פרופיל של מוצין O-גליקנים פרמתילציה באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה

אנו חוקרים את הגליקוביולוגיה של אינטראקציות מיקרובים בין מארח במערכת העיכול עם דגש על תפקיד שכבת הריר המכסה את מערכת העיכול, ובמיוחד על המוקינים והגליקנים שלהם בבריאות ובמחלות. גליקנים מוצינים מוכרים יותר ויותר כגורמים חשובים באינטראקציות בין המארח למיקרובים, שכן הם מספקים חומרים מזינים ואתרי קישור לחיידקים. שינוי בפרופיל הגליקוזילציה עלול לגרום להפרעה בהרכב המיקרוביוטי ולהפך, פנוטיפים הנצפים לעיתים קרובות במצבי מחלה.

עם זאת, מוצינים ידועים כמאתגרים במיוחד לחקר כי הם מוגלקים בגליקוזילציה גבוהה. חידושים בטכניקות דגימה ובניתוח ביואינפורמטי מעקב יכולים לקדם את התחום וכן גישות חדשות לעיבוד דגימות להגדלת התפוקה ולהפחתת הזמן מאיסוף הדגימות לתוצאות. טכניקות אנליטיות אחרות מאפשרות אפיון מבני מפורט יותר של גליקנים, אך דורשות זמן עבודה וניתוח ממושכים.

הטכניקה המתוארת כאן באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF מציעה יתרון במהירות, מה שהופך אותה לבעלת תפוקה גבוהה ומתאימה לסינון ופרופיל. כדי להתחיל, ערבבו מוצינים מטוהרים עם 250 מיקרוליטר של בופר בטא-אלימינציה בבקבוקון זכוכית בנפח ארבעה מיליליטר. אטום את הבקבוקון היטב עם כיסוי מצופה פוליטטראפלואוראתילן ודוגר את התגובה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.

על קרח, הוסיפו מיליליטר אחד מתמיסת חומצה אצטית 5% לתערובת התגובה בטיפה. להסרת מלח הדגימה, סתום פיפטה מזכוכית בכמות קטנה של צמר זכוכית. הוסיפו 1.5 מיליליטר של מתלי השרף לפיפטה הזכוכית מלמעלה, ואז נותנים לה לשקוע ולנקז.

עכשיו, שטוף את השרף עם שני מיליליטרים של חומצה אצטית 5% וזרוק את הזרימה. לאחר מכן, הוסף את דגימת המוטין לעמוד הסרת המלח ואסוף את הזרימה בצינור של חמישה מיליליטר. שטוף את העמודה פעמיים עם מיליליטר אחד של חומצה אצטית 5% כדי לאסוף את הזרימה.

לאחר מכן, באמצעות אידוי צנטריפוגלי, הסר את החומצה האצטית ומרכז את הדגימה בטמפרטורה של חמישה מיליבר ו-30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. המיס את הדגימה ב-0.5 מיליליטר של חומצה אצטית מתנולית, וייבש אותה תחת זרם חנקן. באמצעות מזרק זכוכית, הוסף ארבעה מיליליטר DMSO לבקבוקון המכיל נתרן הידרוקסיד ותערובת מתנול.

לאחר מערבולת, צנטריפוגה את התמיסה ב-2,000 גרם למשך שתי דקות. פנו בזהירות את הסופרנטנט והסירו את המלחים מבלי להפריע לג'ל. לאחר הבטחת שאין עוד מלחים, החזירו את הג'ל לארבעה מיליליטר של DMSO חסר מים כדי להכין את בסיס הפרמתילציה.

לאחר מכן, לדגימת המוטין המיובש, הוסיפו DMSO חסר מים ובסיס פרמתילציה מיד ואחריהם יודומתאן. דגרו את תגובת הפרמתילציה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור חזק. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר מים כדי לסיים את התגובה.

לאחר שהדגימה הופכת למעוננת, שטפו אותה בחנקן עד שהיא מתבהרת. העמיסו את הדגימה על לוח שאיבה לאיזון ליפופילי הידרופילי ל-96 בארות. יש להפעיל לחץ חיובי כדי לדחוף את הדגימות דרך הפאזה המוצקה בקצב זרימה של כ-מיליליטר אחד לדקה.

לאחר השלכת הזרם, שטפו את הבארות פעמיים עם מיליליטר אחד של מים. שחרר את הגליקנים מהצלחת פעמיים עם מיליליטר אחד של מתנול. הפעילו לחץ רק עד שהמתנול מתחיל לצאת מהצלחת, ואז אפשרו לזרימת הכבידה לשמור על הקצב הנדרש.

