בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

הטכניקות המוצגות כאן שימושיות לחקר קהילת הפטריות האנדופיטיות הקשורות לאיברי צמחים שונים. בידוד פטריות אנדופיטיות מאפשר את זיהוין, והוא בעל ערך בטכניקות אחרות כגון נביטה סימביוטית. כדי להתחיל, להכין 8 עד 10 ס"מ תרבית PDA בינוני צלחת פטרי בתוספת שלושה מיליליטר לכל ליטר של אנטיביוטיקה.

בדוק אם יש זיהום על ידי דגירה על צלחות פטרי בינוניות בטמפרטורה של 36 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפני השימוש. למחרת, יש לחטא באופן שטחי שברי צמחים מיכוהטרוטרופיים בריאים בהליך סטנדרטי ולהניח אותם בצלחת פטרי סטרילית. כדי להעריך את היעילות של התפשטות שטחית של דגימות, לחסן כמה טיפות של מים מזוקקים בשימוש במהלך השטיפה האחרונה של הדגימות על PDA.

לאחר מכן, באמצעות אזמל להבה ומלקחיים, מחלקים את הדגימות לחתיכות בעובי 0.2 סנטימטר. חתך את הדגימות כדי להגדיל את שטח הפנים כדי להיות במגע עם המדיום. מניחים חמישה שברים של האיברים התת-קרקעיים בצלחת האנטיביוטיקה בתוספת PDA רחוק ככל האפשר זה מזה מבלי לגעת בשולי הכלים.

אטמו את צלחות הפטרי בסרט נצמד, ואחסנו אותן בחושך בטמפרטורה של 25 עד 27 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. יום לפני הגידול, הכינו צלחות פטרי בקוטר חמישה סנטימטרים בחמישה עד שבעה גרם לליטר מדיום AA, ודגרו על הצלחות בחום של 36 מעלות במשך 24 שעות. כדי לטהר מבודדים פטרייתיים, הבדילו את מושבות לוחות מחשב כף היד לפי צבע, תבנית צמיחה, מרקם ותבנית שוליים.

לאחר מכן תחמו את שולי המושבה בצד התחתון של המנה. זהה גם את המושבות באמצעות קוד. בעזרת קצה של קיסם עץ אוטוקלאבי, מחזירים כמות זעירה של תפטיר משולי מושבת הפטריות המזוהה וחותרים את צלחת ה-AA, תוך יצירת שלושה פסים בסנטימטר אחד זה מזה ומקצוות המנה.

תייג את לוח AA עם הקוד המתאים באמצעות נייר מדבקות ועיפרון. אטמו את הצלחות לפני הדגירה עליהן בחושך בטמפרטורה של 25 עד 27 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. לאחר הדגירה, התבוננו בקפידה בלוחות כדי לזהות קורים עדינים היוצרים מושבות בודדות.

תחמו את שטחן של מושבות בודדות באמצעות סמן קבוע. חותכים חלק מהתווך המכיל את המושבה באמצעות קיסם אוטוקלאבי, ומעבירים את נפח החיתוך למרכז צלחת פטרי PDA חדשה ללא אנטיביוטיקה. לאחר תיוג צלחות הפטרי בקודים של המבודדים, אטמו אותם בסרט נצמד, ושמרו אותם בחושך בטמפרטורה של 25 עד 27 מעלות צלזיוס למשך שבעה עד 14 ימים.

כדי להתחיל בשימור מבודדי הפטרייה בשיטה של קסטלני, הוסף 0.5 מיליליטר מים מזוקקים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר. באמצעות קיסם אוטוקלאב, חותכים 0.5 על 0.5 ס"מ תווך קובואידי משולי התפטיר של מבודדים מטוהרים שכבר גדלו. מניחים ארבע עד שש קוביות בצינורות המיקרוצנטריפוגות עם מים מזוקקים.

אחסנו את הצינורות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך זמן רב ככל שיידרש. בעת הצורך, החזירו קובואיד והניחו אותו במרכז צלחת מחשב כף יד חדשה כדי לגדל מבודד מאוחסן. התחל את שיטת הרכבה tease על ידי הנחת טיפה של כתם Toluidine blue-O על מגלשת זכוכית נקייה.

כתמים שונים יכולים לשמש בטכניקה כזו. בעזרת קיסם אוטוקלאבי, הסירו בזהירות מעט קורים מהמבודד הגדל והניחו אותם בטיפת הכתם. הניחו פתק כיסוי ונתחו אותו תחת מיקרוסקופ אור.

לשיטת הרכבה על סרט הדבקה, הניחו טיפה של כתם כחול כותנה לקטופנול על מגלשת זכוכית נקייה. חותכים רצועה של סרט הדבקה שקוף בגודל שמתאים למגלשת הזכוכית והכתם המרכזי נופל היטב. כוונו את המשטח הדביק של רצועת ההדבקה אל משטח התפטיר, ונסו לאסוף מעט קורים מבלי ללחוץ או לאסוף יותר מדי מהם.

לאחר מכן הדביקו את הסרט למגלשת הזכוכית, וודאו שהכתם בא במגע עם הקורים שנאספו. הניחו טיפת מים מעל הסרט והניחו את חלקת הכיסוי לפני ניתוח המגלשה תחת מיקרוסקופ אור. הצמיחה של קבוצות קטנות של תפטיר פטריות נימה העולה מפנים השברים נצפתה לאחר חמישה ימים של חיסון של שבר איבר הצמח mychoheterotrophic על מדיום PDA.

במהלך שבעה עד 14 ימים של חיסון המבודד המטוהר, נצפתה צמיחה צנטריפוגלית של מושבת מבודד פטרייתי טהור על מחשב כף יד, ויצרה תפטיר מעגלי יחיד. ניתן היה לזהות בקלות זיהומים אפשריים, שפגעו בהומוגניות המושבה בכל הנוגע לצורתה הגדלה, צבעה וייצור הפיגמנטים בתווך. מושבה שבודדה משורשי הפיוזיפורם של הסחלב המיצ'והטרוטרופי, Wullschlaegelia aphylla, הייתה אטומה ללא פיגמנטים מפוזרים או הפרשה בתווך.

המושבה הייתה לבנה עד אפורה בצד העליון, וחומה בצד התחתון. התפטירים היו אוויריים ושופעים, והשוליים היו לא סדירים ואוויריים. למושבה מרקם קטיפתי וטופוגרפיה מקומטת ללא מבנים מקרוסקופיים.

המבנים שלא נראו בקלות בתפטיר הלא מוכתם הוצגו לאחר צביעת התפטיר הפטרייתי בכחול כותנה לקטופנול ובכחול טולוידין, מה שהקל על זיהויים. שיטות הבידוד הפטרייתי המוצגות כאן עשויות להיות מיושמות גם על צמחים ירוקים לזיהוי האנדופיטים הפטרייתיים. הפטריות המבודדות יכולות לשמש בניסויי נביטה סימביוטיים.