Name: הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד סטפילוקוקוס epidermidis ו Marinum Mycobacterium זיהום כמודל לגילוי תרופות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: למדו שיטת זיהום אוטומטית של עוברי זברה פיש לבדיקת תרכובות בקנה מידה גבוה. השיטה מאפשרת גילוי תרופות יעיל נגד Staphylococcus epidermidis ו-Mycobacterium marinum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ליאוני דה בור והבס Zaat (מרכז רפואי אקדמי) שספק לנו ש &#39; זן epidermidis O-47. אנו מודים לריקו Bongaarts, פרנסיס סמט ואנג&#39;לה Comas (איחוד Biometrica) לעזרה וייעוץ עם XL Copas וניתוח BioImager עצום. אנו מודים לדייוי דה ויט, אולריקה Nehrdich, ולורה ואן הולסט למטפל דגים, ועמיתים אחרים מאוניברסיטת ליידן לדיונים מועילים. מחקר זה מהווה חלק מפרויקט P5.03 IBIZA של תכנית המחקר של המכון ביו חומרים, שיתוף במימון המשרד ההולנדי לענייני כלכלה, ושל התכנית החכמה המיקס (NWOA_6QY9BM) של המשרד ההולנדי לענייני כלכלה ושל משרד הולנד חינוך, תרבות והמדע. תמיכה נוספות התקבלה מהפרויקט של האיחוד האירופי ZF-בריאות (FP7-בריאות 2009-242,048), וRMJ נתמכה על ידי מלגת מארי קירי כחוקר מנוסה באיחוד האירופי ההדרכה הרשת FishForPharma (PITN-GA-201 הראשוני1-289,209). SJR זכה למימון של תרופות היוזמה המשותפת ההתחייבות חדשנית תחת n הסכם מענק ° 115337, משאבים אשר מורכבים מתרומה כספית מהתכנית של האיחוד האירופי מסגרת השביעית (FP7/2007-2013) וחברות EFPIA במחברי contribution.The סוג להכיר נוסף תמיכה כספית מקרן אוניברסיטת ליידן (LUF) לרובוטיקה ומCyttron, בסבסוד תכנית Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, אשר בתורו נתמך כלכלית על ידי ארגון הולנד למחקר מדעי למתקני הדמיה. רכישת מערכת Copas נתמכה באופן חלקי על ידי האגף לכדור הארץ ומדעי חיים (alw) עם סיוע כספי מארגון הולנד למחקר מדעי (NWO, 834.10.004).

1. זני חיידקים ותנאי גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ס epidermidis הבידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמה מושבות בודדות מס O-47 מתח epidermidis, המכיל pWVW189 נגזר וקטור mCherry ביטוי (דה בור ל &#39;לא פורסם) מBertani לוריא (LB) צלחת אגר בתוספת 10 מיקרוגרם / כלורמפניקול ותרבות מיליליטר הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס ב25 מיליליטר מדיום LB בתוספת 10 כלורמפניקול מיקרוגרם / מיליליטר לmidlog במה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות ב12,000 XG במשך 1 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם 3x עם מי מלח 1 מיליליטר סטרילי פוספט (PBS) עם 0.3% (v / v) Tween-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD 600), ולדלל את ההשעיה החיידקים לOD 600 של 0.3 ב2% (w / v) polyvinylpyrrolidone 40 (PvP 40) ב-PBS. הערה: OD 600 של 0.3 מקבילה 1.0 x 10 8 מושבה להרכיב יחידות / מיליליטר (CFU / מיליליטר). </li></ol&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ &#39; marinum הבידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמה מושבות בודדות ממ &#39; M זן marinum או E11 המכיל את וקטור pSMT3-mCherry יציבות להביע mCherry 10 מצלחת אגר מידלברוק 7H10 עם 10% (v / v) העשרת מידלברוק OADC תוספת 50 מיקרוגרם עם / מיליליטר hygromycin ותרבות לילה על 28 מעלות צלזיוס ב10 מיליליטר של מרק מידלברוק 7H9 עם 10% (v / v) העשרת מידלברוק ADC בתוספת hygromycin 50 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 1 מיליליטר של התרבות ב12,000 XG במשך 1 דקות ולאחר מכן לשטוף אותו 3x עם 1 מיליליטר סטרילי PBS עם 0.3% (v / v) Tween-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600, ולדלל את ההשעיה החיידקים לOD 600 של 0.3 ב2% PvP (w / v) 40 ב-PBS. הערה: OD 600 של 1 מקבילה x ל1.0 10 8 CFU / מיליליטר. </li></ol></li></ol> 2. הכן את דג הזברה ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מרבי של 70 זכר ו50 ty הפראי הנשיpe דג הזברה בנפרד לתוך כלי גידול הגדול. הערה: הנח את נקבת הדג בחלקו התחתון של כלי גידול הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המפריד למחרת