יישומים Microfluidic עבור אבחון פנויה
3 בפברואר 2008
בראיון זה, ד"ר Klapperich דן תרמופלסטיים ייצור של מכשירים microfluidic ויישומם לפיתוח של כלי אבחון חדשים.
שמי קתרין קלאודברידג' (Catherine CloudBridge) ואני פרופסור לייצור, הנדסה והנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת בוסטון. אני מנהלת את המעבדה למכשירים ביו-רפואיים מיקרוסקופיים וסביבות מיקרוסקופיות. אנו עובדים בעיקר על פיתוח אמצעי אבחון חד-פעמיים ליישומים בסביבות עם משאבים מוגבלים.
לכן אנו משתמשים במיקרופלואידיקה כדי להכין את המכשירים הללו. אנו מתעניינים למעשה בשני תחומי מחקר. בעיקר אנו מעוניינים לבחון כיצד במולקולות ותאים מקיימים אינטראקציה עם פני שטח של פולימרים פלסטיים.
זוהי מסגרת העל העיקרית שלנו. עבודה זו באה לידי ביטוי ביישומים של מיקרופלואידיקה עבור אבחון חד-פעמי. לכן, במעבדה, אנו מייצרים התקני מיקרופלואידיקה.
בחומרים תרמופלסטיים איננו משתמשים, בדרך כלל, ב-PDMS, שהוא החומר הגומי שרוב האנשים משתמשים בו כדי לייצר מערכות מיקרופלואידיקה במעבדה. אנו מייצרים את המכשירים שלנו מחומרים תרמופלסטיים. אנו מעוניינים להשתמש במכשירים תרמופלסטיים אלו כדי לבצע ביולוגיה מולקולרית בקנה מידה מיקרוסקופי, באופן שיאפשר ביצוע של ביולוגיה מולקולרית בשטח, הרחק ממעבדה מרכזית.
האופן שבו זה מיושם במעבדה הוא באמצעות ייצור כרטיסי פלסטיק קטנים, ובתוכם נמצאים עמודי מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction), עמודי ליזיס של תאים או עמודי ערבוב. אנו מבצעים גם תגובת שרשרת פולימראז (polymerase chain reaction) על השבב כטכניקת זיהוי. כל הרכיבים הללו משולבים במכשיר קטן, אשר בטווח הארוך של המחקר יעלה כמכשיר אינטגרטיבי שניתן יהיה להחזיקו ביד ולהוציאו לשטח או לסביבות שבהן מעבדה רחבת היקף, עם כל מכשירי הסרכזוגה, אינקובטורי החממה וכדומה, אינה זמינה.
לפיכך, השאיפה שלנו היא להיות מסוגלים להתחיל באופן אידיאלי עם דגימה אנושית כמו דם, שתן, צואה או למשל מטוש נזופרינגיאלי, שיהיה רירית. ולאחר מכן, בקצה השבב, לקבל תשובה של כן או לא, האם אדם מסוים נגוע במיקרואורגניזם ספציפי. ואנו עושים זאת על ידי חיפוש ה-DNA או ה-RNA של אותו מיקרואורגניזם ספציפי, בהתאם לסוג המיקרואורגניזם, בדגימה של המטופל.
לפיכך, האתגרים הטכניים העולים הם בעיקר בצד של הכנת הדגימה במשוואה זו. כאשר מתחילים עם דם, צואה או שתן, יש להגיע ממצב של דגימה אנושית "מלוכלכת" המכילה הרבה חלקיקים פוטנציאליים או מעכבים של PCR או טכניקות הגברה אחרות, למצב שבו בסופו של דבר מקבלים דגימה נקייה מאוד של חומצות גרעיניות שניתן להשתמש בהן להגברה או לחיפוש אחר DNA או RNA ספציפיים, שיעידו האם המיקרואורגניזם שאתם מחפשים היה נוכח שם.
