Name: זרימת עבודה של לכידת פני התא לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: למדו טכניקת עשרת פני התא לכימות ללא תוויות של פרוטאומים פני תאיים מתאים שונים. שיטה זו מאפשרת זיהוי אנטיגנים ספציפיים לתאי גידול ומטרות חדשות לתרפיות אימונולוגיות בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר כמאל מנדאל (המחלקה לרפואת מעבדה, UCSF) על העזרה בהקמת ריצת LC-MS/MS, ל-Deeptarup Biswas (BSBE, IIT Bombay) על העזרה בניתוח הנתונים, ולד"ר אודרי ריבס (המחלקה לרפואת מעבדה, UCSF) על העזרה בניתוח הנתונים. עבודה קשורה במעבדת A.P.W. נתמכת על ידי NIH R01 CA226851 ו-Chan Zuckerberg Biohub. איור 1 ואיור 2B נעשו באמצעות BioRender.com.

הערה: תאי פלסמציטומה AMO1 שימשו לניסוי פרוטאום זה על פני התא. ניתן להשתמש באותו פרוטוקול גם עבור סוגי תאים אחרים, כולל מגוון רחב של קווי תאים מתלים ודבקים9, כמו גם סוגים שונים של דגימות ראשוניות10. עם זאת, מספרי תאים (חומר מוצא לניסוי) בדרך כלל צריכים להיות מותאמים לכיסוי פרוטאום שווה ערך. לפרטים הקשורים לחומרים וציוד, עיין בטבלת החומרים. לפרטים הקשורים למאגרים ותמיסות ריאגנטים והרכבם, ראה טבלה 1.
1. תיוג פני התא עם ביוטין
<ol>
	<li>ספרו את התאים המתורבתים והגלולה כ-3.5 ×-107 תאים חיים על ידי צנטריפוגה (5 דקות ב-500 × גרם, 24 מעלות צלזיוס). 
	הערה: תאי הפלסמציטומה AMO1 הועברו עם מדיה טרייה כל 3 ימים לפני הקציר.</li>
	<li>שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה על ידי הוספת 1 מ"ל של מי מלח קרים (4 מעלות צלזיוס) של Dulbecco עם חוצץ פוספט (D-PBS) (ללא סידן, ללא מגנזיום), וצנרת בעדינות למעלה ולמטה.</li>
	<li>גלולה את התאים שוב (כמו בשלב 1.1) וחזור על שלב הכביסה (שלב 1.2) פעם נוספת (שתי כביסות בסך הכל).</li>
	<li>לאחר הכביסה השנייה, גלולה את התאים (כמו בשלב 1.1) והשעתה אותם ב-990 מיקרוליטר של D-PBS קר על ידי פיפטינג עדין.</li>
	<li>הכן תמיסת מלאי של 160 מ"מ נתרן מטאפריודט (NaIO4) מראש. מפצלים ל-50 מיקרוליטר ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים. הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת נתרן מטאפריודט של 160 מ"מ לתרחיף התא בשלב 1.4, ערבב היטב ודגר על רוטור מקצה לקצה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר השלמת הדגירה, גלו את התאים (כמו בשלב 1.1), שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש ב-1 מ"ל של D-PBS קר. חזור על שלב כביסה זה פעמיים (שלוש כביסות בסך הכל). לאחר הכביסה השלישית, השעו מחדש את התאים ב -989 מיקרוליטר של D-PBS.</li>
	<li>הכינו מראש תמיסת מלאי של 100 מ"מ ביוציטין הידרזיד. מפצלים ל-50 מיקרוליטר ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים. הוסף 1 מיקרוליטר של אנילין ו-10 מיקרוליטר של 100 מ"מ ביוציטין הידרזיד לתרחיף התא בשלב 1.6, ערבב היטב ודגירה על רוטור מקצה לקצה למשך 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר השלמת הדגירה, גלו את התאים (כמו בשלב 1.1), שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש ב-1 מ"ל של D-PBS קר. חזור על שלב כביסה זה פעמיים (שלוש כביסות בסך הכל).</li>
	<li>לאחר השטיפה השלישית, שאפו את הסופרנטנט בזהירות עם פיפט, והקפיאו את כדור התא על ידי הנחת הצינור בנוזל N2. הנח את הגלולה הקפואה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס, עד שהיא מוכנה להמשיך עם ליזה ומשיכה.</li>
</ol>
2. ליזיס תאים ומשיכת ביוטין
<ol>
	<li>הפשירו את כדור התא הקפוא על קרח.</li>
	<li>הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה פי 2 לגלולה, ערבב היטב ומערבולת למשך 30 שניות 
	הערה: ייתכן שיידרשו פיפטינג ומערבולת נמרצים כדי ליז את הגלולה במלואה. פסולת בלתי מסיסה (כלומר, DNA) מקובלת, מכיוון שהיא מוסרת בשלב הסוניקציה שלאחר מכן.</li>
	<li>סוניקציה של התא ליזאט על קרח (שלוש התפרצויות, 20 שניות כל אחת, 60% מחזור עבודה).</li>
	<li>צנטריפוגה את הליזאט כדי לגלול את כל הפסולת שנותרה (10 דקות ב-17,200 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>בזמן שהליזאט צנטריפוגה, הוסף 100 מיקרוליטר של חרוזי שרף אגרוז נויטרווידין לעמוד סינון. חבר את העמוד לסעפת ואקום, החל ואקום עדין ושטוף את החרוזים על ידי הזרמת 3 מ"ל של מאגר כביסה 1 מעליהם.</li>
	<li>הסר את עמוד הסינון מסעפת הוואקום, מכסה את התחתית והוסף את ליזט התא המובהר לעמוד עם החרוזים. מכסים את החלק העליון של העמוד, ודוגרים את הליזאט עם החרוזים על רוטור מקצה לקצה למשך 120 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס><.
	הערה: בעת מכסה את החלק העליון של העמוד, החזק בחוזקה את המכסה התחתון במקומו, אחרת הוא עלול להיעקר וליזאט התא עלול לדלוף במהלך הדגירה.</li>
	<li>הכן מאגרי כביסה 1, 2 ו-3 (כ-5 מ"ל מכל מאגר כביסה לכל דגימה, עיין בטבלה 1), והנח אותם באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לאחר סיום הדגירה של הליזאט, הנח את עמוד הסינון בחזרה על סעפת הוואקום, החל ואקום עדין ושטוף את החרוזים על ידי הזרמת 5 מ"ל של מאגר כביסה 1 מעליהם. 
	הערה: ניתן להשתמש ביותר מ-5 מ"ל של מאגרי הכביסה לכביסה; כביסה נוספת עלולה להפחית את הרקע, כריכה לא ספציפית על החרוזים.</li>
	<li>חזור על שלב הכביסה עם 5 מ"ל של מאגר כביסה 2.</li>
	<li>חזור על שלב הכביסה עם 5 מ"ל של מאגר כביסה 3.</li>
	<li>לאחר שמאגר הכביסה הסופי זרם כולו דרך החרוזים, הסר את העמוד מהסעפת. הוסף לחרוזים 100 מיקרוליטר של תמיסת "ליז" והעביר אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה קושר חלבון נמוך של 1.7 מ"ל עם פיפט. סובב בקצרה את הצינור כדי ליישב את החרוזים, והסר 50 מיקרוליטר מהתמיסה מבלי להפריע לחרוזים המיושבים. 
	הערה: הריאגנטים בשלב זה ובכל השלבים הבאים משתמשים בערכת הכנת דגימות פרוטאומיקה זמינה מסחרית. הערכה מספקת זרימת עבודה אופטימלית ופשוטה להכנת דגימות. עם זאת, ניתן לבצע שלבים אלה גם ללא תלות בערכה, תוך שימוש בזרימת עבודה מסורתית של פרוטאומיקה כמתואר ב-Verma et al.9. אם החרוזים נשארים דבוקים לצד או לתחתית העמוד, אפשר לחרוזים שהועברו לצינור להתייצב, והשתמש בתמיסת "ליז" נוספת בצינור כדי להעביר את החרוזים הנותרים.</li>
	<li>מניחים את הצינור על גוש חום/שייקר בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, ומנערים בחום של 1,000 סל"ד למשך 10 דקות 
	הערה: שלב זה נדרש להפחתה ואלקילציה של שאריות ציסטאין לפני העיכול.</li>
</ol>
3. עיכול חלבונים
<ol>
	<li>השעו מחדש את הטריפסין המיובש (שפופרת "עיכול" בערכה, המאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס) על ידי הוספת 210 מיקרוליטר של תמיסת "השעיה". שלח את התמיסה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שכל הטריפסין המיובש מושעה מחדש.</li>
	<li>לאחר השלמת הדגירה, הוסף לחרוזים 50 מיקרוליטר מתמיסת הטריפסין התלויה. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, נערו במהירות של 500 סל"ד למשך 90 דקות לפחות כדי לעכל את החלבון.</li>
	<li>לאחר השלמת העיכול, העבירו את התמיסה המכילה את החרוזים לעמוד ספין, והכניסו את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בנפח 1.7 מ"ל. סובב את הצינור (500 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר [RT]) כדי להפריד את תמיסת הפפטיד המעוכלת מהחרוזים. 