בבוקר, כדי לאפשר לדג הזברה להתחיל רבייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הביצים בחלק התחתון של כלי הרבייה הגדול באמצעות אספן הביצה בצינור 50 מיליליטר מלא במי ביצה (60 מיקרוגרם / מלח ים אוקיינוס ​​מיידי מיליליטר). </li></ol> 3. מחטי הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מחטים זמינות מסחרי מחוייט נימי זכוכית עם קוטר פנימי של 10 מיקרומטר. </li></ol> 4. מתאר ניסיוני של הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים של 1% 100 מיליליטר (w / v) agarose במי ביצה, וקריר עד כ 40 º C. יוצקים agarose לתוך צלחת microinjectors האוטומטית ולמקם את חותמת 1,024 היטב לתוך agarose. הערה: הצלחת מוכנה לשימוש כאשר התקררו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלחיצה האוטומטית microinjector ההפעלה תוכנה על &#39;כיול שלב&#39;,לאחר מכן לחץ על הרשת גם &#39;&#39;1024 ומניח את צלחת agarose בmicroinjector ולכייל את הצלחת על ידי לחיצה על המסך במיקום מרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל &#39;תפריט מחט&#39; ולחץ על &quot;בעל מחט לכייל&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את מחט הזריקה באמצעות קצה microloader עם או PvP μl 10 40 המכיל ס 100 CFU / NL epidermidis או 30 CFU / מ NL marinum, או שימוש PvP 40 כמו הזרקה מדומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המחט במייקרו ההזרקה האוטומטית ולכייל את x, y עמדה על ידי הפחתה או הזזת המחט והלחיצה על המסך במיקום של המחט. ואז לכייל את עמדת z של המחט על ידי לחיצה על המסך במיקום של קצה המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ את הביצים מעל רשת agarose באמצעות pipet העברת פלסטיק, ולהסיר מים ביצה עודפים. הנח את רשת agarose בmicroinjector האוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל &#39;injectioתפריט n &#39;ולהתאים את&#39; לחץ הזרקה &#39;הגדרת 200 hPa, &quot;זמן הזרקה&quot; 0.2 שניות ו&#39;לחץ פיצויים 15 hPa, אשר עולה בקנה עם NL 1, בתפריט הגדרות Femtojet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;להזריק כל &#39;להזריק כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הביצים לאחר הזרקה על ידי שטיפתם לתוך צלחת פטרי (92 x 16 מ&quot;מ), עם מקסימום של 70 עובר לכל צלחת פטרי, ולדגור על 28 ° C. </li></ol> 5. ניתוח זרימת cytometer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את זרימת חלקיקים הגדולה cytometer על פי הוראות היצרן ולמלא את הכוס מדגם ומכל נוזל נדן עם מים ביצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנת ההפעלה, ללכת לתפריט &quot;PMT &#39;ולהשתמש בהגדרות הבאות: 650 V עבור הערוץ&#39; האדום &#39;ו0 V עבור&#39; הירוק &#39;והערוצים&#39; הצהוב &#39;. ואז ללכת לתפריט &quot;הספים &#39;ולהשתמש בהגדרות הבאות:&#39; אופטיקהצפיפות l &#39;אות סף: 975 mV (ערך Copas XL: 50) ו&#39;זמן מעוף של&#39; מינימום (TOF) ל320 μsec (ערך Copas XL: 800) על מנת לצמצם את ההשפעה של פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח ללא מיון העוברים עבור לשלב 5.4, לניתוח ומיון העוברים לתוך צלחת פטרי עבור לשלב 5.5 או לצורך הניתוח ומיון העוברים לתוך צלחת 96 היטב עבור לשלב 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולחץ על &quot;התחל&quot; כדי להתחיל את הניתוח. כאשר כל העוברים מנותחים לעצור את הניתוח על ידי לחיצה על &#39;עצור&#39;. לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על &#39;חנות כל&#39;. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולהגדיר את המקסימום של 70 עובר לכל צלחת להיות מסודרת על ידי הזנת 70 בתפריט &#39;מיון&#39;. מניחים צלחת פטרי ריקה מתחת לסדרן ולחץ על &quot;מיין ידני &#39;. כאשר די פטרי<html> sh מלא, לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על &#39;חנות כל&#39;. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בגביע לדוגמא ולהגדיר את המקסימום של עובר 1 לכל גם להיות מסודרת על ידי הזנת 1 בתפריט &#39;מיון&#39;. מניחים צלחת 96 היטב ריקה לבעל צלחת השמאל ולחץ על &quot;מלא את הצלחת&quot;. כאשר צלחת 96 היטב מלאה, לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על &#39;חנות כל&#39;. הערה: כל הנתונים מאוחסנים כקבצי TXT BSRT, LMD, DAT, CSV ו. בצע את הפרוטוקול בכל צעד של 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל את קובץ TXT כדי לעבד את הנתונים הגולמיים, להשתמש בהגדרות סינון הנתונים הבאות: &#39;מצב בחר&#39;: 40, ואם שימוש במודול מהסוג &quot;סוג הסטטוס &#39;:. 6 ואז להשתמש במספרים מסך הכל אות הקרינה מ&#39;האדום &#39;ערוץ כדי לחשב את הממוצע וסטיית ההתקן של הממוצע. עלילה ערכות נתונים אלה לתוך גרף עמודות או פיזור. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. טיפול התרופתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח והודעה מסוג ב 3 ימי הזרקה (dpi), מ &#39; marinum נגוע עוברים בשתי קבוצות שווה שימוש בחלקיקים הגדולים cytometer זרימה (שלב 5.5). טיפול בקבוצה אחת עם תרכובת של עניין בממס המוביל שלה ואחרת עם ספק ממס לבד (שליטה). החל טיפולים דומים ללעוג שליטה הזריק לבדיקה לתופעות לוואי של אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 4 ו -5 dpi הניתוח (שלב 5.5) ולרענן את המים ביצה או מים ביצה המכילים את התרכובת. </li></ol> 7. הדמיה ברזולוציה גבוהה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי את העוברים עם 0.02% (w / v) שנאגרו אסתר 3-aminobenzoic אתיל החומצה (Tricaine) במי ביצה 10 דקות לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מערכת טכנולוגיית הקרנת חוליות אוטומטית וסמפלר החלקיקים גדול פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את תמונות ההתייחסות המתאימות לגיל של העוברים מ&#39;הדמיה - האובייקט211; תפריט הגדרות איתור &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את כמות תמונות וכיוון שבוצע במערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית מ&#39;הדמיה - תמונות חנות אוטומטית &#39;בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת 96 היטב מלא בעוברים (משלב 5.6) לבעל הצלחת השמאלי של החלקיקים הדגם גדול, ולחץ על &quot;צלחת הפעל &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עובר הוא זוהה כראוי ומיקומו; תמונת הראש והזנב בנפרד עם CLSM באמצעות מטרה רגילות יבשה 10X ולתפור את התמונות לאחר מכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol><li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li>
<li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).</li>
<li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-associated+persistence+of+Staphylococcus+epidermidis+in+pericatheter+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).</li>
<li>Broekhuizen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).</li>
<li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-associated+infection%3A+locating+the+finish+line+in+the+race+for+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255 (2013).</li>
<li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).</li>
<li>Stoop, E. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model.%2C+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Disease Model., & Mechanisms. 4, 526-536 (2011).</li>
<li>Adatto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+system+for+the+rapid+collection+of+large+numbers+of+developmentally+staged+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248, 307-318 (2002).</li>
<li>Mathias, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+chronic+inflammation+caused+by+mutation+of+zebrafish+Hai1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1.</a> J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).</li>
<li>Henkel, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+%28Cyprinus+carpio%29+and+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li>
<li>Chang, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li>
<li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li>
</ol>

JS הוא הבעלים של מדעי החיים שיטות BV שמייצר מכשירים המשמשים במאמר זה.