לכן, כדי לנקות את הדגימות הללו, יש לבצע מספר פעולות. ראשית, יש לסנן את הדגימה, תהליך שעשוי לכלול סינון גס או שלב סרז' (spin) מהיר לפני העברת הדגימה לשבב, בהתאם לסוג הדגימה. אנו תמיד שואפים להתחיל עם הדגימות כפי שהן מתקבלות מהקלינאי.
לכן, עם דגימות שתן, צואה ודגימות ממח swabs נזאל-לועי, המטרה שלנו היא פשוט שהקליניקאי יבצע את עבודתו כפי שהוא עושה בדרך כלל ויגביה את הדגימה כפי שהוא רגיל. לאחר מכן, אנו לוקחים את הדגימה הזו ומניחים אותה על השבבים. כך, אם נדרש סינון נוסף בשלב זה, הסינון יתבצע בתוך השבב.
השלב השני כולל, מכיוון שאנו מבצעים בדיקות מולקולריות, את הצורך בליס (lyse) של התאים והמיקרואורגניזמים הנמצאים באותה דגימה. לכן, אנו מבצעים שלב ליזיס, הכולל בדרך כלל דחיפה של הדגימה דרך מסנן בעל גודל נקבים קטן. לעיתים המסנן מכיל גם ננו-חלקיקים כגון ננו-צינוריות פחמן, בעלות קצוות חדים, שניתן להשתמש בהן כדי לפרק אורגניזמים בעלי דפנות תא חזקות יותר, כמו C difficile, שהיא חיידק גרם-חיובי שאנו עובדים איתו וקשה מאוד לבצע לו ליזיס.
לכן עלינו להשתמש בעמודי ליזיס חסונים יותר. אך בדרך כלל אנו מבצעים ליזיס כימי ומכני משולב בתוך השבב. לאחר מכן, המטרה שלנו היא לקחת את התוצרי הליזיס (lysate) ואז להפיק מהם חומצות גרעין מטוהרות.
כעת אנו מעבירים את הליזאט דרך עמודת מיצוי פאזה מוצקה (solid phase extraction) המשולבת בשבב המיקרופלואידי. עמודת מיצוי פאזה מוצקה זו עשויה מפלסטיק ומיוצרת באמצעות כימיה שמופעלת על ידי אור בתוך התעלה המיקרופלואידית לאחר שהיא כבר יוצרה. היא גם ספוגה בדרך כלל בחלקיקי סיליקה, מכיוון שאנו מעוניינים לקשור ולשחרר חומצות גרעין.
במקרים מסוימים, שילבנו חרוזי oligo DT אם רצינו לקשור ולשחרר mRNA באופן ספציפי, למשל, או חרוזים שעליהם נוגדנים מסוימים, אם רצינו לקשור ולשחרר חלבונים ספציפיים. ואנו יכולים לייצר עמודי מיצוי המבצעים את כל הפעולות הללו. אך היום נראה לכם כיצד להכין את עמוד המיצוי של ה-sase באמצעות חרוזי סיליקה.
לאחר שביצענו זאת, העבירו את הליזט דרך עמודת הסיליקה; התהליך פועל בדיוק כפי שערכה של קיוגן (kyogen) תפעל במעבדה בקנה מידה מאקרוסקופי. לאחר מכן נבצע שטיפה כדי להיפטר מכל שאר הרכיבים שאיננו מעוניינים בהם, כמו פחמימות, ליפידים וחומרים אחרים שנמצאים בליזט התאים ובשאר הדגימה האנושית. ובסוף התהליך, נבצע אלוציה באמצעות מים.
והיתרון בעמודי מיצוי מוצק (solid phase extraction) במיקרו-קנה מידה אלו הוא שניתן לבצע אלucian (elute) עם כמות קטנה מאוד של מים, בדרך כלל בסדר גודל של 1 עד 5 µL. אנו מקבלים בחזרה כמעט את כל החומצות הגרעיניות שהכנסנו. קצב היעילות הוא כ-70% עד 90% ב-10 µL הראשונים שאנו מקבלים בחזרה מהתעלה.
