פרוטוקול פשוט למיפוי תכונות ארכיטקטורת מערכת שורש הצמח

זוהי שיטה הידרופונית לא פולשנית למדידת ארכיטקטורת מערכת השורשים באמצעות ציוד מעבדה שגרתי. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה מלאה של כל מערכת השורשים של הצמח על ידי פיזור ידני שלה. אחד היתרונות העיקריים של ניתוח RSA הוא שהוא מאפשר ללמוד את מערכת שורשי הצמח ללא צורך אשר יכול להציג זיהום יסוד לא רצוי.

שיטה זו יכולה לתעד את האינטראקציה הסביבתית הישירה כולל הורמונים, חומרים מזינים ותנאי אקלים עם RSA של מערכות צמחים. התחילו את עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis על ידי השריית כף מדידה זעירה של כ-100 זרעים במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה קצרה של הזרעים ב 500 G למשך חמש שניות באמצעות צנטריפוגה שולחנית.

לאחר מכן, decant את המים, ולהוסיף 700 מיקרוליטר של 70% אתנול לפני מערבול הצינור במשך כמה שניות. צנטריפוגו שוב את הזרעים. במידת הצורך, חזור על מערבולות וצנטריפוגה, וודא כי טיפול 70% אתנול לא יעלה על שלוש דקות.

לאחר שלוש דקות, מיד לשטוף את הזרעים עם מים סטריליים. לאחר מכן, טפלו בזרעים באמצעות אקונומיקה מסחרית מדוללת המכילה טיפה של TWEEN 20 למשך שבע דקות. מערבבים את הזרעים עם תמיסת אקונומיקה על ידי היפוך הצינורות במהירות שמונה עד 12 פעמים.

לאחר צנטריפוגה קצרה, רוקנו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, ושטפו את הזרעים לפחות חמש פעמים במים סטריליים, לאחר אותו הליך מערבול. השאירו את הזרעים המעוקרים על פני השטח במים, ודגרו עליהם במשך יומיים-שלושה בארבע מעלות צלזיוס לריבוד. Autoclave קופסת מגנטה סטנדרטית מלאה למחצה במים מזוקקים.

חתכו את יריעת הפוליקרבונט האוטוקלאבית למלבנים בגודל ארבעה על שמונה סנטימטרים עם נקודת אמצע מחורצת יותר ממחצית הדרך של המלבן, כך ששני מלבנים יוכלו להתברג יחד ליצירת צורת X. השתמש במערך זה כדי להחזיק את רשת הפוליפרופילן בגודל נקבוביות בגודל 250 מיקרומטר חתוכה לריבועים בגודל שישה על שישה סנטימטרים. בארון זרימת האוויר הלמינרי, הוסיפו חצי מדיה בסיסית סטרילית של MS עם ויטמינים בתוספת 1.5% סוכרוז לכל קופסה כדי להגיע לקצה התחתון של רשת הפוליפרופילן.

זרעו את הזרעים המעוקרים על פני השטח על הרשת באופן הידרופוני, וגדלו אותם במשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים, מעבירים את השתילים לרשת בגודל נקבוביות של 500 מיקרומטר, ומאפשרים להם לגדול במשך יומיים. לאחר מכן, העבירו את השתילים לאמצעי הבקרה ולמדיה הניסיונית, ותנו לזרעים לגדול במשך שבעה ימים.

הוסף 10 עד 20 מיליליטר של מי ברז מסוננים autoclaved לצלחת Petri. מוציאים בעדינות את השתילים מהרשת של 500 מיקרומטר. בעזרת מברשת אומנות עגולה, מורחים שורשים דמויי צמחים בצלחת המלאה במים וטובלים אותם במים.

הטו מעט את הצלחת כדי להסיר את המים. סרקו או צלמו את לוחות הפטרי הללו בהתאם. מדוד את ארכיטקטורת מערכת הבסיס, או תכונות RSA, באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי, ולאחר מכן פתח את הקובץ לניתוח.

לאחר קביעת קנה המידה, השתמשו בכלי קו ישר ליצירת בחירת קו המתווה את סרגל קנה המידה. סיים חלוקה לרמות על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, לחיצה כפולה או לחיצה בתיבה בהתחלה. כדי למדוד את אורך סרגל קנה המידה הידוע בפיקסלים, לחץ על נתח ולאחר מכן על מדידה בסרגל הכלים.

רשום לעצמך את אורך הפיקסלים. פתח את תיבת הדו-שיח הגדרת קנה מידה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה הגדרת קנה מידה בכרטיסיה ניתוח. בדוק את אורך הפיקסלים במרחק בשדה פיקסלים.

לאחר מכן, הזן את ערך סרגל קנה המידה בשדה המרחק הידוע והגדר את יחידת האורך כמילימטרים. נעל את קנה המידה עבור תמונה מסוימת זו על ידי לחיצה על אישור. השתמש בכלי קו מקוטע לבחירת שורה המתווה את אורך השורש.