המתודולוגיה התפוקה הגבוהה שתוארה במאמר זה מספקת צינור יעיל מהיר ועלות למסך מספר גבוה של עוברי דגים וזחלים עם סוגים שונים של זיהומים. שימוש בכלי הגידול הגדול במקום טנקי גידול בודדים או משפחה מסורתיים הקל על שליטה בתהליך ההשרצה ודור של מספר גדול יותר של ביצי סינכרוני. עם גרסה משופרת של מערכת מיקרו ההזרקה האוטומטית 7, ניתן להזריק עד 2,500 ביצים כמעט כולם באותו שלב התאים בתוך שעה 1. עם עדכונים אלה ותוכנה משופרת זה אפשרי להזריק יותר ביצים מאשר היה אפשרי בעבר שבו ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי סמים גדולים עם התפשטות חיידקים כהקריאו. אולם שיטה זו עדיין מוגבלת לחלמון הזרקה, מסלולי הזרקה אחרים לדוגמא שתוארו על ידי ברנארד ואח&#39;. (2012) 6, יהיו בתקווה להיות משולבים במערכת מיקרו ההזרקה האוטומטית בעתיד הקרוב. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; למרות שהשיטות אלה השוותה להקרנת דג הזברה, שזה יהיה שימושי עבור יישומים עם מיני דגים אחרים גם כן. לדוגמא, קרפיון הנפוץ כבר ציין שיש יתרונות למסכים בסמים. כמו דג הזברה, ביצים ועוברים בשלב מוקדם מקרפיון הנפוץ הם שקופות, אבל עם היתרון העיקרי של גודל שרצים הגדול של מאה אלפי ביצים ואת הזמינות של קווים טהורים המציעים רקע גנטי קבוע יותר 16. הניתוח של כמויות גדולות של עוברים נגועים נעשה עם זרם חלקיקים גדול תפוקה הגבוהה cytometer. מכשיר זה יכול למיין ניתח עוברים לתוך צלחות גם רב או צלחת פטרי שהופך אותו מתאים במיוחד לבדיקת מספרים גדולים של תרכובות. אם יש צורך בהדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, מאשר ההתקנה מותאמת באופן שזרימת חלקיקים הגדול cytometer הטכנולוגיה יכולה לשמש לטרום הקרנה ולאחר מכן לנתח את הדגימות במדיום שדרךלשים ברזולוציה גבוהה יותר. ניתן לעשות זאת באמצעות הטכנולוגיה חוליות אוטומטי הקרנת 17, 18. מכשיר זה יכול באופן אוטומטי לאסוף עובר חי או קבוע בין הודעה 2 ו -7 ימי הפריה מצלחת רב גם מיכל או בתפזורת, תמונה 360 ° דרך נימים באמצעות CLSM או מיקרוסקופ סטריאו ולהשליך שוב ב2 מכולות בתפזורת המאפשרות מיון ידני של העוברים מבוססים על התמונות מיקרוסקופיות. שיפורים עתידיים יאפשר המיון של העובר לאחר ההדמיה לתוך הצלחת גם רב, ולכן מה שמאפשר למסך באופן אוטומטי מספר הגדול של עוברים בודדים לאורך זמן עם CLSM. בהנחה שביישומים עתידיים במערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית יכולה גם להיות מחוברת לזרימה הגדולה של חלקיקי cytometer הטכנולוגיה ללא הצורך של זחלים מחלק לפני לתוך צלחות גם רב, יוביל למיון מתקדם יותר. מאמר זה מתאר את הקמתהאופטימיזציה של ד של התקנת תפוקה גבוהה ללמוד ס epidermidis ומ &#39; זיהום marinum כמודל לגילוי סמים. זה מוכיח שהתוצאה של חיידקים אלו מוזרקים לתוך החלמון תלוי בשלב ההתפתחותי של הביצים בזמן הזרקה. הזרקה מ &#39; marinum E11 בשלב תא 16-128 או זן M בשלב תא 16-64 מוביל לאותו דפוס הזיהום כזריקת הזנב וריד 2, 6. עם זאת הגדרה זו אינה מוגבלת להתפשטות של חיידקים פתוגנים בלבד. היא הוצגה לפני שניתן להזריק רובוט פתרונות המכילים DNA, RNA או morpholinos לtransgenesis, מחקרים על ביטוי גנים ולדפוק למטה, בהתאמה 13. יתר על כן, זה היה הראה כי התקנה זו היא גם שימושית לחקר התפשטות תאי הסרטן והגירה. לכן צינור זה מציג שיטה תכליתית למסכי תפוקה גבוהה של מגוון רחב של מנגנוני איתות בהקשרשל חסינות מולדת, הוחל למחלות זיהומיות והתפתחות הסרטן. ניתן לשלב במסכים אלה עם אחרים לגילוי תרופה אבל גם עם ניתוח של השפעות רעילות אפשריות של תרופות החלים מזוהות.