לכן, אם נבצע שטיפה כפולה עם 2 עד 10 µL, נקבל בחזרה כמעט את כל החומצות הגרעיניות שהכנסנו. כך לא רק שמתקבל דגימה נקייה שניתן להריץ בה PCR, אלא דגימה בריכוז גבוה בהרבה מזה שניתן להשיג באמצעות ערכה סטנדרטית לשולחן המעבדה. לפיכך, מטרת העל של כל טכניקות הכנת הדגימות הללו היא ליצור תוצרים התואמים למספר מהמחקרים האחרים שבוצעו בתחום.
עבודה מרשימה מאוד בתחום, המראה שניתן לבצע הגברת PCR על גבי שבב. ניתן לבצע תגובת reverse transcriptase על גבי שבב אם אתם עובדים עם נגיף RNA או אם ברצונכם לבצע ניסוי של ביטוי גנים. ניתן לשלב ישירות את טכניקות הכנת הדגימות שלנו עם PCR על גבי שבב, כך שלא תצטרכו לבצע את כל תהליכי הניקוי וההכנה של הדגימות על השולחן.
וכן, וגם את שלב הריכוז שתצטרכו לבצע כדי להגיע לנפחים הזעירים הדרושים לביצוע PCR מרוב-רכיבי (multiplexed PCR) על שבב קטן. לכן, הניסויים שנציג לכם היום מדגימים כיצד אנו מרכיבים את השבב המיקרופלואידי, העשוי מטרמופלסט ולא מ-PDMS. לכן, הוא דורש תהליך ייצור שונה מעט מזה שבדרך כלל נהוג, וכן את אופן איטום השבבים הללו.
ולאחר מכן, כיצד אנו מבצעים את הכימיה המופעלת על ידי אור בתוך השבב כדי ליצור את המונוליתים הפולימריים המשמשים הן לליזיס של תאים והן למיצוי פאזה מוצקה. ובסוף תהליך זה, שכרגע מדובר בתהליכים מודולריים במעבדה, אך הם ניתנים לשילוב ואכן שולבו, מתקבלת דגימה מרוכזת מאוד של חומצות גרעיניות, RNA ו-DNA במים, שיכולה לעבור לאחר מכן למודול PCR או למודול הגברה אחר שבו ניתן לבצע זיהוי של מיקרואורגניזם או זיהום. למעשה, יש לנו מענק שעליו אנו עובדים כעת, במסגרתו אנו מתחילים לאסוף דגימות אנוש מהמרכז הרפואי של בוסטון (Boston Medical Center) מחולים שעשויים להיות או לא להיות נגועים ב-Influenza A. מכיוון שזו עונת השפעת, אלו הן הדגימות שאנו אוספים.
ואז במעבדה, אנו מבצעים את בדיקות ה-gold standard כדי לבדוק אם מישהו נגוע ב-Influenza A, שזוהי ביסודה בדיקת תרבית, הדורשת מספר ימים לביצוע. ובמקביל לכך, אנו מעבירים את הדגימות הללו דרך המודולים של השבב שלנו כעת. אנו מעבירים אותן דרך עמודת הליסיס, מעבירים אותן דרך עמודת מיצוי בפאזה מוצקה (solid phase extraction), ולאחר מכן מבצעים PCR כדי לראות עד כמה ביצועינו טובים בהשוואה לשיטות ה-gold standard.
זהו השלב שבו אנו נמצאים כעת. אם הניסויים הללו יצליחו, אני חושב שבמהלך ארבע עד שש השנים הבאות אולי נגיע למצב שבו יהיה בידינו שבב משולב ובדיקה מלאה עבור influenza A, ובנוסף אנו עובדים על clostridium difficile ודגימות צואה. ואנו נמצאים קרובים מאוד לא רק לשילוב המכשיר, אלא גם לשילוב הבדיקה.
לכן, הן פיתוח הבדיקה והן תכנון השבב חייבים להתרחש במקביל. עבור יישום מסוים, לצורך הגעה למיטת החולה, זהו למעשה תהליך מכוון מטרה. עליך להכיר את הדגימה ממנה אתה מתחיל ואת המיקרואורגניזם שאתה מחפש, כדי להבטיח אופטימיזציה של השבב לשימוש במיטת החולה.