	הערה: בשלב זה, ניתן לבצע טיפול ב-PNGase על החרוזים לאחר הפרדתם מתמיסת הפפטיד, כדי לחסל שברי פפטיד ביוטיניליים מחרוזי הסטרפטווידין. לאחר מכן ניתן להעביר את דגימת הפפטיד הזו קדימה לאורך שארית זרימת העבודה כדגימת פפטיד נפרדת ומשנית שניתן לנתח ולהשוות עם הדגימה הראשונית מטריפסיניזציה על חרוזים. גישת PNGase עשויה לספק נתונים משלימים לטריפסיניזציה על חרוזים, בהתחשב בספציפיות הנוספת עבור אספרגינים N-גליקוזיליים שנלכדו על סמך שינוי שרשרת צד הניתנת לזיהוי MS12. עם זאת, החיסרון של גישת פליטה רציפה זו הוא הדרישה לזמן כפול מזמן מכשיר ספקטרומטר המסה לניתוח דגימה.</li>
	<li>הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת "עצור" כדי לעצור את תגובת העיכול ולהחמיץ את תמיסת הפפטיד.</li>
</ol>
4. התפלת פפטידים
<ol>
	<li>בעזרת מתאם צינור, הנח עמוד התפלה בצינור מיקרו-צנטריפוגה קושר חלבון נמוך בנפח 1.7 מ"ל. הוסף את כל תמיסת הפפטיד המחומצת לעמודה. סובב את העמודה (3,800 × גרם למשך 3 דקות) כך שהתמיסה תזרום דרך העמודה. הפפטידים קשורים כעת לעמוד; השליכו את הזרימה.</li>
	<li>הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת "שטיפה 1" לעמודה וסובב (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). השלך את הזרימה.</li>
	<li>הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת "שטיפה 2" לעמודה וסובב (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). השלך את הזרימה.</li>
	<li>העבירו את העמודה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ומסומן בנפח 1.7 מ"ל עם קושר חלבון נמוך. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת "Elute" לעמודה וסובב (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). הוסף עוד 100 מיקרוליטר של תמיסת "Elute" לעמודה וסובב (3,800 × גרם למשך 3 דקות, RT). הפפטידים נפלטים כעת מהעמוד לתוך הצינור.</li>
	<li>מניחים את תמיסת הפפטיד בצנטריפוגת ואקום ומניחים לה להתייבש למשך הלילה. הנח את הפפטידים המיובשים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לכמות, ונתח על ספקטרומטר המסה.</li>
</ol>
5. השעיה וכימות של פפטידים
<ol>
	<li>השעו מחדש את הפפטידים המיובשים ב-20 מיקרוליטר של ממס A (0.1% חומצה פורמית, 2% אצטוניטריל).</li>
	<li>צנטריפוגה את הפפטידים המרחפים מחדש (17,200 × גרם למשך 10 דקות) כדי לזרוק כל פסולת בלתי מסיסה.</li>
	<li>הכן תקני פפטידים לבדיקת כימות פפטיד קולורימטרי.
	<ol>
		<li>מניחים 5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פפטידים של 1,000 מ"ג/מ"ל בבאר אחת של צלחת של 96 בארות.</li>
		<li>בצע דילול סדרתי בן שבעה שלבים בצלחת עם מים נטולי יונים (DI), כדלקמן, עם 5 מיקרוליטר מכל תקן לבאר: 1,000 מ"ג/מ"ל, 500 מ"ג/מ"ל, 250 מ"ג/מ"ל, 125 מ"ג/מ"ל, 62.5 מ"ג/מ"ל, 31.25 מ"ג/מ"ל ו-15.625 מ"ג/מ"ל. מניחים 5 מיקרוליטר מי DI בבאר שמינית לריק.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הנח 4 מיקרוליטר של מי DI בשלוש בארות נפרדות של צלחת 96 הבארות. הוסף 1 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד המרחפת לכל באר, לנפח כולל של 5 μL. 
	הערה: בעת פיפטינג של תמיסת הפפטיד לכימות, פיפטינג בזהירות מהחלק העליון של התמיסה כדי למנוע הפרעה לפסולת שקועה.</li>
	<li>חשב כמה מגיב עובד דרוש (45 מיקרוליטר נדרש לבאר). הכן את הנפח הנדרש של מגיב העבודה של הבדיקה הקולורימטרית; מערבולת המגיב העובד כדי להבטיח ערבוב נכון של הרכיבים.</li>
	<li>הוסף 45 מיקרוליטר של המגיב העובד לכל אחת מבארות הסטנדרט והדגימה. 
	הערה: הפוך את התקנים לכפולים, והשתמש בצנרת רב-ערוצית כדי להבטיח הבדל מינימלי בתזמון הוספת המגיב לבארות.</li>
	<li>מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
	<li>נתח את הצלחת בקורא צלחות אוטומטי. השתמש בערכי הספיגה שנרשמו עבור הדגימות הסטנדרטיות כדי ליצור עקומה סטנדרטית ליניארית. קבע את המשוואה של העקומה הסטנדרטית וערך R2. אם ערך R2 סביר (≥0.95), השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי לקבוע את ריכוז הפפטידים המרחפים, תוך התחשבות בדילול פי חמישה בלוחית הבדיקה הקולורימטרית.</li>
</ol>
6. ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) של הפפטידים המעוכלים
<ol>
	<li>התאם את ריכוז דגימות הפפטיד ל-0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר על ידי הוספת ממס A, והעביר 10 מיקרוליטר לתוך צינור קושר חלבון נמוך של 0.6 מ"ל.</li>
	<li>הנח את הצינור בדגימה האוטומטית של LC.</li>
	<li>הגדר את הפרמטרים LC ו-MS/MS, לפי <מחלקה חזקה="xfig">איור 2 ו-<מחלקה חזקה="xfig">איור 3.</li>
	<li>הזרקו 5 מיקרוליטר (1 מיקרוגרם) של דגימת הפפטיד לתוך מערך LC-MS/MS לניתוח. 
	הערה: הגדרות LC-MS/MS המוצגות כאן מייצגות רק את האיורים. בהתאם לזמינות מכשירי LC ו-MS, משתמשים יכולים לשנות את ההגדרות עבור שיפוע LC ופרמטרים MS/MS כדי לקבל כיסוי פרוטאום עמוק. עבור מאמר זה, ניתוח נתוני MS בוצע באמצעות MaxQuant https://www.maxquant.org/, ניתוח נתונים משני בוצע באמצעות https://maxquant.net/perseus/ פרסאוס, וניתוח מסלול באמצעות https://reactome.org/.</li>
</ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Aslam, B., Basit, M. B., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%3A+technologies+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Proteomics: technologies and their applications.</a> Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+silico+human+surfaceome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The in silico human surfaceome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 10988-10997 (2018).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+advance+in+tumor+specific+antigens%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22AME+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Research advance in tumor specific antigens: A narrative review.</a> AME Medical Journal. 6, 35(2021).</li>
<li>Li, Y., Qin, H., Ye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+on+enrichment+methods+for+cell+surface+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">An overview on enrichment methods for cell surface proteome profiling.</a> Journal of Separation Science. 43 (1), 292-312 (2020).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nature Biotechnology. 27 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Chandler, K. B., Costello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics+and+glycoproteomics+of+membrane+proteins+and+cell-surface+receptors%3A+present+trends+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Glycomics and glycoproteomics of membrane proteins and cell-surface receptors: present trends and future opportunities.</a> Electrophoresis. 37 (11), 1407-1419 (2016).</li>
<li>Ferguson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surfaceome+of+multiple+myeloma+cells+suggests+potential+immunotherapeutic+strategies+and+protein+markers+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The surfaceome of multiple myeloma cells suggests potential immunotherapeutic strategies and protein markers of drug resistance.</a> Nature Communications. 13 (1), 4121(2022).</li>
<li>Karcini, A., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SKBR3+cell-membrane+proteome+reveals+telltales+of+aberrant+cancer+cell+proliferation+and+targets+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The SKBR3 cell-membrane proteome reveals telltales of aberrant cancer cell proliferation and targets for precision medicine applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10847(2022).</li>
<li>Köhnke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+multiomic+approach+for+identification+of+novel+immunotherapeutic+targets+in+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Integrated multiomic approach for identification of novel immunotherapeutic targets in AML.</a> Biomarker Research. 10 (1), 43(2022).</li>
<li>Verma, A., Kumar, V., Ghantasala, S., Mukherjee, S., Srivastava, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+workflow+of+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics+of+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comprehensive workflow of mass spectrometry-based shotgun proteomics of tissue samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e61786(2021).</li>
<li>Leung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+and+thematic+remodeling+of+the+surfaceome+and+glycoproteome+on+isogenic+cells+transformed+with+driving+proliferative+oncogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Broad and thematic remodeling of the surfaceome and glycoproteome on isogenic cells transformed with driving proliferative oncogenes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 7764-7775 (2020).</li>
<li>Nix, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+proteomics+reveals+CD72+as+a+target+for+in+vitro-evolved+nanobody-based+CAR-T+cells+in+KMT2A%2FMLL1-rearranged+B-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Surface proteomics reveals CD72 as a target for in vitro-evolved nanobody-based CAR-T cells in KMT2A/MLL1-rearranged B-ALL.</a> Cancer Discovery. 11 (8), 2032-2049 (2021).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+cancer+immunotherapy%3A+from+T+cell+basic+science+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).</li>
<li>Hosen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activated+conformation+of+integrin+%CE%B27+is+a+novel+multiple+myeloma-specific+target+for+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The activated conformation of integrin β7 is a novel multiple myeloma-specific target for CAR T cell therapy.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1436-1443 (2017).</li>
<li>Costa, A. F., Campos, D., Reis, C. A., Gomes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glycosylation%3A+A+new+road+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting glycosylation: A new road for cancer drug discovery.</a> Trends in Cancer. 6 (9), 757-766 (2020).</li>
<li>Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+proteomics+in+the+discovery+of+cell-surface+markers+on+stem+cells%3A+Scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface.</a> Proteomics. Clinical Applications. 2 (6), 892-903 (2008).</li>
<li>Itzhak, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometry-based+approach+for+mapping+protein+subcellular+localization+reveals+the+spatial+proteome+of+mouse+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometry-based approach for mapping protein subcellular localization reveals the spatial proteome of mouse primary neurons.</a> Cell Reports. 20 (11), 2706-2718 (2017).</li>
<li>Kirkemo, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+tethered+promiscuous+biotinylators+enable+comparative+small-scale+surface+proteomic+analysis+of+human+extracellular+vesicles+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cell-surface tethered promiscuous biotinylators enable comparative small-scale surface proteomic analysis of human extracellular vesicles and cells.</a> eLife. 11, 73982(2022).</li>
<li>Wojtkiewicz, M., Berg Luecke, L., Kelly, M. I., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+preparation+of+peptides+for+mass+spectrometry+analysis+in+bottom-up+proteomics+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Facile preparation of peptides for mass spectrometry analysis in bottom-up proteomics workflows.</a> Current Protocols. 1 (3), 85(2021).</li>
<li>Välikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+evaluation+of+popular+proteomics+software+workflows+for+label-free+proteome+quantification+and+imputation%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive evaluation of popular proteomics software workflows for label-free proteome quantification and imputation.</a> Briefings in Bioinformatics. 19 (6), 1344-1355 (2018).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PLoS One. 10 (3), 0121314(2015).</li>
<li>Griss, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReactomeGSA-efficient+multi-omics+comparative+pathway+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">ReactomeGSA-efficient multi-omics comparative pathway analysis.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 19 (12), 2115-2125 (2020).</li>
<li>Waas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SurfaceGenie%3A+a+web-based+application+for+prioritizing+cell-type-specific+marker+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SurfaceGenie: a web-based application for prioritizing cell-type-specific marker candidates.</a> Bioinformatics. 36 (11), 3447-3456 (2020).</li>
<li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAPome%3A+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).</li>
<li>van Oostrum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+mouse+B+cell+types+using+surfaceome+proteotype+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Classification of mouse B cell types using surfaceome proteotype maps.</a> Nature Communications. 10 (1), 5734(2019).</li>
<li>Berg Luecke, L., Gundry, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+streptavidin+bead+binding+capacity+to+improve+quality+of+streptavidin-based+enrichment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Assessment of streptavidin bead binding capacity to improve quality of streptavidin-based enrichment studies.</a> Journal of Proteome Research. 20 (2), 1153-1164 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה היא כלי רב עוצמה שאיפשר אפיון בלתי מוטה של אלפי חלבונים לא ידועים בקנה מידה בלתי אפשרי בעבר. גישה זו מאפשרת לנו לזהות ולכמת את החלבונים, כמו גם ללקט מגוון תובנות לגבי יכולות המבנה והאיתות של תאים ורקמות, על ידי אפיון מגוון החלבונים הקיימים בדגימה מסוימת. מעבר לפרופיל חלבון גלובלי בדגימה, ספקטרומטריית מסה מאפשרת לנו לאפיין שינויים שונים לאחר תרגום (PTMs) בחלבונים אלה, ומספקת הצצה עמוקה עוד יותר לשלבי מסלולי האיתות ודינמיקת החלבון שאינם זמינים בעת ניתוח ברמת DNA או RNA1<...

