39 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן טהר את המוצרים המוגברים באמצעות ערכת טיהור RPA. הפעל את המוצר המטוהר על ג'ל אגרוז 1% ב-120 וולט למשך 10 דקות כדי לזהות את זוג הפריימר עם הרצועה הבהירה והרחבה ביותר. לאופטימיזציה של מערכת ההגברה RPA, שמור על הריכוזים של כל שאר רכיבי התגובה קבועים תוך התאמת הנפח הסופי של תמיסה A ל-465 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף כמויות מתאימות של מים מזוקקים כפולים ללא RNA כדי לקבל ריכוזי פריימר סופיים כפי שניתן ולדגור. לאחר טיהור ואלקטרופוריזציה של מוצר ה-RPA, זהה את ריכוז הפריימר וזמן הדגירה האופטימליים על ידי ניתוח עוצמת הלהקה והפצתה. להכנת תמיסה B, מערבבים יחד מדווח DNA חד-גדילי, מאגר תגובה CAST12a, CRISPR RNA CAST12a ומים מזוקקים כפולים לנפח סופי של 15 מיקרוליטר. הוסף חמישה מיקרוליטר של הגברת פולימראז רקומבינאז או מוצר RPA לתמיסה B. מערבבים היטב עד לקבלת תערובת אחידה. הנח את הדגימות במכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי. לבדיקת ספציפיות, השג תבניות DNA ממינים שונים באמצעות ערכת מיצוי DNA ייחוס או על ידי הרתחת חיידקים במים. השתמש במים כבקרה שלילית. העבירו 10 ננוגרם, או מיקרוליטר אחד, מתבניות ה-DNA לתמיסה A המכילה פריימרים קדימה ואחורה. ואז פיפטה 25 מיקרוליטר של מגנזיום אצטט 280 מילימולר. מערבבים היטב ודוגרים בחום של 39 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים חמישה מיקרוליטר מתוצר התגובה לתמיסה B ומערבבים. הנח את הדגימות במכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי. הגדר את הערוץ ל-FAM וקרא את האות הפלואורסצנטי כל דקה ב-39 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות בסך הכל. להערכת רגישות של פלטפורמת הזיהוי מבוססת RPA-CRISPR CAST12a, השתמש בפלסמיד רקומביננטי חיובי מדולל לריכוזים הנעים בין עותק אחד ל-10⁷ למיקרוליטר כתבנית לתגובה. השתמש במים כבקרה שלילית. העבירו פלסמיד לתמיסה A, הוסיפו מגנזיום אצטט ודגרו כפי שהודגם קודם לכן. לאחר הדגירה וההעברה לתמיסה ב', קרא את השלט הפלואורסצנטיאל. זוג הפריימר F3-R3 זוהה כיעיל ביותר להגברת פולימראז רקומבינאז, ומציג את הרצועות הבהירות והצפופות ביותר באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. ריכוז הפריימר האופטימלי להגברה נקבע כ-0.44 מיקרומולר, וזמן התגובה האופטימלי היה 20 דקות. עוצמת הקרינה של CRISPR RNA1 עלתה עם הזמן, בעוד ש-CRISPR RNA2 לא, מה שהוביל לבחירה ב-CRISPR RNA1 לזיהוי A. baumannii. ניתוח הספציפיות אישר שמערכת הגלאים של A. baumannii זיהתה באופן בלעדי DNA של A. baumannii, ללא פלואורסצנטיות עבור דגימות DNA חיידקיות אחרות. המערכת יכלה לזהות עותק אחד למיקרוליטר של DNA, מה שהופך אותה לרגישה ביותר. בדיקת רצועת הזרימה הרוחבית אישרה את הספציפיות הגבוהה של שיטת הזיהוי, ולא הראתה תגובתיות צולבת עם מיני חיידקים אחרים. בדיקת A. baumannii זיהתה בהצלחה DNA על פני דילולים מ-10⁷ עותקים למיקרוליטר ועד עותק בודד למיקרוליטר, ואישרה את חוסנו באור UV.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos