Name: בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למד שיטות בידוד ואפיון פטריות אנדופיטיות מצמחים מיקוהטרוטרופיים באמצעות טכניקות תרבית סטריליות ומיקרוסקופיה. פרוטוקולים אלה מאפשרים זיהוי מולקולרי מדויק ושימור לטווח ארוך של הבידודים לצורך מחקרים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למימון של FAPESP (2015/26479-6) ו- CNPq (447453/2014-9). JLSM מודה ל- CNPq על מענקי פרודוקטיביות (303664/2020-7). MPP מודה Capes (מלגת תואר שני, תהליך 88887.600591/2021-00) ו- CNPq.

<ol><li>de Azevedo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Ecologia+Microbiana%22%5BJournal%5D)">Endophytic microorganisms.</a> Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).</li>
<li>Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+endophytic+microbes%3A+endophytism+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Endophytes%22%5BJournal%5D)">An overview of endophytic microbes: endophytism defined.</a> Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).</li>
<li>Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+B+%22Microbial+Root+Endophytes%22">Microbial Root Endophytes</a>. , Springer-Verlag. Berlin. 1-13 (2006).</li>
<li>Smith, S. E., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+SE+%22Mycorrhizal+Symbiosis%22">Mycorrhizal Symbiosis</a>. , Elsevier Science Academic Press. London. (2008).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+and+seedling+establishment+in+orchids%3A+a+complex+of+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+mycorrhiza%3A+implications+of+a+mycophagous+life+style%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li>
<li>Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-mycorrhizal+endophytic+fungi+from+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids.</a> Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).</li>
<li>Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchids+and+their+mycorrhizal+fungi%3A+an+insufficiently+explored+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Mycorrhiza%22%5BJournal%5D)">Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship.</a> Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).</li>
<li>Sun, X., Guo, L. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+fungal+diversity%3A+review+of+traditional+and+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Mycology%22%5BJournal%5D)">Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques.</a> Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).</li>
<li>Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+techniques+for+interpreting+fungal+colonization+in+mycoheterotrophic+plants+tissues+and+symbiotic+germination+of+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63777(2022).</li>
<li>Araújo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAra%C3%BAjo%2C+WL+%22Endophytic+microorganisms%3A+Theoretical+and+Practical+Aspects+of+Isolation+and+Characterization.+1st+ed%22">Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed</a>. 1, Santarém: UFOPA. 257(2014).</li>
<li>de Souza, R. S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+bacterial+and+fungal+communities+assemblages+of+sugarcane+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome.</a> Scientific Reports. 6, 28774(2016).</li>
<li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589(2019).</li>
<li>Araújo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+interactions+between+endophytic+bacteria+and+fungi+isolated+from+leaf+tissues+of+citrus+rootstocks%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks.</a> Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).</li>
<li>Castellani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+researches+on+the+long+viability+and+growth+of+many+pathogenic+fungi+and+some+bacteria+in+sterile+distilled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water.</a> Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).</li>
<li>Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungi+from+orchid+mycorrhizas%5BTitle%5D)+AND+%22Orchid+Biology%3A+Reviews+and+Perspectives%2C+VII%22%5BJournal%5D)">Fungi from orchid mycorrhizas.</a> Orchid Biology: Reviews and Perspectives, VII. , 117-170 (1997).</li>
<li>Freitas, E. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+mycorrhizal+Tulasnella+associated+with+epiphytic+and+rupicolous+orchids+from+the+Brazilian+Atlantic+Forest%2C+including+four+new+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7069(2020).</li>
<li>Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vermiculite+as+a+culture+substrate+greatly+improves+the+viability+of+frozen+cultures+of+ectomycorrhizal+basidiomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Biology%22%5BJournal%5D)">Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes.</a> Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).</li>
<li>Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Araújo, E. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterization+of+mycorrhizal+fungi+isolated+from+neotropical+orchids+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil.</a> Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).</li>
<li>Riddell, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+stained+mycological+preparations+obtained+by+slide+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture.</a> Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).</li>
<li>Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalsh%2C+TJ+%22Larone%27s+Medically+Important+Fungi%3A+A+Guide+to+Identification%22">Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification</a>. , ASM Press. (2018).</li>
<li>Malloch, D. Moulds: Isolation, Cultivation, Identification. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html">http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html</a> (1997).</li>
<li>Smith, P. Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents">https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents</a> (2022).</li>
<li>Senanayake, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+approaches+in+studying+fungi%3A+Collection%2C+examination%2C+isolation%2C+sporulation+and+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Mycosphere%22%5BJournal%5D)">Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation.</a> Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).</li>
<li>Slifkin, M., Cumbie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congo+red+as+a+fluorochrome+for+the+rapid+detection+of+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi.</a> Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).</li>
<li>Raeder, U., Broda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+DNA+from+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of DNA from filamentous fungi.</a> Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).</li>
<li>Martins, M. K., et al. Molecular characterization of endophytic microorganisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartins%2C+MK+%22Endophytic+microorganisms%3A+theoretical+and+practical+aspects+of+isolation+and+characterization.+1st+edition%22">Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition</a>. , Santarém: UFOPA. 189-211 (2014).</li>
<li>Rayner, R. W. A Mycological Colour Chart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRayner%2C+RW+%22Commonwealth+Mycological+Institute%22">Commonwealth Mycological Institute</a>. , (1970).</li>
<li>Kornerup, A., Wanscher, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornerup%2C+A+%22Methuen+Handbook+of+Colour.+Methuen+handbook+of+colour%22">Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour</a>. , Methuen & Co. Ltd. London. (1967).</li>
<li>Ridgway, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRidgway%2C+R+%22Color+Standards+and+Color+Nomenclature%22">Color Standards and Color Nomenclature</a>. , Washington, DC. Published by the author (1912).</li>
<li>McGinnis, M. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcGinnis%2C+MR+%22Laboratory+Handbook+of+Medical+Mycology%22">Laboratory Handbook of Medical Mycology</a>. , Elsevier Science. (2012).</li>
<li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Introduction+to+Fungi%22">Introduction to Fungi</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue%3A+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).</li>
<li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+some+preservation+techniques+for+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+British+Mycological+Society%22%5BJournal%5D)">A comparison of some preservation techniques for fungi.</a> Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).</li>
<li>Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decision-based+key+to+determine+the+most+appropriate+protocol+for+the+preservation+of+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).</li>
<li>Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+and+preservation+of+ectomycorrhizal+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Mycorrhiza%22%5BJournal%5D)">Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).</li>
<li>Zettler, L. W., Corey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+mycorrhizal+fungi%3A+isolation+and+identification+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Orchid+Propagation%3A+From+Laboratories+to+Greenhouses-Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).</li>
<li>Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+factors+affecting+the+reproducibility+of+micro-volume+DNA+mass+quantification+in+Nanodrop+2000+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22Optik%22%5BJournal%5D)">The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer.</a> Optik. 145, 555-560 (2017).</li>
<li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li>
<li>Schoch, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ribosomal+internal+transcribed+spacer+%28ITS%29+region+as+a+universal+DNA+barcode+marker+for+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).</li>
<li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+and+direct+sequencing+of+fungal+ribosomal+RNA+genes+for+phylogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Protocols%3A+A+Guide+to+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints%3A+biological+and+methodological+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+technologies-the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sequencing technologies-the next generation.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (1), 31-46 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף ואין ניגוד עניינים.