חלבונים משמשים כיחידות הבסיסיות שבאמצעותן מתבצעות רוב הפונקציות התאיות. אפיון המבנה והתפקוד של חלבונים רלוונטיים הוא צעד חיוני להבנת תהליכים ביולוגיים. במהלך העשור האחרון, התקדמות בטכנולוגיית ספקטרומטריית מסה, תוכנות ניתוח ומסדי נתונים אפשרו זיהוי ומדידה מדויקים של חלבונים בקנה מידה רחב של פרוטאום1. ניתן להשתמש בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה במגוון רחב של יישומים, החל מניתוח מדעי בסיסי של מסלולים ביוכימיים, לזיהוי מטרות תרופות חדשות בסביבה תרגומית, ועד לאבחון וניטור מחלות במרפאה2. בעת סינון מטרות תרופות חדשות, אפיון הפרוטאום של פני התא חשוב במיוחד, כאשר למעלה מ-65% מהתרופות האנושיות המאושרות כיום מכוונות לחלבונים3. תחום האימונותרפיה לסרטן מסתמך לחלוטין גם על אנטיגנים ספציפיים לסרטן על פני התא כדי למקד ולחסל באופן ספציפי תאי גידול4. פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה יכולה אפוא לשמש ככלי מבטיח לזיהוי חלבונים חדשים על פני התא לקראת התערבויות טיפוליות.
עם זאת, ישנן מספר מגבלות בעת שימוש בשיטות פרוטאומיקה קונבנציונליות לסקר תאי גידול עבור מטרות חלבון חדשות על פני התא. דאגה עיקרית היא שחלבונים על פני השטח מהווים חלק קטן מאוד מכלל מולקולות החלבון בתא. לכן, שברים של חלבונים אלה מוסווים על ידי שפע גבוה של חלבונים תוך-תאיים בעת ביצוע ניתוח ספקטרומטריית מסה של מחלקת הליזאט5. מגבלה זו מקשה על אפיון מדויק של פרוטאום פני התא עם זרימת עבודה מסורתית של פרוטאומיקה. כדי להתמודד עם אתגר זה, יש צורך לפתח דרכים להעשרת חלבוני פני התא מתוך הליזאט של התא השלם, לפני ניתוח על ספקטרומטר המסה. שיטה אחת כזו כוללת חמצון ותיוג ביוטין של חלבוני פני התא הגליקוזיליים בתאים השלמים, והעשרה לאחר מכן של חלבונים ביוטיניליים אלה מהליזאט עם משיכת נויטרווידין, תהליך שזכה לכינוי "לכידת פני התא"6. מכיוון ש~85% מחלבוני פני התא של יונקים נחשבים לגליקוזילציה7, זה משמש כשיטה יעילה להעשרת פרוטאום פני התא מתוך כל התא ליזאט. מאמר זה מתאר זרימת עבודה שלמה, החל מתאים מתורבתים, של תיוג ביוטין על פני התא, ולאחר מכן הכנת דגימה לניתוח ספקטרומטריית מסה (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1). על פני מספר שכפולים, שיטה זו מספקת כיסוי חזק של פרוטאום פני התא של דגימה מסוימת. שימוש בשיטה זו לאפיון פרוטאום פני התא של תאים גידוליים ובריאים יכול להקל על גילוי אנטיגנים חדשים על פני התא לזיהוי מטרות אימונותרפיות פוטנציאליות8.