ייבשו את הדגימה באמצעות אידוי צנטריפוגלי והמיסו אותה ב-10 מיקרוליטר של TA50. לאחר ערבוב מיקרוליטר אחד של דגימה עם המטריצה, טען אותה על פלטת מטרה מפלדה מסוג MALDI ומאפשר לה להתייבש. לניתוח נתונים, טען את קובץ ה-ASCII המיוצא של ספקטרום המסה ב-GlycoWorkbench.

לאחר ביצוע תיקון קו הבסיס, חשב את מרכזי השיא ובחלון הקופץ בחר את טווח המסה המתאים, יחס האות לרעש המינימלי, ועוצמת השיא המינימלית של ספקטרומטריית מסה. לאחר מכן, השתמשו בכלי Glyco-Peakfinder כדי לזהות את קומפוזיציות המבנים התואמות לרשימת הפסגה. בחר perMe כגזירה, redEnd כקצה המפחית, וקבע את המספר המינימלי והמקסימלי של שאריות צפויות.

למוצינים, בחרו הקסוס, N-אצטיל-הקסוסאמין, דאוקסי-הקסוס וחומצה N-אצטילנוראמינית. לגליקנים סולפטיים, השתמשו באפשרות שאריות אחרות עם מסה של 87.9. לנתוני MALDI-TOF, הגדר את מספר יוני הנתרן והמטענים המקסימלי לאחד כל אחד, והגדר את הדיוק ל-0.5 דלטון.

בחר את כל ההערות הנכונות עם מקש Control ולחץ על כל אחת מהן. לחץ קליק ימני על ההערות שנבחרו ובחר הוסף לרשימת השיא המוערת. כדי ליצור דוח שמשווה ספקטרום עם הערות מרובים, עבור לכלים ואחריו לדיווח וצור דוח שמשווה פרופילים שונים.

הדפיסו את הדוח כ-PDF כדי לשמור אותו. לניתוח ספקטרום פרגמנטציה, טענו את הספקטרום ל-GlycoWorkbench וצרו את רשימת השיא כפי שהודגם קודם. שרטט מבנים גליקניים משוערים התואמים להרכב הגליקני המוער.

כדי ליצור פרגמנטים לכל מבנה, לחץ קליק ימני לבחירת Copy fragments to canvas ובחר Compute fragments תחת כלי Fragments. לניתוח פירוק נוסף, לחצו על פיק של עניין בצופה הספקטרום. קליק ימני ובחר 'מצא את כל המבנים התואמים את השיאים כדי לשאול את יחס החיוב הראשי' של השיא שנבחר מול מסדי נתונים מקוונים.

בחר מבנים פוטנציאליים מעניינים ולחץ קליק ימני כדי להעתיק אותם לחלון הקנבס עם האפשרות המתאימה. כדי לחשב שברים אפשריים מכל מבנה גליקני, בחר את המבנה בקנבס. לאחר מכן, תחת כלים ופרגמנטים, בחר פרגמנטים חישוביים עבור המבנה הנוכחי.

אם חישבו מקטעים ליותר ממבנה גליקן אחד, עבור לתצוגת טבלת השברים תחת לשונית הסיכום כדי לצפות בטבלת ההשוואה. בחר את השברים התואמים לרשימת השיא לכל מבנה גליקני פוטנציאלי. לחץ קליק ימני ובחר 'העתק קטעים לקנבס מהתפריט הנפתח'.

לבסוף, בלשונית הכלים, לך ל-Profiler ואחר כך ל-Annotate peaks עם כל המבנים. לאחר מכן בחר כלים, דיווח, וצור דוח של ההערות. הסרת מלח באמצעות חילוף יונים הביאה לשיקום טוב יותר של גליקנים גדולים יותר, כאשר מבנים גדולים אלה מהווים 31% מסך הגליקנים לעומת 21% בהפקת PGC.

מבין המבנים הגליקניים שזוהו, גליקן אחד זוהה רק דרך הדגימה המליחה של חילוף היונים. יתרה מזאת, הסרת מלח באמצעות החלפת יונים והסרת בוראט הובילה לספקטרות עם יחס אות לרעש מוגבר לעומת אלו שנוצרו לאחר הסרת מלח באמצעות הפקת פאזה מוצקה באמצעות PGC. זמני תגובת הפרמתילציה של 30 ו-90 דקות הובילו לזיהוי 33 שיאי גליקן, בעוד שתגובה בת חמש דקות זיהתה רק 31 פסגות.