זיהוי וסיווג של גרסאות missense של תת-יחידה לקולטן GABA_A ספציפיות לתפקידן בנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס

המחקר שלנו מבוסס על הרעיון שמוטציות אפילפטוגניות וצפויות פרוקסימליות בתת-יחידות קולטן GABA-A עשויות להשפיע באופן דומה על מודל הנוירונים הפירמידליים CA1. אנו בוחנים זאת באמצעות מסגרת רב-ממדית. ניסויי מעבדה חיוניים לגילוי האמת, אך הם אינם יכולים ללכוד באופן מלא את המגוון והמורכבות של החיים בכל קנה מידה, ממולקולות ועד אורגניזמים. יש פשוט יותר מדי אפשרויות, זו הבעיה.

הפרוטוקול והממצאים שלנו סללו את הדרך להגדרה חישובית שניתן להשתמש בה כדי לחקור את ההשפעה של פולימורפיזמים, כגון פולימורפיזמים של תת-יחידות קולטן GABA-A על תפקוד עצבי.

המחקר שלנו מעלה שאלות חדשות לגבי המידה שבה וריאנטים פתוגניים חזויים ומוטציות אפילפטוגניות מראים תכונות דומות, וכיצד ניתן ללכוד ולדמות את הקשרים הללו ביעילות.

ההתמקדות הנוכחית שלנו היא בתפקוד המיקרו-מעגל של קליפת המוח האנטורינלית-היפוקמפוס. אנו נמשיך במודלים של בעלי חיים in-vivo ומודלים של מיקרו-מעגלים חישוביים כדי לחקור בקרת מחיצה במעגל זה, במיוחד בהפרעות נוירו-פסיכיאטריות.