<table><tbody><tr><td><ערכות חזקות></חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96X iST ערכת הכנת דוגמאות</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>Proteomics ערכת הכנת דוגמאות. כולל ריאגנטים להפחתה, אלקילציה ועיכול. כלול גם עמודי התפלה וריאגנטים.&nbsp;</td></tr><tr>ערכת כימות <td>פפטיד קולורימטרי כמותי של פירס</td><td>תרמו</td><td>23275</td>.<td> כולל תקני פפטידים ורכיבים של ריאגנטים עובדים.&nbsp;</td></tr><tr><td><ריאגנטים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>פישר</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>Millipore Sigma</td><td>09830-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ביוציטין הידרזיד</td><td>ביוטיום</td><td>90060</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (ללא מלחי סידן ומגנזיום)</td><td>מתקן תרבית תאים UCSF</td><td>CCFAL003-225B01</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>Honeywell</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז ופוספטאז מעכב קוקטייל לשימוש חד פעמי</td><td>תרמו</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>קיבולת גבוהה נויטרווידין אגרוז שרף</td><td>תרמו</td><td>29204</td><td></td></tr><tr><td>מתקן תרבית תאים</td><td>מלוח פוספט</td> UCSF <td>CCFAL001-22J01</td><td></td></tr><tr><td>RIPA מאגר ליזה, 10x</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מטאפריודאט</td><td>אלפא Aesar</td><td>13798</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כתם כחול (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה (דרגת פרוטאומיקה)</td><td>VWR</td><td>M123-1KG</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 אוטומטי תא מונה</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>PrismR מיקרוצנטריפוגה</td><td>Labnet International</td><td>C2500-R-230V</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>VWR</td><td>ברנסון סוניפייר 240</td><td></td></tr><tr><td>ואקום סעפת</td><td></td><td>Promega Promega Vac-Man</td><td></td></tr><tr><td>רועד Heatblock</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>מסובב מקצה לקצה</td><td>Labnet</td><td>אקדח מתכוונן מסובב</td><td></td></tr><tr><td>LC</td><td>Thermo</td><td>Ultimate 3000 HPLC ו-UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus היברידי Quadrapole Orbitrap ספקטרומטר מסה</td><td>תרמו</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט</td><td>Biotek</td><td>Biotek Synergy 2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>רכז ואקום</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אספקה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל חלבון LoBind צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה עמודי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סינון</td><td>Bio-Rad</td><td>7326008</td><td></td></tr><tr><td>עמודי ספין</td><td>תרמו</td><td>ברקוד 69725</td><td></td></tr></tbody></table>

זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

במהלך העשור האחרון, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה אפשרה אפיון מעמיק של מערכות ביולוגיות במגוון רחב של יישומים. פרוטאום פני התא ("surfaceome") במחלות אנושיות הוא בעל עניין משמעותי, שכן חלבוני ממברנת הפלזמה הם המטרה העיקרית של רוב הטיפולים המאושרים קלינית, כמו גם מאפיין מפתח שבאמצעותו ניתן להבחין באופן אבחנתי בין תאים חולים לרקמות בריאות. עם זאת, אפיון ממוקד של חלבוני הממברנה ופני השטח של התא נותר מאתגר, בעיקר בשל המורכבות של ליזטים תאיים, המסווים חלבונים מעניינים על ידי חלבונים אחרים בעלי שפע גבוה. כדי להתגבר על מחסום טכני זה ולהגדיר במדויק את פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים באמצעות פרוטאומיקה של ספקטרומטריית מסה, יש צורך להעשיר את הליזאט של התא לחלבוני פני התא לפני הניתוח על ספקטרומטר המסה. מאמר זה מציג זרימת עבודה מפורטת לתיוג חלבוני פני התא מתאי סרטן, העשרת חלבונים אלה מהליזאט של התא, והכנת דגימה לאחר מכן לניתוח ספקטרומטריית מסה.

בניסוי זה, אפיינו את הפרוטאום של פני השטח של תאי שורת תאים סרטנית על ידי סימון בביוטין של חלבונים ממברנליים שעברו N-גליקוזילציה בתאים שלמים, והעשרה של חלבונים מסומנים אלו מתוך ליזט התא השלם באמצעות pulldown עם neutravidin (איור 1). בנוסף, ביצענו אנליזת פרוטאום באמצעות LC-MS/MS כדי לאפיין את חלבוני פני השטח שהועשרו. בניגוד לאנליזה של פרוטאום תאי שלם, המטרה כאן הייתה לאפיין אך ורק חלבונים מפני השטח של התא. לפיכך, התחלנו עם קלט של 3.5 × 107 תאי plasmacytoma מסוג AMO-1. השגנו...

