פרוטוקולי סינון ניסיוניים, אימונוציטוכימיה וטכניקות הדמיה מבוססות מיקרוסקופיה עבור Penium margaritaceum

המחקר שלנו מתמקד בתפקיד דופן התא בשמירה על צורת התא ובתגובה ללחץ חיצוני. אנו משתמשים במגוון טכניקות מיקרוסקופ אור ומיקרוסקופ לייזר קונפוקלי להדמיית מבנה דופן התא בתאים חיים ומיקרוסקופ אלקטרונים להדמיה ברזולוציה גבוהה של דפנות התא.

חסר כיום קווי תאים שעברו טרנספורמציה עבור אצות סטרפטופיטים המבטאות חלבונים תת-תאיים ספציפיים להדגשת הדינמיקה של דופן התא. זה דורש שימוש בנוגדנים ובבדיקות פלואורסצנטיות אחרות למחקר. דופן התא של פניום מגיבה לצורות שונות של מתח אביוטי וביוטי, וזה מוביל לפלסטיות פנוטיפית. מצאנו שפקטינים של דופן התא הם חלק חשוב בתהליך זה. הפנוטיפ החד-תאי והיכולת לבצע תיוג תאים חיים עם פניום מציעים לביולוגים של צמחים את ההזדמנות להתעמק במבנה ובהתפתחות של דופן התא.