[קריין] כדי להתחיל, פתח את קובץ האקסל המקורי המכיל את הנתונים הגנטיים, והסר את העמודות המיותרות מהקובץ, והשאיר רק ארבע עמודות, GRCh38Chromosome, GRCh38Location, Name ו-Protein, לפני שמירת הקובץ כ-data1.xlsx תחת ספריית העבודה הרלוונטית לתוכנת R. לניקוי ועיצוב נתונים נוספים, פתח את תוכנת R ו-RStudio. לאחר מכן, פתח את סקריפט R Data_GABAA R. הגדר את ספריית העבודה וטען את הספריות הדרושות על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה. טען את קובץ הנתונים והתחל בניקוי נתונים עבור עמודות הדורשות תהליך זה. נקה ושלב את הנתונים בעמודה אחת, מופרדת על-ידי רווח יחיד. צור מסגרת נתונים חדשה עבור הפלט המשולב והוסף את מזהה משתנה תעתיק האנסמבל הרצוי. כתוב את התוצאה לקובץ Excel חדש בשם data1output.xlsx. כדי לבנות מודל ביופיזי של סינפסה GABAergic על נוירון פירמידלי היפוקמפוס מבוסס מוליכות רב-תאיתית, התקן את Brian 2 וייבא את החבילות הנדרשות. תכנן את המודל מבוסס המוליכות על ידי הגדרת קינטיקה של שער תעלת יונים, פרמטרים פסיביים ואקטיביים ומוליכות פוסט-סינפטית. השתמש במוליכות מסוג הודג'קין-האקסלי שהשתנתה עבור נוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס. התאם את התפלגות הצפיפות של תעלות נתרן מגודרות מתח עבור סומה, מקטע התחלתי של אקסון, צמתים של רנבייר ודנדריטים. הגדר את מוליכות תעלות הנתרן והאשלגן כאפס במקטעים מיאליניים. קינטיקה בנויה של תעלות יונים לתעלות נתרן ואשלגן מגודרות מתח. הציגו זרמים סינפטיים כסיכום של כל הסינפסות הגלוטמטרגיות וה-GABAergic בתא. כלול גם זרם מהיר בתיווך קולטן AMPA וגם זרם איטי בתיווך קולטן NMDA בזרם הגלוטמטרגי. כלול רק זרם מהיר בתיווך קולטן GABA בזרם GABAergic. נניח שכמות קבועה של גלוטמט משתחררת לסינפסה עבור כל ספייק פרה-סינפטי. לכן, הפעלת הקולטנים תלויה בזמן ספייק, וסך מוליכות הקולטנים, G-AMPA ו-G-NMDA, משקף את כמות הגלוטמט המשתחררת על ידי כל אירוע. הגדר את הפרמטרים המורפולוגיים על ידי שימוש בקוטר שנמדד בניסוי עבור סומה ונויריטים, ואורך כל תא נויריט, ודפוסי הסתעפות. צמצם את המורפולוגיה האמיתית של הנוירונים למודל רב-תאים על ידי חלוקת התא למספר תאים המשמרים במדויק את מבנה ההסתעפות הראשי ושומרים על סימטריה דו-צדדית. קבע את הפרמטרים הביופיזיים עבור מודל הסינפסה GABAergic על ידי הערכת מדידות הבקרה מסוג הבר שהושגו בעבר, וייבואם לשימוש במודל. הגדר קבועי זמן עלייה והשבתה עבור זרם פוסט-סינפטי מתווך קולטן GABA-A. לתכנן את הטופולוגיה של מודל הנוירונים ולהקצות פרמטרים מורפולוגיים וביופיזיים, הכוללים ציון הסידור המרחבי והקשרים ההדדיים של התאים על סמך המידע המורפולוגי וההסתעפות שהושג בעבר. הקצה את הפרמטרים המורפולוגיים המתאימים כגון אורך וקוטר הקטע, ופרמטרים ביופיזיים לכל תא במודל. צור את הפעילות הפרה-סינפטית באמצעות SpikeGeneratorGroup. חבר את מחולל הספייק לתא היעד של נוירון המודל באמצעות המחלקה Synapses כדי לדגמן קשרים סינפטיים. הגדר זרם קבוע מתמשך של 0.85 ננו-אמפר, והנח את האלקטרודה בסומה כדי לחקות את פעילות תת-הסף המונעת על ידי עומס זרם יוני בסיסי בזמן נתון. כדי לבנות צגי הקלטה, הקלט עקבות מתח מתאי יעד באמצעות StateMonitor. לבסוף, בנה את הרשת והפעל אותה. רכבות ספייק עצביות תחת קלט גלוטמטרגי דיסטלי יחיד ועיכוב GABAergic סומטי חשפו את תוצאות הירי של קולטני GABA-A מסוג פרא ומוטנטי. מוטציית הבטא-3N110D פגעה בעיכוב וגרמה לירי תאי עצב להינעל על כניסת ה-Glu-S1 המעורר לאחר הספייק הקדם-סינפטי הרביעי, עם עיכוב פוסט-סינפטי קצר. מוטציית הגמא-2K328M פגעה גם בעיכוב עם ירי נוירונים שהתרחש סביב הספייק החמישי של Glu-S1, ועם עיכוב פוסט-סינפטי ארוך יותר מאשר בטא-3N110D. תחת קלט סינפטי כפול, מוטציית הגמא-2P302L גרמה לירי כמעט מסונכרן עם הקלט האפיקלי המדיאלי Glu-S2, ככל הנראה משקף סיכום מושהה מ-Glu-S1. מוטציית הבטא-3T288N הציגה דפוס דומה עם קוצים מיושרים לכניסות Glu-S2, וספייק שני שהופיע בסנכרון קרוב. מוטציית הבטא-3N110D בתנאי קלט כפול גרמה לעלייה חדה כמעט בכל הכניסות המעוררות למעט השתיים הראשונות, עם מרווחים קצרים יותר בין ספייקים. מוטנט הגמא-2K328M הראה דפוס ירי דומה אך לא הגיב לכניסות המעוררות השנייה והשלישית. בתנאי קלט מעורר משולש, מוטציות בטא-3N110D וגמא-2K328M הגיבו כמעט לכל הקוצים הפרה-סינפטיים, וירו זוגות ספייק בתגובה לדחף מעורר מצטבר.