זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור אנטיגנים הנמצאים על פני התא של סוגי תאים שונים כדי למצוא אנטיגנים ספציפיים לסוג התא או הרקמה הזה. הטכניקה שאנו מציגים כאן מאפשרת העשרה של חלבוני קרום התא מתוך ליזאט של תא שלם, בסופו של דבר לניתוח על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה. אז יישום ספציפי אחד של פרוטוקול זה הוא ליישם אותו על תאי גידול כדי לחפש אנטיגנים הנמצאים על פני השטח של אותם תאים סרטניים ולא תאים נורמליים שיכולים לשמש כמטרות חדשות לאימונותרפיה של סרטן.

דבר אחד שיש לציין לגבי פרוטוקול זה הוא שיכול להיות חשוב לייעל את קלט הדגימה שלך לניסוי המעניין שלך. לכן ייתכן שיידרשו מספר איטרציות או טיטרציות כדי למצוא את התנאים האופטימליים. אז מי שידגים את ההליך יהיה אקול נאיק, מומחה זוטר מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל, הסר את כדור התא הקפוא המסומן בביוטין ממינוס 80 מעלות צלזיוס והפשיר אותו על קרח. הוסף 500 מיקרוליטר של 2X Lysis Buffer לגלולה, ערבב היטב ומערבל במרץ במשך 30 שניות. סוניקציה של הליזאט של התא על קרח, וצנטריפוגה של הליזאט ב-17, 200 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את כל הפסולת שנותרה.

בזמן שהליזאט צנטריפוגה, הוסף 100 מיקרוליטר של חרוזי שרף NeutrAvidin Agarose לעמוד סינון המחובר לסעפת הוואקום. מרחו ואקום עדין ושטפו את החרוזים על ידי הזרמת 3 מיליליטר של Wash Buffer 1 מעליהם. הסר את עמוד הסינון מסעפת הוואקום, מכסה את התחתית והוסף את ליזט התא המובהר לעמוד עם החרוזים.

מכסים את החלק העליון של העמוד ודוגרים את הליזאט עם החרוזים על רוטור מקצה לקצה למשך 120 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הדגירה של הליזאט, הנח את עמוד הסינון בחזרה על סעפת הוואקום, והחל ואקום עדין. שטפו את החרוזים על ידי הזרמת חמישה מיליליטר של Wash Buffer 1 מעליהם.

חזור על שלב הכביסה עם חמישה מיליליטר של Wash Buffer 2 ו-Wash Buffer 3. לאחר שמאגר הכביסה הסופי זרם כולו דרך החרוזים, הסר את העמוד מהסעפת. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ליז לחרוזים והעביר אותם לצינור מיקרו צנטריפוגה קושר חלבון נמוך בנפח 1.7 מיליליטר עם פיפטה.

סובב בקצרה את הצינור כדי ליישב את החרוזים והסר 50 מיקרוליטר מהתמיסה. לאחר מכן, הניחו את הצינור על שייקר בלוק חום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בנענוע של 1000 סל"ד. השעו מחדש את הטריפסין המיובש בצינור העיכול מהערכה על ידי הוספת 210 מיקרוליטר של תמיסת ההשעיה ופיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שכל הטריפסין המיובש מושעה מחדש.

בתום הדגירה של החרוזים, הוציאו אותו משייקר בלוק החום והוסיפו לחרוזים 50 מיקרוליטר מתמיסת הטריפסין התלויה. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, נערו ב-500 סל"ד למשך 90 דקות לפחות כדי לעכל את החלבון. לאחר השלמת העיכול, העבירו את התמיסה המכילה את החרוזים לעמוד ספין והכניסו את העמודה לצינור מיקרו צנטריפוגה דל חלבון בנפח 1.7 מיליליטר.

סובב את הצינור כדי להפריד את תמיסת הפפטיד המעוכלת מהחרוזים. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת העצירה כדי לעצור את תגובת העיכול ולהחמיץ את תמיסת הפפטיד. בעזרת מתאם צינור, הנח עמוד התפלה בצינור מיקרו צנטריפוגה קושר חלבון נמוך בנפח 1.7 מיליליטר.

הוסף את כל תמיסת הפפטיד המחומצת לעמודה. סובב את העמודה ב -3, 800 G למשך 3 דקות, כך שהפתרון יזרום דרך העמודה. השלך את הזרימה מכיוון שהפפטידים קשורים כעת לעמודה.

הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת Wash 1 לעמודה, סובב ב -3, 800 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ואז השליך את הזרימה. חזור על שלב הכביסה עם 200 מיקרוליטר תמיסת Wash 2. העבירו את העמודה לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש עם תווית של 1.7 מיליליטר דל חלבון.

הוסף 100 מיקרוליטר תמיסת אלוטה לעמוד וסובב ב -3, 800 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הפפטידים נפלטים כעת מהעמוד לתוך הצינור. מניחים את תמיסת הפפטיד בצנטריפוגת ואקום ומניחים לה להתייבש למשך הלילה.

הניחו את הפפטידים המיובשים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לכמת ולנתח בספקטרומטר המסה. ניתוח פרוטאום בוצע כדי לאפיין את חלבוני פני התא המועשרים באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית. ריכוז פפטיד סופי של כ-630 ננוגרם למיקרוליטר התקבל על סמך בדיקת כימות הפפטיד הקולורימטרי.

נתוני ספקטרומטריית מסה שנותחו באמצעות MaxQuant וניתוח מערכי נתונים לאחר מכן של חלבוני פני התא הניבו 601 חלבוני שטח בדגימה, כ-27% מכלל החלבונים שזוהו. תרשים המייצג את התפלגות החלבון המזוהה בציון אנדרומדה מוצג כאן, ותרשים הפיזור ממחיש את המתאם בין דגימה לדגימה. עלילות הקופסה תיארו את וריאציה של ריצה לריצה.

ותרשים ההתפלגות מבחינת מדגם ייצג את איכות הנתונים של שכפולים. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא היכן נמצאים הפפטידים בכל שלב. בתחילה, הם בתמיסה, לאחר מכן, הם קשורים לחרוזים עד העיכול, ואז הם קשורים לעמוד המלח עד שהם מתפוגגים לבסוף.

בעקבות הליך זה, ישנן דרכים שונות לאמת קומץ מהחלבונים שזוהו, כגון ציטומטריית זרימה ממוקדת ופרוטאומיקה ממוקדת. זה ייתן מידע מפורט יותר על רמות הביטוי של חלבונים אלה על פני הדגימה.