[מדריך] כדי להתחיל, הסר חמישה מיליליטר של תרביות תאים נוזליות הגדלות באופן פעיל של Penium margaritaceum. מעבירים לצינור צנטריפוגה מפלסטיק בנפח 15 מיליליטר, ואז לצנטריפוגה. לאחר שפיכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של WHM טרי. אבטח את מכסה הצינור בחוזקה ונער את הצינור במרץ למשך 10 שניות כדי להשעות מחדש את הגלולה ולהסיר כל חומר פולימרי חוץ-תאי ממשטח דופן התא. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של WHM טרי, ואז העבירו 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את צינורות המכסה במיקרו-צנטריפוגה ב-1000 גרם למשך דקה אחת, ואז שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-400 מיקרוליטר של WHM טרי. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של נוגדן חד שבטי מדולל לתרחיף התא ולמערבולת היטב. לאחר מכן, עטפו את הצינור בנייר אלומיניום ודגרו אותו על מסובב מעבדה למשך 90 דקות. צנטריפוגה את המתלים, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של WHM טרי לפני המערבולת למשך 10 שניות. לאחר הצנטריפוגה הסופית, השעו מחדש את הגלולה ב -400 מיקרוליטר WHM והוסיפו שמונה מיקרוליטרים של TRITC או FITC נגד חולדות עזים. לבסוף, השעו מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של מדיום גידול. מכסים את הצינור ועוטפים אותו בנייר אלומיניום עד שהוא מוכן להדמיה. לדלל את התאים המסומנים בנוגדנים JIM5 פי עשרה ב- WHM. הוסף טיפה של 50 מיקרוליטר של מתלה התא המדולל על פתק כיסוי. דגרו על התאים במשך שתי דקות בחושך כדי לאפשר היצמדות לתאים, ואז פיפטו בזהירות מיליליטר אחד של WHM טיפה כדי לשטוף את כל התאים שלא נדבקו. הוסף 30 מיקרוליטר WHM על גבי התאים המחוברים. שכבו את הטיפה ב -30 מיקרוליטר של אגרוז חם של 4% ב- WHM ותנו לה להתמצק. לדגימות בצלחת פטרי, הוסף מספיק WHM כדי לכסות לחלוטין את התאים המוטבעים באגרוז. עבור תאים על החלקת כיסוי, הפוך את החלקת הכיסוי והנח אותה בעדינות מעל שקופית שקע מלאה ב- WHM. הרכיב את התאים המוכנים על מיקרוסקופ פלורסנט. הגדר מנורה חיצונית או השתמש בתאורה המובנית של המיקרוסקופ כדי לתמוך בצמיחה ובתנועה של תאים. צלם תמונות כל 10 עד 30 דקות באמצעות ערכת המסננים TRITC כדי לעקוב אחר התרחבות דופן התא. הכן צינור המכיל חמישה מיליליטר תרביות תאים שטופות בנות 10 עד 14 יום. לאחר מכן, הוסף כ-100 מיקרוליטר של חרוזי פלורסנט של 0.75 מיקרומטר לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הכניסו מיליליטר אחד של WHM לתוך הצינור ונערו במרץ כדי להשהות את החרוזים. צנטריפוגה את הצינור ב -10,000 גרם למשך שלוש דקות. השעו מחדש את הגלולה הסופית ב -500 מיקרוליטר WHM. לאחר מכן, פיפטה מיליליטר אחד של מדיום WHM לכל באר של צלחת בת 12 בארות. הוסף מעכבים או מווסתי גדילה כדי להשיג את הריכוז הרצוי וסובב בעדינות את הצלחת. מוסיפים 10 מיקרוליטר מתמיסת החרוזים ומערבבים שוב בעדינות לערבוב, ואז מוסיפים 10 מיקרוליטר תאים שטופים לכל באר לפני הערבוב. דגרו את הצלחת למשך 24 שעות באור. מבלי להפריע לצלחת, הנח אותה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך המצויד במסנן FITC. פיפטה החוצה מיליליטר אחד של תרחיף תא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב -4,000 גרם למשך דקה אחת. לאחר השלכת הסופרנטנט, צללו את הצינור המכיל את הגלולה לחנקן נוזלי או הקפיאו במינוס 80 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הגלולה המופשרת ב -20 מיקרוליטר WHM. הנח טיפה של מתלה התאים הצפוף על החלקת כיסוי בגודל 45 על 50 מילימטרים. מניחים פתק כיסוי שני על גבי הטיפה ליצירת כריך. לחץ כלפי מטה ברציפות על הכריך למשך 30 שניות כדי לקרוע את התאים. הפרד בזהירות את פתקי הכיסוי. הוסף WHM מעל החלקות הכיסוי כדי לשטוף את התאים הקרועים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה. בדוק את הכדור הלבן או הירוק מעט לאחר השלכת הסופרנטנט. השעו מחדש את הגלולה המכילה את דפנות התא במים נטולי יונים. לאחר קרע תאים וצנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מים נטולי יונים לפני העברתה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, חבר סרט פחמן לפני השטח של בדל קיימברידג'. פיפטה חמש טיפות מיקרוליטר של מתלה דופן התא התלוי על סרט הפחמן. השתמש ביעד פלדיום כדי לצפות את הבדל למשך 50 שניות לאחר שנתתי לו להתייבש למשך הלילה. התבונן בתאים בחמישה קילו-וולט, עם גודל נקודה מתאים הממוקם 10 סנטימטרים מגלאי האלקטרונים המשני. התיוג של דופן התא של P. margaritaceum עם נוגדנים חד-שבטיים נגד פקטין חשף רשת של סיבים מורכבים של סידן היוצרים דפוס סריג לא סדיר. הפקטין הושקע במרכז התא או באיסטמוס, ודחף פקטין ישן יותר לעבר הקטבים. תיוג JIM7 הראה כי פקטין עתיר מתיל אסטרי הופרש בתחילה ברצועה צרה במצר. פולימרים אחרים בדופן התא, כגון חלבון ארבינוגלקטן, זוהו עם הנוגדן החד-שבטי JIM13. כמויות גדולות של חומרים פולימריים חוץ-תאיים הופרשו מחוץ לדופן התא, מה שאפשר גלישה וצבירת תאים. טכניקות תיוג אפשרו מחקרי דופן תא והרחבה כמותיים, תוך שילוב גישות הדמיה התפתחותיות. מחקרים מבניים קורלטיביים גילו כי סריג הפקטין הטיפוסי היה מורכב מרשת של סיבים המסתיימים חיצונית בהקרנות נפרדות. טיפול בריכוזים גבוהים של סידן הפך את סריג הפקטין למשקעים לא סדירים, כפי שנצפה בתאים המסומנים ב-JIM5. כאשר נבדקו דפנות תאים שטופלו בסידן במיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מבנה הפקטין הלא מאורגן נצפה בפירוט.