פרופיל של מוצין O-גליקנים פרמתילציה באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה
20 ביוני 2025
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחרור O-גליקנים ממוצין, והתפלה, פרמתילציה וניתוח לאחר מכן באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.
אנו חוקרים את הגליקוביולוגיה של אינטראקציות מיקרובים בין מארח במערכת העיכול עם דגש על תפקיד שכבת הריר המכסה את מערכת העיכול, ובמיוחד על המוקינים והגליקנים שלהם בבריאות ובמחלות. גליקנים מוצינים מוכרים יותר ויותר כגורמים חשובים באינטראקציות בין המארח למיקרובים, שכן הם מספקים חומרים מזינים ואתרי קישור לחיידקים. שינוי בפרופיל הגליקוזילציה עלול לגרום להפרעה בהרכב המיקרוביוטי ולהפך, פנוטיפים הנצפים לעיתים קרובות במצבי מחלה.
עם זאת, מוצינים ידועים כמאתגרים במיוחד לחקר כי הם מוגלקים בגליקוזילציה גבוהה. חידושים בטכניקות דגימה ובניתוח ביואינפורמטי מעקב יכולים לקדם את התחום וכן גישות חדשות לעיבוד דגימות להגדלת התפוקה ולהפחתת הזמן מאיסוף הדגימות לתוצאות. טכניקות אנליטיות אחרות מאפשרות אפיון מבני מפורט יותר של גליקנים, אך דורשות זמן עבודה וניתוח ממושכים.
הטכניקה המתוארת כאן באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF מציעה יתרון במהירות, מה שהופך אותה לבעלת תפוקה גבוהה ומתאימה לסינון ופרופיל. כדי להתחיל, ערבבו מוצינים מטוהרים עם 250 מיקרוליטר של בופר בטא-אלימינציה בבקבוקון זכוכית בנפח ארבעה מיליליטר. אטום את הבקבוקון היטב עם כיסוי מצופה פוליטטראפלואוראתילן ודוגר את התגובה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
על קרח, הוסיפו מיליליטר אחד מתמיסת חומצה אצטית 5% לתערובת התגובה בטיפה. להסרת מלח הדגימה, סתום פיפטה מזכוכית בכמות קטנה של צמר זכוכית. הוסיפו 1.5 מיליליטר של מתלי השרף לפיפטה הזכוכית מלמעלה, ואז נותנים לה לשקוע ולנקז.
עכשיו, שטוף את השרף עם שני מיליליטרים של חומצה אצטית 5% וזרוק את הזרימה. לאחר מכן, הוסף את דגימת המוטין לעמוד הסרת המלח ואסוף את הזרימה בצינור של חמישה מיליליטר. שטוף את העמודה פעמיים עם מיליליטר אחד של חומצה אצטית 5% כדי לאסוף את הזרימה.
לאחר מכן, באמצעות אידוי צנטריפוגלי, הסר את החומצה האצטית ומרכז את הדגימה בטמפרטורה של חמישה מיליבר ו-30 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. המיס את הדגימה ב-0.5 מיליליטר של חומצה אצטית מתנולית, וייבש אותה תחת זרם חנקן. באמצעות מזרק זכוכית, הוסף ארבעה מיליליטר DMSO לבקבוקון המכיל נתרן הידרוקסיד ותערובת מתנול.
לאחר מערבולת, צנטריפוגה את התמיסה ב-2,000 גרם למשך שתי דקות. פנו בזהירות את הסופרנטנט והסירו את המלחים מבלי להפריע לג'ל. לאחר הבטחת שאין עוד מלחים, החזירו את הג'ל לארבעה מיליליטר של DMSO חסר מים כדי להכין את בסיס הפרמתילציה.
לאחר מכן, לדגימת המוטין המיובש, הוסיפו DMSO חסר מים ובסיס פרמתילציה מיד ואחריהם יודומתאן. דגרו את תגובת הפרמתילציה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור חזק. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר מים כדי לסיים את התגובה.
לאחר שהדגימה הופכת למעוננת, שטפו אותה בחנקן עד שהיא מתבהרת. העמיסו את הדגימה על לוח שאיבה לאיזון ליפופילי הידרופילי ל-96 בארות. יש להפעיל לחץ חיובי כדי לדחוף את הדגימות דרך הפאזה המוצקה בקצב זרימה של כ-מיליליטר אחד לדקה.
לאחר השלכת הזרם, שטפו את הבארות פעמיים עם מיליליטר אחד של מים. שחרר את הגליקנים מהצלחת פעמיים עם מיליליטר אחד של מתנול. הפעילו לחץ רק עד שהמתנול מתחיל לצאת מהצלחת, ואז אפשרו לזרימת הכבידה לשמור על הקצב הנדרש.
ייבשו את הדגימה באמצעות אידוי צנטריפוגלי והמיסו אותה ב-10 מיקרוליטר של TA50. לאחר ערבוב מיקרוליטר אחד של דגימה עם המטריצה, טען אותה על פלטת מטרה מפלדה מסוג MALDI ומאפשר לה להתייבש. לניתוח נתונים, טען את קובץ ה-ASCII המיוצא של ספקטרום המסה ב-GlycoWorkbench.