ההתפשטות השטחית של דגימות צמחים היא אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול המוצג. רצוי מאוד שלא יהיה זיהום בכלי מחשב כף היד עם טיפות מהשטיפה האחרונה. חיידקים נצפים לעתים קרובות כמזהמים בצלחות הבידוד, בדרך כלל יותר מאשר פטריות נבגים הנישאות באוויר, בהתחשב בכך שחיידקים אנדופיטיים נפוצים גם ברקמות צמחים 3,11. לכן, תוספת של אנטיביוטיקה במדיום התרבות בעת התקנת שברי איברים הוא חיוני. תוצאות טובות יותר מושגות כאשר משלבים סוגים שונים של אנטיביוטיקה, והתוצאה היא ספקטרום רחב ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

פטריות אנדופיטיות הן, מעצם הגדרתן, אלה המאכלסות את פנים איברי הצמח ורקמותיהן בזיהומים לא בולטים (כלומר, מבלי לגרום נזק לפונדקאי שלהן)1,2. פטריות אלה יכולות לקיים אינטראקציה ניטרלית או מועילה עם צמחים מארחים, עשויות להעניק עמידות לפתוגנים ולתנאי סביבה שליליים, ועשויות לתרום לסינתזה של תרכובות מועילות לצמח (למשל, גורמי גדילה ופיטוהורמונים אחרים)1,3. אנדופיטים מיקוריזים הם פטריות המקימות קשרים מיקוריזליים עם הצמח, ולוקחות חלק בהעברת חומרים מזינים4. ב Orchidaceae, האינטראקציה עם אנדופיטים mycorrhizal היא בסיסית נביטת זרעים ברוב המכריע של המינים, והתבססות שתילים בכל הצמחים במשפחה5. בהקשרים כאלה, סחלבים מיקוהטרוטרופיים מייצגים מקרה של תלות מוחלטת בבני זוגם המיקוריזליים, שכן הם תלויים בחומרים מזינים מינרליים ובהעברת תרכובות פחמן על ידי פטריות אלה במהלך כל מחזור החיים שלהם6. לכן, בידוד וזיהוי של שיוך פטריות הוא בסיס בסיסי בעת חקירת אסטרטגיות חיים mycoheterotrophic. יתר על כן, מעט ידוע על תפקידם של אנדופיטים פטרייתיים בצמחים מיקוהטרוטרופיים או אפילו על המגוון האמיתי של פטריות אלה 7,8.
חקירת פטריות אנדופיטיות יכולה להתבצע באמצעות טכניקות שונות, המתוארות באופן מסורתי כבלתי תלויות תרבית או תלויות תרבית, למשל: (א) תצפית ישירה, (ב) בידוד פטרייתי וזיהוי מורפולוגי ו/או מולקולרי, ו-(ג) מיצוי דנ"א כולל של רקמות צמחים וזיהוי מולקולרי9. בתצפית ישירה (a), פטריות אנדופיטיות עשויות להיחקר בעודן בפנים תאי צמחים ורקמות על ידי מיקרוסקופ אור או אלקטרונים9, כפי שפרוטוקולי מיקרוסקופיה שונים מפורטים על ידי Pena-Passos et al.10. בשיטות בידוד (b), אנדופיטים פטרייתיים יכולים להיות מאופיינים על פי מושבותיהם, קוריהם ומורפולוגיה של מבנה הרבייה או ההתנגדות שלהם. כמו כן, באמצעות טכניקות בידוד, ניתן לבצע זיהוי מולקולרי של מבודדים באמצעות מיצוי DNA, הגברה של רצפי זיהוי מולקולריים (ברקודים או טביעות אצבע), וריצוף11. הטכניקה האחרונה (c) מאפשרת זיהוי מולקולרי של פטריות אנדופיטיות לכל מיצוי DNA בפנים רקמות הצמח (metabarcoding), ולאחר מכן הכנת ספרייה וריצוף12.
יתר על כן, מבודדים פטרייתיים עשויים להיות מיושמים בניסויי נביטה סימביוטיים, באמצעות זרעים מסחלבים אוטוטרופיים או מיקוהטרוטרופיים. דוגמה ליישום כזה היא החקירה שנערכה על ידי Sisti et al.13, המתארת את הנביטה ואת השלבים הראשונים של התפתחות פרוטוקורם ב- Pogoniopsis schenckii, סחלב מיקוהטרוטרופי, בשיתוף עם חלק מהמבודדים שלו, הכוללים פטריות אנדופיטיות שאינן מיקוריזליות. פרוטוקול הנביטה הסימביוטי היישומי מפורט ומוצג בסרטון של Pena-Passos et al.10. בידוד פטריות בשיתוף עם איברי צמח שונים מאפשר חקירה מגוונת המתמקדת באופי יחסי הגומלין בין צמח לפטריות (למשל, להבין היבטים אקולוגיים או פיזיולוגיים של הקשר, כמו גם חקירת העברת חומרי מזון מפטריות לצמח)9.
המתודולוגיות המוצגות בסעיף 1 מבוססות על אוסף של דגימות איברים תת-קרקעיים, שכן איברים אלה מציגים את הקשיים הרבים ביותר באיסוף, והם בעלי עניין רב מכיוון שהאנדופיטים מיקוריזים מאכלסים אותם. עם זאת, שני הפרוטוקולים הכלולים (שלבים 1.1 ו-1.2) עשויים להיות מיושמים על איברי צמח מיקוהטרוטרופיים אחרים (למשל, קני שורש, גבעולי פרחים ופירות). מתודולוגיית האיסוף המתוארת בשלב 1.1 מיועדת לבידוד פטריות אנדופיטיות (סעיף 2) לאפיון מורפולוגי (סעיפים 4 ו-5) ו/או מיצוי DNA כולל לזיהוי מבודד (סעיף 6). מצד שני, מתודולוגיית האיסוף המתוארת בשלב 1.2 מוקצית באופן בלעדי למיצוי DNA כולל של רקמות צמחים עבור טכניקות metabarcoding (סעיף 7). בסעיף 3 מוצגות ארבע שיטות לאחסון ושימור פטריות נימה, שתיים לאחסון לטווח קצר (3-6 חודשים) והשתיים האחרות מתאימות לאחסון לטווח ארוך (&gt; שנה). האפיון המורפולוגי (סעיפים 4 ו-5) עשוי להיות קשור לזיהוי מולקולרי כדי לחזק אותו ולספק מידע חשוב על מאקרו פטרייתי ומיקרומורפולוגיה. איור 1 מסכם את המתודולוגיות הקולקטיביות שתוארו להלן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg"> איור 1: סיכום סכמטי של השיטות המוצגות. איסוף צמחים ובידוד פטריות, שימור וזיהוי מולקולרי על ידי מתודולוגיות תלויות תרבות ובלתי תלויות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>סרט</td><td></td><td></td> דבק <td>(מכל חברה, להרכבת סרט דבק בניתוחים מיקרומורפולוגיים)</td></tr> <tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5354</td> <td>(להתקנת שברי צמחים; ניתן להשתמש באנטיביוטיקה אחרת - בדוק שלב 2.2.1)</td></tr> <tr><td>אוטוקלאב</td><td></td><td></td> <td>(מכל חברה, לעיקור חומרים בשלבים רבים)</td></tr> <tr><td>אגר בקטריולוגי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A1296</td> <td>(לשלבים רבים)</td></tr> <tr><td>פתרונות C1, C2, C3, C4, C5 ו-C6</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td> <td>(נרכש עם ערכת DNeasy PowerSoil)</td></tr> <tr><td>צנטריפוגה&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>5810 G</td><td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה</td><td>Merck</td><td>CLS430828</td><td>(לאיסוף דגימות)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td> <td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr><tr><td>Congo red</td><td>Supelco</td><td>75768</td> <td>(לצביעת קורים)</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Merck</td><td>BR114831</td><td>(עבור שלבים רבים)</td></tr> <tr><td>אתנול</td><td>סופלקו</td><td>100983</td> יהיה <td>צורך לבצע את הדילולים המתאימים (לשלבים רבים)</td></tr> <tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>3609</td> <td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr> <tr><td>נייר סינון</td><td>Merck</td><td>WHA10010155</td><td>(לשלבים רבים)</td></tr> <tr><td>מבחנות זכוכית</td><td>Merck</td><td>CLS7082516</td><td>(לשימור בהקפאה בגרגרי אורז לא מקולפים)</td></tr><tr><td>צמר זכוכית</td><td>Supelco</td><td>20411</td> <td>(לשימור בהקפאה בגרגרי אורז לא קלופים)</td></tr> <tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270</td><td>או דקסטרוז (לשימור בהקפאה בוורמיקוליט)</td></tr> <tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td>או גליצרין (לשימור בהקפאה בוורמיקוליט, להכנת LPCB)</td></tr> <tr><td>איזופרופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>563935</td> <td>(למיצוי DNA כולל מפטריות מבודדים)</td></tr><tr><td>חומצה לקטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>252476</td><td>(להכנת LPCB - צביעת קורים)</td></tr><tr><td>תמיסה כחולה לקטופנול (LPCB)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>61335</td><td>(לצביעה של קורים)</td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td></td><td></td> זרימה למינארי <td>(מחלקה I, מכל חברה, לשלבים רבים)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> אור <td>(מכל חברה, לתצפית קורים)</td></tr><tr><td>MB Spin עמודות</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td> <td>(נרכש עם ערכת DNeasy PowerSoil)</td></tr> <tr><td>מתיל כחול (כחול כותנה)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M5528</td> <td>(להכנת LPCB - צביעת קורים)</td></tr> <tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)</td> <td>Merck</td><td>HS4323</td> <td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr> <tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל)</td> <td>Merck</td><td>BR780546</td><td>(לשלבים רבים)</td></tr> <tr><td>שמן מינרלי</td><td></td><td></td><td>(לשימור מבודדים