לאחר סיום חלוקה לרמות, התאם את בחירת הקו על-ידי לחיצה וגרירה של נקודות האחיזה הקטנות בשחור-לבן לאורך המתאר. תחת כרטיסיית הניתוח של ImageJ, בחר בפקודת המדידה וכמת את אורך השורש. העבר את הנתונים הנמדדים לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה ימנית על חלון התוצאות, בחירה באפשרות העתק הכל מהתפריט הקופץ, מעבר לגיליון האלקטרוני והדבקת הנתונים.

למדידה וחישוב של תכונות RSA, מדדו את אורך השורש הראשוני בין צומת ההיפוקוטיל לסוף קצות השורש. לאחר מכן מדדו את השורשים הרוחביים מסדר ראשון, או אורך LR מדרגה אחת, ושורשים רוחביים מסדר שני, או אורך LR בשתי מעלות. לאחר שתסיים, העתק והדבק את כל המדידות לתוך הגיליון האלקטרוני.

מדוד ורשום את אזור ההסתעפות של השורש הראשוני, או BZPR, המשתרע על פני נקודת היציאה הצידית הראשונה של השורש הצידי עד לנקודת היציאה האחרונה של השורש הצידי. באופן דומה, רשום את מספר השורשים הרוחביים שמקורם בגבול ה- BZPR. לאחר מכן, למדוד את האורך הממוצע של שורשים לרוחב מסדר ראשון גבוה יותר.

גוזרים את האורך הממוצע של השורשים הצדיים הראשוניים על ידי חלוקת האורך הכולל של השורשים הצדיים הראשוניים במספר הכולל של שורשים רוחביים ראשוניים. לאחר מכן כדי למדוד את האורך הממוצע של השורשים הרוחביים מסדר שני, חשב את האורך הממוצע של השורשים הרוחביים המשניים על ידי חלוקת האורך הכולל של השורשים הרוחביים המשניים במספר הכולל של שורשים רוחביים משניים. מדוד את צפיפות השורש הצידי הראשוני על ידי חלוקת מספר השורשים הרוחביים הראשוניים באורך ה- BZPR.

לאחר מכן, מדדו את אזור ההסתעפות של שורשים צדדיים בודדים וחשבו את צפיפות השורשים הצידיים המשניים על ידי חלוקת מספר השורשים הצדיים המשניים באורך אזורי ההסתעפות של אורכי שורשים רוחביים מסדר שני. לאחר שתסיים, מדוד את אורך השורש הכולל, או TRL. זהו המצרף של שורשים ראשוניים ואורכי שורשים רוחביים ראשוניים ומשניים.

המערכת ההידרופונית ששימשה בניסוי זה פעלה היטב, ומשקפת את הפנוטיפ המנוגד לכאורה בתנאים של מחסור בפוספט אנאורגני ובתנאים מספיקים. תכונות RSA שונות נותחו תחת משטרי פוספט אנאורגניים מנוגדים בתנאים הידרופוניים. הטיפול במחסור בפוספט אנאורגני עורר פנוטיפ שורש המציג RSA קצר יותר, רדוד יותר ומסועף פחות, בהשוואה למצב הפוספט האי-אורגני.

אורך השורש הראשוני נחלש משמעותית במצב של מחסור בפוספט אנאורגני. עלייה משמעותית ומהירה באורך השורש הראשוני בנוכחות פוספט אנאורגני 1.25 מילימולרי או אמצעי בקרה הצביעה על יעילות המערכת ההידרופונית, ושיקפה את השינויים הפיזיולוגיים כראוי. אזור ההסתעפות צומצם משמעותית במצב של מחסור בפוספט אנאורגני.

אורכו הממוצע של השורש הצידי הראשוני הופחת משמעותית במצב של חוסר פאי. אורך השורש המשני הצדדי הממוצע הופחת באופן דומה עקב מצב המחסור בפוספט, אולם הוא היה נמוך יותר בכמות מאורך השורש הצידי הראשוני הממוצע. מספר השורשים הצדיים הראשוניים והמשניים ירד מאוד במצב של מחסור בפוספט, בהשוואה לקבוצת הביקורת, 1.25 מילימולר במצב פוספט אנאורגני.

צפיפות השורש הצידית הראשונית לא השתנתה במצב של מחסור בפוספט, יחסית לתנאי הביקורת, 1.25 מילימולר פוספט אנאורגני. צפיפות השורשים הצידית המשנית לא הראתה שינוי משמעותי, דבר המצביע על חשיבותה של צפיפות השורשים הצידית להשגת תובנה לגבי פלסטיות RSA. הוצאתי בעדינות שתילים מהרשת בעזרת פינצטה.

אני מורחת שורשים בפלטה מלאה במים בעזרת מברשת עגולה, את כל השורשים הראשוניים, ומורחת ישר, פורשת שורשים רוחביים בצורה סימטרית, מורחת שורשים רוחביים מסדר שני המחוברים לשורשים רוחביים מסדר ראשון. שיטה דומה ניתן להשתמש כדי לחשב את שטח פיח של קצות צמח Arabidopsis. ניתן לפזר את עלי Arabidopsis על הצלחת השנייה ולאחר מכן ללכוד תמונה ולנתח באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי כדי לקבוע את אזור הפיח.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לענות על כל שאלה לגבי השפעת הסביבה על פלסטיות מערכת השורש.