אני לא חושב שאנחנו רחוקים מאוד מהגשמה של זה באופן של אב-טיפוס. אלו הן מטרות הסוף שלנו, לכן אני מקווה שנגיע לשם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ראיון זה עם ד"ר Catherine Klapperich בוחן את הייצור והיישום של מכשירים מיקרופלואידיים תרמופלסטיים עבור אבחון חד-פעמי, במיוחד בסביבות עם משאבים מוגבלים. הדיון מדגיש את השילוב של הכנת דגימות, מיצוי חומצות גרעיניות וזיהוי מולקולרי בתוך מכשירים קומפקטיים הניתנים לפריסה בשטח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- הנדסה ביומדית
- מיקרופלואידיקה
- פיתוח מכשירים אבחנתיים
רקע
- אבחון רפואי חד-פעמי הוא חיוני למתן שירותי בריאות בסביבות עם משאבים מוגבלים.
- התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים עיבוד ואנליזה של דגימות באופן מיניאטורי ואינטגרטיבי.
- מיקרופלואידיקה מסורתית משתמשת לעיתים קרובות ב-PDMS, אך פלסטיקה תרמופלסטית מציעה יתרונות לייצור המוני ולשימוש בשטח.
- הכנה יעילה של דגימות ומיצוי חומצות גרעיים הם אתגרים מרכזיים לאבחון מולקולרי.
מטרת המחקר
- פיתוח התקני מיקרופלואידיקה תרמופלסטיים עבור אבחון מהיר הניתן לפריסה בשטח.
- שילוב של הכנת דגימה, מיצוי חומצות גרעין וזיהוי מולקולרי על גבי שבב בודד.
- מתן אפשרות לניתוח ישיר של דגימות קליניות (למשל, דם, שתן, צואה, מטושים) ללא תשתית מעבדה נרחבת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור שבבים מיקרופלואידיים מחומרים תרמופלסטיים (לא PDMS).
- שילוב של עמודי מיצוי פאזה מוצקה ועמודי ליזיס בתוך השבב.
- שימוש בכימיה המופעלת על ידי אור ליצירת מונוליטים פולימריים למיצוי וליזיס.
- הטמעה של חרוזי סיליקה או חלקיקים פונקציונליים לקישור סלקטיבי של חומצות גרעיניות או חלבונים.
- ביצוע PCR ושעתוק הפוך על גבי השבב לצורך גילוי מולקולרי.
תוצאות עיקריות
- מיצוי יעיל של חומצות גרעיניות (השבה של 70–90%) בנפחי אלucian קטנים (1–5 µL).
- הפקת דגימות ריכוז גבוה המוכנות ל-PCR ישירות מדגימות קליניות.
- תאימות מוכחת של מודולים להכנת דגימות עם PCR on-chip המשכי.
- תיקוף מתמשך עם דגימות קליניות עבור Influenza A ו-Clostridium difficile.
מסקנות
- התקנים מיקרופלואידיים תרמופלסטיים יכולים לייעל את הכנת הדגימות ואת האבחון המולקולרי בפורמטים ניידים.
- לשבבים אינטגרליים יש פוטנציאל לספק תוצאות מהירות ומדויקות בנקודת הטיפול (point of care).
- פיתוחים עתידיים שואפים לאינטגרציה מלאה של הבדיקות ושל תכנון ההתקן עבור יישומים אבחוניים לצמידי-מיטה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
התקני מיקרופלואידיקה מתרמופלסטיים מאפשרים אבחון מסוג "מדגם-לתשובה" (sample-to-answer) בסביבות עם משאבים מוגבלים, על ידי שילוב של ליזיס, מיצוי חומצות גרעין והגברה על פלטפורמה חד-פעמית אחת. גישה זו מפחיתה את ההסתמכות על מעבדות מרכזיות ותומכת בזיהוי מהיר של מחלות זיהומיות בנקודת הטיפול (point of care). הטכנולוגיה משפרת את הביטחון החזוי בגילוי מוקדם על ידי אספקת פלטי חומצות גרעין מרוכזים וניתנים לשחזור, התואמים ל-PCR או להגברה איזותרמית בהמשך התהליך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של אינטראקציות בין מאחס לפתוגן באמצעות הפקת חומצות גרעין מופרשות מדגימות קליניות מורכבות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת חומצות גרעין נקיות ממעכבים עבור בדיקות תיקוף מטרות בהמשך התהליך.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מפיק תמרירי חומצות גרעין בריכוז גבוה (יעילות של 70-90%) המתאימים לסריקת multiplexed PCR או הגברה איזותרמית.