פטרייתיים)</td></tr><tr><td>שקיות</td><td></td><td></td> נייר <td>בגודל ממוצע 150 מ"מ x 200 מ"מ (לאיסוף דגימות)</td></tr><tr><td>צלחת פטרי (זכוכית, 120 מ"מ x 20 מ"מ)</td><td>Merck/Pyrex</td><td>SLW1480/10D</td> <td>(ניתן לחיטוי, לתרבית שקופיות פטריות, העדיפו גבוהים יותר)</td></tr><tr><td>צלחת פטרי (זכוכית, 50 מ"מ x 17 מ"מ)</td><td>Merck/Aldrich</td><td>Z740618</td><td>(לטיהור מבודדים פטרייתיים); לחלופין: צלחות פטרי מפוליסטירן (סטריליות, &גמא;-מוקרנות, לא ניתנות לחיטוי)</td></tr><tr><td>צלחת פטרי (זכוכית, 80 מ"מ על 15 מ"מ)</td><td>Merck/Brand</td><td>BR455732</td><td>(להתקנת שברי צמחים); לחלופין: צלחות פטרי מפוליסטירן (סטריליות, &גמא;-מוקרנות, לא ניתנות לחיטוי)</td></tr><tr><td>פנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1037</td> <td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים, להכנת LPCB)</td></tr><tr><td>פורצלן מרגמה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z247464</td><td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr><tr><td>עלי חרסינה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Z247502</td><td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr><tr><td>אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA)</td><td>Millipore</td><td>P2182</td> <td>(לשלבים רבים)</td></tr> <tr><td>צינורות PowerBead</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td> <td>(נרכש עם ערכת DNeasy PowerSoil)</td></tr> <tr><td>הרכבה מהירה בינוני (אנטלן)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1.0796</td> <td>(לתרבית שקופיות פטריות)</td></tr> <tr><td>סיליקה ג'ל</td><td>סופלקו</td><td>717185</td> <td>(לשימור בהקפאה בגרגרי אורז לא קלופים)</td></tr> <tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888</td> <td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr> <tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3771</td><td>מלח נתרן לאוריל סולפט (למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט (עם 2% כלור פעיל)</td><td></td><td></td> <td>(מוצר מסחרי, לניקוי שטחי)</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי DNA בקרקע (ערכת DNeasy PowerSoil)</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td> <td>(למיצוי DNA כולל מאיברי הצמח)</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר - Nanodrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>(למיצוי DNA כולל מאיברי הצמח)</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td></td><td></td> <td>(=מיקרוסקופ מנתח, מכל חברה, לאנליזות מקרומורפולוגיות)</td></tr><tr><td>טטרציקלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T7660</td><td>(להתקנת שברי צמחים)</td></tr><tr><td>תרמובלוק</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>EP5362000035</td><td>(או מחברות אחרות)</td></tr><tr><td>הומוגנייזר רקמות וליזר תאים</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>2010 Geno / Grinder - הומוגנייזר רקמות אוטומטי ו- Cell Lyzer (למיצוי DNA כולל מאיברי הצמח)</td></tr> <tr><td>כחול טולואידין O</td><td>Sigma-Aldrich/Harleco</td><td>364-M</td> <td>(לצביעת קורים)</td></tr> <tr><td>Trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531</td> <td>(לשימור בהקפאה בוורמיקוליט)</td></tr> <tr><td>Tris Base Solution (Tris)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1699</td> <td>(למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים)</td></tr><tr><td>גרגרי אורז לא קלופים</td> <td>(לשימור בהקפאה)</td> מוט זכוכית בצורת U (או התאמה - בדוק את שלב 5.4.1, לתרבית שקופיות פטריות) ורמיקוליט גרנולומטריה עדינה (לשימור בהקפאה בוורמיקוליט) Vortexer Sigma-Aldrich/BenchMixer BMSBV1000 (למיצוי DNA כולל מבודדים פטרייתיים) תמצית שמרים <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>Y1625</td> <td>(לשימור בהקפאה בוורמיקוליט)</td></tr></tbody></table>