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה של פרוטאומיקה לאפיון פרוטאום פני התא של סוגי תאים שונים. זרימת עבודה זו כוללת העשרת חלבון על פני התא, הכנת דגימה לאחר מכן, ניתוח באמצעות פלטפורמת LC-MS/MS ועיבוד נתונים עם תוכנה מיוחדת.

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לחקור אנטיגנים הנמצאים על פני התא של סוגי תאים שונים כדי למצוא אנטיגנים ספציפיים לסוג התא או הרקמה הזה. הטכניקה שאנו מציגים כאן מאפשרת העשרה של חלבוני קרום התא מתוך ליזאט של תא שלם, בסופו של דבר לניתוח על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה. אז יישום ספציפי אחד של פרוטוקול זה הוא ליישם אותו על תאי גידול כדי לחפש אנטיגנים הנמצאים על פני השטח של אותם תאים סרטניים ולא תאים נורמליים שיכולים לשמש כמטרות חדשות לאימונותרפיה של סרטן.דבר אחד שיש לציין לגבי פרוטוקול זה הוא שיכול להיות חשוב לייעל את קלט הדגימה שלך לניסוי המעניין שלך. לכן ייתכן שיידרשו מספר איטרציות או טיטרציות כדי למצוא את התנאים האופטימליים. אז מי שידגים את ההליך יהיה אקול נאיק, מומחה זוטר מהמעבדה שלנו.כדי להתחיל, הסר את כדור התא הקפוא המסומן בביוטין ממינוס 80 מעלות צלזיוס והפשיר אותו על קרח. הוסף 500 מיקרוליטר של 2X Lysis Buffer לגלולה, ערבב היטב ומערבל במרץ במשך 30 שניות. סוניקציה של הליזאט של התא על קרח, וצנטריפוגה של הליזאט ב-17, 200 גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול את כל הפסולת שנותרה.בזמן שהליזאט צנטריפוגה, הוסף 100 מיקרוליטר של חרוזי שרף NeutrAvidin Agarose לעמוד סינון המחובר לסעפת הוואקום. מרחו ואקום עדין ושטפו את החרוזים על ידי הזרמת 3 מיליליטר של Wash Buffer 1 מעליהם. הסר את עמוד הסינון מסעפת הוואקום, מכסה את התחתית והוסף את ליזט התא המובהר לעמוד עם החרוזים.מכסים את החלק העליון של העמוד ודוגרים את הליזאט עם החרוזים על רוטור מקצה לקצה למשך 120 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הדגירה של הליזאט, הנח את עמוד הסינון בחזרה על סעפת הוואקום, והחל ואקום עדין. שטפו את החרוזים על ידי הזרמת חמישה מיליליטר של Wash Buffer 1 מעליהם.חזור על שלב הכביסה עם חמישה מיליליטר של Wash Buffer 2 ו-Wash Buffer 3. לאחר שמאגר הכביסה הסופי זרם כולו דרך החרוזים, הסר את העמוד מהסעפת. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ליז לחרוזים והעביר אותם לצינור מיקרו צנטריפוגה קושר חלבון נמוך בנפח 1.7 מיליליטר עם פיפטה.סובב בקצרה את הצינור כדי ליישב את החרוזים והסר 50 מיקרוליטר מהתמיסה. לאחר מכן, הניחו את הצינור על שייקר בלוק חום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בנענוע של 1000 סל"ד. השעו מחדש את הטריפסין המיובש בצינור העיכול מהערכה על ידי הוספת 210 מיקרוליטר של תמיסת ההשעיה ופיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שכל הטריפסין המיובש מושעה מחדש.בתום הדגירה של החרוזים, הוציאו אותו משייקר בלוק החום והוסיפו לחרוזים 50 מיקרוליטר מתמיסת הטריפסין התלויה. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, נערו ב-500 סל"ד למשך 90 דקות לפחות כדי לעכל את החלבון. לאחר השלמת העיכול, העבירו את התמיסה המכילה את החרוזים לעמוד ספין והכניסו את העמודה לצינור מיקרו צנטריפוגה דל חלבון בנפח 1.7 מיליליטר.סובב את הצינור כדי להפריד את תמיסת הפפטיד המעוכלת מהחרוזים. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת העצירה כדי לעצור את תגובת העיכול ולהחמיץ את תמיסת הפפטיד. בעזרת מתאם צינור, הנח עמוד התפלה בצינור מיקרו צנטריפוגה קושר חלבון נמוך בנפח 1.7 מיליליטר.הוסף את כל תמיסת הפפטיד המחומצת לעמודה. סובב את העמודה ב -3, 800 G למשך 3 דקות, כך שהפתרון יזרום דרך העמודה. השלך את הזרימה מכיוון שהפפטידים קשורים כעת לעמודה.הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת Wash 1 לעמודה, סובב ב -3, 800 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ואז השליך את הזרימה. חזור על שלב הכביסה עם 200 מיקרוליטר תמיסת Wash 2. העבירו את העמודה לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש עם תווית של 1.7 מיליליטר דל חלבון.הוסף 100 מיקרוליטר תמיסת אלוטה לעמוד וסובב ב -3, 800 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. הפפטידים נפלטים כעת מהעמוד לתוך הצינור. מניחים את תמיסת הפפטיד בצנטריפוגת ואקום ומניחים לה להתייבש למשך הלילה.הניחו את הפפטידים המיובשים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לכמת ולנתח בספקטרומטר המסה. ניתוח פרוטאום בוצע כדי לאפיין את חלבוני פני התא המועשרים באמצעות ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית. ריכוז פפטיד סופי של כ-630 ננוגרם למיקרוליטר התקבל על סמך בדיקת כימות הפפטיד הקולורימטרי.נתוני ספקטרומטריית מסה שנותחו באמצעות MaxQuant וניתוח מערכי נתונים לאחר מכן של חלבוני פני התא הניבו 601 חלבוני שטח בדגימה, כ-27% מכלל החלבונים שזוהו. תרשים המייצג את התפלגות החלבון המזוהה בציון אנדרומדה מוצג כאן, ותרשים הפיזור ממחיש את המתאם בין דגימה לדגימה. עלילות הקופסה תיארו את וריאציה של ריצה לריצה.ותרשים ההתפלגות מבחינת מדגם ייצג את איכות הנתונים של שכפולים. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא היכן נמצאים הפפטידים בכל שלב. בתחילה, הם בתמיסה, לאחר מכן, הם קשורים לחרוזים עד העיכול, ואז הם קשורים לעמוד המלח עד שהם מתפוגגים לבסוף.בעקבות הליך זה, ישנן דרכים שונות לאמת קומץ מהחלבונים שזוהו, כגון ציטומטריית זרימה ממוקדת ופרוטאומיקה ממוקדת. זה ייתן מידע מפורט יותר על רמות הביטוי של חלבונים אלה על פני הדגימה.