- ערך תפעולי: משלב הכנת דגימות וזיהוי על גבי שבב, דבר המפחית את זמן העבודה הישירה ומאפשר פיתוח בדיקות ניתנות להרחבה עבור תהליכי עבודה בעתקת שפיכה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על שלמות הדגימות מרגע האיסוף ועד לגילוי, ובכך תומך בהמשכיות תרגומית במודלים פרה-קליניים של זיהום.
- ערך תפעולי: מאפשר זרימות עבודה סטנדרטיות עבור סוגי דגימות שונים (דם, שתן, צואה, מטושים) למען תרגום עקבי מהשלב הפרה-קליני לשלב הקליני.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות בביולוגיה מוקדמת ועד למוכנות של בדיקה (assay) בזיהוי מובילים (lead identification), ובמיוחד עבור דיאגנוסטיקה מבוססת חומצות גרעין המכוונת לסוכנים זיהומיים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות על ידי אספקת תשומות נקיות של חומצות גרעין עבור qPCR, רצף (sequencing), או זיהוי של חתימות ספציפיות לנתיב פתוגני המבוסס על CRISPR.
- סריקה: מספקת דגימות מוכנות לבדיקה בעלות טוהר וריכוז גבוהים, התומכים בסריקה אמינה של תרכובות או מעכבים בפיתוח נוגדי מיקרובים.
- אנליטיקה: מייצרת תנובות כמותיות של חומצות גרעין המאפשרות נורמליזציה בין תנאים שונים והשוואה סטטיסטית של יעילות הכנת הדגימה.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לעבודות פרה-קליניות על ידי שימור שלם של סממנים ביולוגיים (למשל, עומס ויראלי, גנים של עמידות) באמצעות ליזיס ואקסטרקציה משולבים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת מודול להכנת דגימות בעל אפשרות לשימוש חוזר, הניתן להתאמה למטרות מרובות (למשל, Influenza A, C. difficile) על פני תחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת שונות ביולוגית באמצעות התאושיה סטנדרטית של חומצות גרעיניות ממטריצות דגימה מגוונות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות ייצור תרמופלסטי ושילוב עמודות בהפעלה פוטו-כימית, המאפשרים ייצור בסדרות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטאות משופרת לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי יצירת קלטים אבחוניים מהימנים המפחיתים תוצאות שגואות שליליות בשלב המוקדם של תיקוף המטרה.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים אבחוניים מותאם לסיכון, באמצעות עיבוד דגימות עקבי ובעל תפוקה גבוהה לאורך תוכניות פרה-קליניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידיקה, כימיה של פני שטח ועקרונות של טיהור חומצות גרעיניות.
- תלוי בציוד להלחמה תרמופלסטית ובמערכות פולימריזציה המופעלות על ידי UV או אור לצורך ייצור עמודות בתוך השבב.
- מחייב סטנדרטיזציה של קצבי זרימה, תנאי ליזיס ונפחי אלוציה בין מפעילים ואתרים שונים להשגת ביצועים הדירים.
- כולל שיקולי התאמה לצמיגויות דגימה שונות ועומסי חלקיקים (למשל, צואה לעומת שתן) המשפיעים על יעילות הסינון והליזיס.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לאופטימיזציה של יעילות הליזיס עבור אורגניזמים שקשה לפרק (למשל, C. difficile) מבלי לפגוע בתאימות לאמפליפיקציה בשלבים הבאים.