בידוד, אפיון ומיצוי dna כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

צמחים Mycoheterotrophic להציג את אחת הצורות הקיצוניות ביותר של תלות mycorrhizal, לאחר שאיבדו לחלוטין את היכולת האוטוטרופית שלהם. חיוני כמו כל משאב חיוני אחר, הפטריות שצמחים אלה מתקשרים איתן באופן אינטימי חיוניות עבורם. לפיכך, כמה מהטכניקות הרלוונטיות ביותר בחקר מינים מיקוהטרוטרופיים הן אלה המאפשרות חקירה של פטריות הקשורות, במיוחד אלה המאכלסות שורשים ואיברים תת קרקעיים. בהקשר זה, טכניקות לזיהוי פטריות אנדופיטיות תלויות תרבית ובלתי תלויות תרבית מיושמות בדרך כלל. בידוד אנדופיטים פטרייתיים מספק אמצעי לזיהוי מורפולוגי שלהם, ניתוח המגוון שלהם ושמירה על החיסון ליישומים בנביטה סימביוטית של זרעי סחלבים. עם זאת, ידוע כי יש מגוון גדול של פטריות שאינן ניתנות לגידול המאכלסות רקמות צמחים. לפיכך, טכניקות זיהוי מולקולרי תלויות תרבות מציעות כיסוי רחב יותר של מגוון המינים ושפע. מאמר זה נועד לספק את התמיכה המתודולוגית הדרושה להתחלת שני הליכי חקירה: תלוי תרבות והליך עצמאי. באשר לפרוטוקול תלוי התרבית, מפורטים תהליכי איסוף ושמירה של דגימות צמחים מאתרי איסוף למתקני מעבדה, לצד בידוד פטריות נימה מאיברים תת-קרקעיים ואוויריים של צמחים מיקוהטרוטרופיים, שמירה על אוסף של מבודדים, אפיון מורפולוגי של קורים על ידי מתודולוגיית תרבית שקופיות, וזיהוי מולקולרי של פטריות על ידי מיצוי DNA כולל. הנהלים המפורטים, הכוללים מתודולוגיות שאינן תלויות בתרבות, כוללים איסוף דגימות צמחים לצורך ניתוח מטאגנומי ומיצוי DNA כולל מאיברי צמח אכלורופילוסים באמצעות ערכה מסחרית. לבסוף, פרוטוקולי המשכיות (למשל, תגובת שרשרת פולימראז [PCR], ריצוף) מוצעים גם הם לניתוחים, וטכניקות מוצגות כאן.

בפרוטוקול הבידוד, בהתחשב בכך שיש זיהום מהמים ששימשו בשטיפה האחרונה והזיהום מזוהה גם בצלחות פטרי עם שברים מחוסנים, ניתן לנקוט פעולות שונות, בהתאם לסוג המזהם (טבלה 1). יש לחזור על הליך זה מההתחלה במקרה של מזהמים פטרייתיים נבגים מאוד, המציגים גם צמיחה מואצת, וחיידקים מתרבים אינטנסיביים, עמידים בפני האנטיביוטיקה שנבחרה. במקום זאת, אם המזהם הפטרייתי מציג צמיחה איטית או אינו נבג, ניתן פשוט להימנע מבידוד בשלבים הבאים של הפרוטוקול. לבסוף, זיהומים עם זנים חיידקיים המתרבים לאט ניתן...