לאחר ביצוע תיקון קו הבסיס, חשב את מרכזי השיא ובחלון הקופץ בחר את טווח המסה המתאים, יחס האות לרעש המינימלי, ועוצמת השיא המינימלית של ספקטרומטריית מסה. לאחר מכן, השתמשו בכלי Glyco-Peakfinder כדי לזהות את קומפוזיציות המבנים התואמות לרשימת הפסגה. בחר perMe כגזירה, redEnd כקצה המפחית, וקבע את המספר המינימלי והמקסימלי של שאריות צפויות.
למוצינים, בחרו הקסוס, N-אצטיל-הקסוסאמין, דאוקסי-הקסוס וחומצה N-אצטילנוראמינית. לגליקנים סולפטיים, השתמשו באפשרות שאריות אחרות עם מסה של 87.9. לנתוני MALDI-TOF, הגדר את מספר יוני הנתרן והמטענים המקסימלי לאחד כל אחד, והגדר את הדיוק ל-0.5 דלטון.
בחר את כל ההערות הנכונות עם מקש Control ולחץ על כל אחת מהן. לחץ קליק ימני על ההערות שנבחרו ובחר הוסף לרשימת השיא המוערת. כדי ליצור דוח שמשווה ספקטרום עם הערות מרובים, עבור לכלים ואחריו לדיווח וצור דוח שמשווה פרופילים שונים.
הדפיסו את הדוח כ-PDF כדי לשמור אותו. לניתוח ספקטרום פרגמנטציה, טענו את הספקטרום ל-GlycoWorkbench וצרו את רשימת השיא כפי שהודגם קודם. שרטט מבנים גליקניים משוערים התואמים להרכב הגליקני המוער.
כדי ליצור פרגמנטים לכל מבנה, לחץ קליק ימני לבחירת Copy fragments to canvas ובחר Compute fragments תחת כלי Fragments. לניתוח פירוק נוסף, לחצו על פיק של עניין בצופה הספקטרום. קליק ימני ובחר 'מצא את כל המבנים התואמים את השיאים כדי לשאול את יחס החיוב הראשי' של השיא שנבחר מול מסדי נתונים מקוונים.
בחר מבנים פוטנציאליים מעניינים ולחץ קליק ימני כדי להעתיק אותם לחלון הקנבס עם האפשרות המתאימה. כדי לחשב שברים אפשריים מכל מבנה גליקני, בחר את המבנה בקנבס. לאחר מכן, תחת כלים ופרגמנטים, בחר פרגמנטים חישוביים עבור המבנה הנוכחי.
אם חישבו מקטעים ליותר ממבנה גליקן אחד, עבור לתצוגת טבלת השברים תחת לשונית הסיכום כדי לצפות בטבלת ההשוואה. בחר את השברים התואמים לרשימת השיא לכל מבנה גליקני פוטנציאלי. לחץ קליק ימני ובחר 'העתק קטעים לקנבס מהתפריט הנפתח'.
לבסוף, בלשונית הכלים, לך ל-Profiler ואחר כך ל-Annotate peaks עם כל המבנים. לאחר מכן בחר כלים, דיווח, וצור דוח של ההערות. הסרת מלח באמצעות חילוף יונים הביאה לשיקום טוב יותר של גליקנים גדולים יותר, כאשר מבנים גדולים אלה מהווים 31% מסך הגליקנים לעומת 21% בהפקת PGC.
מבין המבנים הגליקניים שזוהו, גליקן אחד זוהה רק דרך הדגימה המליחה של חילוף היונים. יתרה מזאת, הסרת מלח באמצעות החלפת יונים והסרת בוראט הובילה לספקטרות עם יחס אות לרעש מוגבר לעומת אלו שנוצרו לאחר הסרת מלח באמצעות הפקת פאזה מוצקה באמצעות PGC. זמני תגובת הפרמתילציה של 30 ו-90 דקות הובילו לזיהוי 33 שיאי גליקן, בעוד שתגובה בת חמש דקות זיהתה רק 31 פסגות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לשחרור O-glycans ממוצינים (mucins), תוך התמקדות בניתוחם באמצעות ספקטרומטריית מסות מסוג MALDI-TOF. המחקר מדגיש את חשיבותם של גליקנים של מוצינים באינטראקציות בין מאכסן למיקרובים ואת השפעותיהם על הבריאות והמחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גליקובביולוגיה
- אינטראקציות מיקרוביאליות
- ספקטרומטריית מסות
רקע
- מוצינים והגליקנים שלהם ממלאים תפקיד מכריע בדרכי העיכול.
- שינויים בגליקוזילציה עלולים להשפיע על הרכב המיקרוביוטה.
- חקר המיוצינים הוא מאתגר בשל הגליקוזילציה העביבה שלהם.
- דרושות טכניקות חדשניות לצורך ניתוח יעיל.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה בקיבולת גבוהה (high-throughput) לניתוח גליקנים של מוצין.