cell-surface-capture-workflow-for-label-free-quantification-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטה פשוטה ספציפי הודגם תיוג פלורסנט וזיהוי מוגברת של חלבונים פני התא ללא צעד חלוקה. שפע דיפרנציאלי חלבונים פני התא נותח באמצעות אלקטרופורזה דו מימדי (2-D) ו Ettan טכנולוגיית ™ DIGE.

Labelling סלקטיבי של חלבונים על פני קרום התא באמצעות CyDye DIGE צבעים פלואוריד מינימלי

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה...

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

חלבונים בתא שטח הם חשובים מבחינה ביולוגית וglycosylated באופן נרחב. אנחנו מציגים כאן גישת glycopeptide ללכוד לsolubilize, להעשיר, וdeglycosylate חלבונים אלה לניתוחי proteomic מבוססים LC-MS קליל.

Glycopeptide לכידת לפרוטאומיקה פני התא

מוצגים הוא עבודה אינפורמטיקה גמישה המאפשרת ניתוח מבוסס תמונת ריבוב של תאים שכותרתו fluorescently. העבודה מכמתת סמנים גרעיניים וcytoplasmic ומחשבה טרנסלוקציה סמן בין תאים אלה. נהלים מסופקים ההפרעות של תאים באמצעות siRNA ומתודולוגיה אמינה לגילוי סמן על ידי immunofluorescence העקיף בפורמטי 96-היטב.

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

תקשורת בין-תאית היא קריטית לשליטה בפעילות פיזיולוגית שונות בתוך ומחוץ לתא. מאמר זה מתאר פרוטוקול למדידת טבע מרחב ובזמן של הפרשות תא בודדות. כדי להשיג זאת, גישה רב תחומית המשלבת משמשת nanoplasmonic ללא תווית חישה עם הדמיה תא חי.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי חלבונים קושרי מולקולות קטנים באמצעות תיוג פוטו-אפיניטי. היתרון בטכניקה זו הוא שקישור ותיוג קוולנטי של חלבוני המטרה מתרחש בסביבה התאית החיה, ומסיר את הסיכון לשיבוש מבנה החלבון המקומי ותנאי הקישור עם ליזיס התאים.

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול לטיהור ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה זיקה (BiCAP). שיטה חדשנית זו מקלה על ספציפיות בידוד ואפיון פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם של כל שני חלבונים אינטראקציה, בעוד למעט האו ם-ומורכבת חלבונים בודדים, כמו גם מתחמי הקים עם שותפים איגוד מתחרות.

ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

למדו טכניקת עשרת פני התא לכימות ללא תוויות של פרוטאומים פני תאיים מתאים שונים. שיטה זו מאפשרת זיהוי אנטיגנים ספציפיים לתאי גידול ומטרות חדשות לתרפיות אימונולוגיות בסרטן.

זרימת עבודה של "לכידת פני התא" לכימות ללא תוויות של פרוטאום פני התא

גלה סרטונים נוספים