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

הטכניקות המוצגות כאן שימושיות לחקר קהילת הפטריות האנדופיטיות הקשורות לאיברי צמחים שונים. בידוד פטריות אנדופיטיות מאפשר את זיהוין, והוא בעל ערך בטכניקות אחרות כגון נביטה סימביוטית. כדי להתחיל, להכין 8 עד 10 ס"מ תרבית PDA בינוני צלחת פטרי בתוספת שלושה מיליליטר לכל ליטר של אנטיביוטיקה.בדוק אם יש זיהום על ידי דגירה על צלחות פטרי בינוניות בטמפרטורה של 36 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפני השימוש. למחרת, יש לחטא באופן שטחי שברי צמחים מיכוהטרוטרופיים בריאים בהליך סטנדרטי ולהניח אותם בצלחת פטרי סטרילית. כדי להעריך את היעילות של התפשטות שטחית של דגימות, לחסן כמה טיפות של מים מזוקקים בשימוש במהלך השטיפה האחרונה של הדגימות על PDA.לאחר מכן, באמצעות אזמל להבה ומלקחיים, מחלקים את הדגימות לחתיכות בעובי 0.2 סנטימטר. חתך את הדגימות כדי להגדיל את שטח הפנים כדי להיות במגע עם המדיום. מניחים חמישה שברים של האיברים התת-קרקעיים בצלחת האנטיביוטיקה בתוספת PDA רחוק ככל האפשר זה מזה מבלי לגעת בשולי הכלים.אטמו את צלחות הפטרי בסרט נצמד, ואחסנו אותן בחושך בטמפרטורה של 25 עד 27 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים. יום לפני הגידול, הכינו צלחות פטרי בקוטר חמישה סנטימטרים בחמישה עד שבעה גרם לליטר מדיום AA, ודגרו על הצלחות בחום של 36 מעלות במשך 24 שעות. כדי לטהר מבודדים פטרייתיים, הבדילו את מושבות לוחות מחשב כף היד לפי צבע, תבנית צמיחה, מרקם ותבנית שוליים.לאחר מכן תחמו את שולי המושבה בצד התחתון של המנה. זהה גם את המושבות באמצעות קוד. בעזרת קצה של קיסם עץ אוטוקלאבי, מחזירים כמות זעירה של תפטיר משולי מושבת הפטריות המזוהה וחותרים את צלחת ה-AA, תוך יצירת שלושה פסים בסנטימטר אחד זה מזה ומקצוות המנה.תייג את לוח AA עם הקוד המתאים באמצעות נייר מדבקות ועיפרון. אטמו את הצלחות לפני הדגירה עליהן בחושך בטמפרטורה של 25 עד 27 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. לאחר הדגירה, התבוננו בקפידה בלוחות כדי לזהות קורים עדינים היוצרים מושבות בודדות.תחמו את שטחן של מושבות בודדות באמצעות סמן קבוע. חותכים חלק מהתווך המכיל את המושבה באמצעות קיסם אוטוקלאבי, ומעבירים את נפח החיתוך למרכז צלחת פטרי PDA חדשה ללא אנטיביוטיקה. לאחר תיוג צלחות הפטרי בקודים של המבודדים, אטמו אותם בסרט נצמד, ושמרו אותם בחושך בטמפרטורה של 25 עד 27 מעלות צלזיוס למשך שבעה עד 14 ימים.כדי להתחיל בשימור מבודדי הפטרייה בשיטה של קסטלני, הוסף 0.5 מיליליטר מים מזוקקים לצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר. באמצעות קיסם אוטוקלאב, חותכים 0.5 על 0.5 ס"מ תווך קובואידי משולי התפטיר של מבודדים מטוהרים שכבר גדלו. מניחים ארבע עד שש קוביות בצינורות המיקרוצנטריפוגות עם מים מזוקקים.אחסנו את הצינורות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך זמן רב ככל שיידרש. בעת הצורך, החזירו קובואיד והניחו אותו במרכז צלחת מחשב כף יד חדשה כדי לגדל מבודד מאוחסן. התחל את שיטת הרכבה tease על ידי הנחת טיפה של כתם Toluidine blue-O על מגלשת זכוכית נקייה.כתמים שונים יכולים לשמש בטכניקה כזו. בעזרת קיסם אוטוקלאבי, הסירו בזהירות מעט קורים מהמבודד הגדל והניחו אותם בטיפת הכתם. הניחו פתק כיסוי ונתחו אותו תחת מיקרוסקופ אור.לשיטת הרכבה על סרט הדבקה, הניחו טיפה של כתם כחול כותנה לקטופנול על מגלשת זכוכית נקייה. חותכים רצועה של סרט הדבקה שקוף בגודל שמתאים למגלשת הזכוכית והכתם המרכזי נופל היטב. כוונו את המשטח הדביק של רצועת ההדבקה אל משטח התפטיר, ונסו לאסוף מעט קורים מבלי ללחוץ או לאסוף יותר מדי מהם.לאחר מכן הדביקו את הסרט למגלשת הזכוכית, וודאו שהכתם בא במגע עם הקורים שנאספו. הניחו טיפת מים מעל הסרט והניחו את חלקת הכיסוי לפני ניתוח המגלשה תחת מיקרוסקופ אור. הצמיחה של קבוצות קטנות של תפטיר פטריות נימה העולה מפנים השברים נצפתה לאחר חמישה ימים של חיסון של שבר איבר הצמח mychoheterotrophic על מדיום PDA.במהלך שבעה עד 14 ימים של חיסון המבודד המטוהר, נצפתה צמיחה צנטריפוגלית של מושבת מבודד פטרייתי טהור על מחשב כף יד, ויצרה תפטיר מעגלי יחיד. ניתן היה לזהות בקלות זיהומים אפשריים, שפגעו בהומוגניות המושבה בכל הנוגע לצורתה הגדלה, צבעה וייצור הפיגמנטים בתווך. מושבה שבודדה משורשי הפיוזיפורם של הסחלב המיצ'והטרוטרופי, Wullschlaegelia aphylla, הייתה אטומה ללא פיגמנטים מפוזרים או הפרשה בתווך.המושבה הייתה לבנה עד אפורה בצד העליון, וחומה בצד התחתון. התפטירים היו אוויריים ושופעים, והשוליים היו לא סדירים ואוויריים. למושבה מרקם קטיפתי וטופוגרפיה מקומטת ללא מבנים מקרוסקופיים.המבנים שלא נראו בקלות בתפטיר הלא מוכתם הוצגו לאחר צביעת התפטיר הפטרייתי בכחול כותנה לקטופנול ובכחול טולוידין, מה שהקל על זיהויים. שיטות הבידוד הפטרייתי המוצגות כאן עשויות להיות מיושמות גם על צמחים ירוקים לזיהוי האנדופיטים הפטרייתיים. הפטריות המבודדות יכולות לשמש בניסויי נביטה סימביוטיים.