- שיפור ההבנה של גליקנים של מוצין במצב בריאות ובמחלה.
- אספקת פרוטוקול מפורט לחוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בטא-אלמינציה לשחרור O-glycan ממוצינים.
- הסמכה (Desalting) ופרמתיליציה של גליקנים.
- ספקטרומטריית מסות MALDI-TOF לצורך אנליזה.
- כלים ביו-אינפורמטיים לניתוח נתונים וזיהוי מבנה של גליקנים.
תוצאות עיקריות
- שחרור וניתוח מוצלחים של O-glycans ממוצינים.
- הדגמה של יכולת עיבוד בתפוקה גבוהה (High-throughput) של שיטת MALDI-TOF.
- זיהוי מבני גליקנים באמצעות GlycoWorkbench.
- פוטנציאל לתובנות נוספות לגבי דפוסי גליקוזילציה של מוצינים.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לניתוח גליקנים של מוצין.
- התובנות שיושגו עשויות לקדם את המחקר בביולוגיה של פחמימות (גליקובביולוגיה) ובאינטראקציות עם המיקרוביום.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו להבנה מעמיקה יותר של תפקודי המוצין.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
פרופיילינג בתפוקה גבוהה של O-glycans של מוצין שעברו פרמתיליזציה באמצעות MALDI-TOF MS מאפשר הערכה כמותית ומהירה של תבניות גליקוזילציה הקריטיות להבנת אינטראקציות בין מאחס למיקרובים ומנגנוני מחלה. תהליך עבודה זה תומך בגילוי מוקדם ובתיקוף מטרות על ידי אספקת פרופילים חסונים וניתנים לשחזור של גליקנים, המסייעים בהפחתת סיכונים ביולוגיים ובביסוס הביטחון במנגנון. שיפור בהשחזור ובאנוטציה מבנית של גליקנים מורכבים משפיע ישירות על החלטות לגבי פורטפוליו בתוכניות של סממנים ביולוגיים וטיפולים ממוקדי-גליקו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של שינויים בגליקוזילציה הרלוונטיים למחלה ולאינטראקציות בין מאכסן למיקרוב.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי אספקת נתונים מפורטים על הרכב ומבנה הגליקנים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות אנוטציה ברמת ביטחון גבוהה של וריאנטים של O-glycan.
- משפר את הביטחון החזוי עבור היפותזות ביולוגיות המשך הכוללות גליקוזילציה של מוצין.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק פרופיל גליקנים סטנדרטי בעלת תפוקה גבוהה המתאים לסריקה של מערכי דגימות גדולים.
- מספק תוצאות כמותיות וספקטרומים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח ואופטימיזציה של הבדיקה.
- מאפשר השוואה בין שיטות מיצוי ונגזרת (derivatization) כדי למקסם את חסונו של המבחן.
- תומך ביכולת הרחבה של הפלטפורמה ובשימוש חוזר לאורך צינורות סריקה של גליקומיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את פרופיל הגליקנים למודלים רלוונטיים למחלה לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיחה רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לאנוטציה מבנית של גליקנים מורכבים.
- מפחיתה סיכון תרגומי על ידי תמיכה בהחלטות קידום מבוססות נתונים על סמך חתימות גליקנים.
- מספקת תובנה מכניסטית לגבי שינויים בגליקוזילציה הקשורים לפנוטיפים של מחלות.
שילוב בקו תהליך (Pipeline) ובזרימת עבודה
תהליך עבודה זה של MALDI-TOF MS משלב שלבי גילוי מוקדמים, דרך זיהוי מועמדים (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ובכך תומך בניתוח גליקנים מונחה-השערה ובמיון תיקי פיתוח (portfolio triage).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרת מסלולים באמצעות פרופיל של מבנים והרכבים של O-glycan.
- סריקה: מספקת נתוני גליקן כמותיים הניתנים לשחזור לצורך מוכנות של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת ספקטרומים עם הערות ונתוני פרגמנטציה להשוואת פרופילי גליקוזילציה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת חתימות גליקן למודלים של מחלות לצורך התאמת סממנים ביולוגיים וקידום מבוסס ניהול סיכונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להרחבה לניתוח גליקנים במגוון תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית ביעדים הקשורים לגליקנים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והתפוקה של תהליכי עבודה לאפיון גליקנים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) וביעילות הון בתיקי פרויקטים ממוקדי גליקו.
- השפעה על תיק הפרויקטים: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים וקידום של תוכניות גילוי מבוססות גליקנים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגליקומיקה, ספקטרומטריית מסות וכלים לביו-אינפורמטיקה של אנוטציה.
- מחייב גישה למכשור MALDI-TOF MS ותוכנה ייעודית לניתוח נתונים (למשל, GlycoWorkbench).
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים להכנת דגימות ופירוש נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה למחלקות גליקן שונות או למטריצות ביולוגיות שונות.
- המגבלות כוללות את הצורך בנתוני פרגמנטציה ובידע על מסלולים ביוסינתטיים לצורך קביעה מדויקת של המבנה.