isolation-characterization-total-dna-extraction-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות חיסון להציג entomopathogen...

הקמת Entomopathogens פטרייתיים כEndophytes: לקראת ההדברה ביולוגית Endophytic

פותחה שיטה לזיהוי אנדוספורים חיידקיים מקהילות מיקרוביאליות מורכבות לביצוע תרבית מותאמת אישית או מחקרים מולקולריים של קבוצת חיידקים זו.

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

ההשוואה ואופטימיזציה של שתי שיטות העשרה DNA DNA organellar צמח מוצגים: צנטריפוגה ההפרש הדיפרנציאלי ואת החלוקה של gDNA הכולל מבוסס על מצב מתילציה. אנו מעריכים את כמות הדנ"א וכתוצאה מכך, מדגימים ביצועים ברצף של הדור הבא, וקוראים את הפוטנציאל לשימוש ברצף המולקולה החד-פעמית.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

חפירה של שורשי צמחים מן השדה, כמו גם עיבוד של דגימות לתוך endosphere, rhizosphere ואדמה מתוארים בפירוט, כולל הפקת דנ א ושיטות ניתוח הנתונים. נייר זה נועד לאפשר מעבדות אחרות שימוש בטכניקות אלה לצורך המחקר של קרקע, endosphere, rhizosphere microbiomes.

בידוד וניתוח של הקהילות מיקרוביאלית בקרקע, Rhizosphere ושורשים בניסויים עשב רב שנתי

מוצרים מבוססי גלייפוסט (GBP) הם קוטלי העשבים הנפוצים ביותר בספקטרום רחב ברחבי העולם. במאמר זה אנו מציגים קווים מנחים כלליים לכימות ההשפעה של GBP על מיקרוביום, מניסויי שדה ועד ניתוחי ביואינפורמטיקה.

כימות ההשפעה הפוטנציאלית של מוצרים מבוססי גלייפוסט על מיקרוביום

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה ומהירה של culturing שמרים ואת התבנית Aspergillus fumigatus מקבוצות גדולות של דגימות קרקע תוך 7 ימים בלבד. ניתן לשנות את השיטות בקלות כך שיתאימו למגוון של מדיות דגירה וטמפרטורות לפי הצורך לניסויים.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער ודרך חלופית להעריך את פעילותן האנטומופתוגנית באמצעות חרק מודל קולאופטרן. שיטה זו יעילה ונוחה לחקר משאבים פטרייתיים אנטומופתוגניים ממזיקים חרקים משעממי עץ ביערות טבעיים.

בידוד, זיהוי התנהגותי והערכת פתוגניות של פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער

טכניקת iChip עושה שימוש במכשיר בידוד זול ופשוט באתרו המגביר את שיעורי גילוי המיקרואורגניזמים החדשים מהאדמה. ניתן להשתמש במיקרואורגניזמים חדשים למחקר נוסף הנוגע למיקרוביום הקרקע או לגילוי מוצרים טבעיים, בין היתר.

בידוד מיקרואורגניזמים בקרקע באמצעות טכנולוגיית iChip

למד שיטות בידוד ואפיון פטריות אנדופיטיות מצמחים מיקוהטרוטרופיים באמצעות טכניקות תרבית סטריליות ומיקרוסקופיה. פרוטוקולים אלה מאפשרים זיהוי מולקולרי מדויק ושימור לטווח ארוך של הבידודים לצורך מחקרים עתידיים.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

גלה סרטונים נוספים