עד כה דג הזברה (Danio rerio) כבר נקבע בהצלחה כמודל יעיל ללמוד מגוון רחב של מחלות זיהומיות 1. עובר דג הזברה מציע ייחודי באפשרויות ההדמיה vivo בשל השקיפות והמספר הגדול של קווי כתב מהונדסים קיימים לבטא חלבוני ניאון שלהם. שילוב רב עוצמה זה מאפשר לעקוב אחר סוגי תאים חיסוניים שונים בזמן תוך אינטראקציה עם גורמי מחלה כגון Mycobacterium marinum, יחסית הקרובים ביותר של מ &#39; שחפת 2, או סטפילוקוקוס epidermidis, סיבתי העיקרית לזיהום קשור ביולוגי 3-5. מסלולים שונים של זיהום ניתן להשתמש בעוברי דג הזברה בהתאם למטרות של המחקר 6. אחד ממסלולי זיהום אלה הוא הזרקת חלמון של החיידקים. היתרון העיקרי של שיטה זו בהשוואה לאחרים הוא שinfecti החלמוןיכול להתבצע באופן אוטומטי באמצעות הזרקה רובוטית, צמצום משמעותי של זמן ההזרקה ומאפשר שחזור גבוה של הזיהום 7, 8. עבודה קודמת, תוך שימוש בדג הזברה כתפוקה גבוהה במערכת מודל vivo ללימוד ס epidermidis ומ &#39; זיהום marinum הראה כדי להצליח 7, 8. מערכת זו היא מסוגלת להקרין להתקדמות מחלה באמצעות הזרקה רובוטית חלמון של עוברים מוקדמים ושימוש בקריאת נתוני הקרינה כאמצעי לעומס החיידקים. בהסכם עם הרעיון הזה, התקנה זה כבר מותאם והקימה צינור תפוקה גבוהה יעיל ביותר עם הפוטנציאל ליצירת מספר גדול של עוברים נגועים homogenously ולעקוב אחר ההתקדמות של הזיהום במהלך הזמן לאחר טיפול עם מספר רב של תרכובות. עם ההתקנה הוקמה זה אפשרי לייצר עד 8,000 עוברי סינכרוני למסךלהתקדמות מחלה, עיבוד בדרך עד 2,500 עוברים לשעה זו. עוברים מסודרים מבוססים על עומס החיידקים שלהם באמצעות מערכת אוטומטית, מה שמבטיח קבוצות הומוגניות של זחלים נגועים. יתר על כן, כדי לאמת את ההתקנה, השפעות של התייחסות הידועה כדי למנוע את התקדמות מחלת השחפת ביונקים נבדקו על עוברים נגועים במ &#39; זן marinum E11 או זן M הארסי יותר 9. מחקר זה מתאר בפירוט את צינור התפוקה הגבוה שהוקם כדי להיות מסוגל לייצר מספר גדול של עוברים נגועים וניתוח בדיעבד של התקדמות החיידקים במהלך פיתוח ולאחר טיפול מתחם.

<table><tbody><tr><td>מידלברוק 7H10 אגר</td><td>BD Bioscience, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>מרק מידלברוק 7H9 BD</td><td>Bioscience, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>העשרת BBL Middlebrook חומצה אולאית אלבומין דקסטרוז קטלאז (OADC)</td><td>BD Bioscience, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>211886</td><td></td></tr><tr><td>העשרת BBL Middlebrook אלבומין דקסטרוז קטלאז (ADC)</td><td>BD Bioscience, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>L5542</td><td>ספקים מרובים</td></tr><tr><td>מרק LB</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>L3022</td><td>ספקים מרובים</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Bio-connect, Huissen, הולנד</td><td>16785.03</td><td>ספקים מרובים</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Bio-connect, Huissen, הולנד</td><td>25966.01</td><td>ספקים מרובים</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>P1754</td><td>ספקים מרובים</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone40</td><td>Calbiochem, סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>529504</td><td>ספקים מרובים</td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (טריקאין)</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sphaero-Q, Gorinchem, הולנד</td><td>S103</td><td>ספקים מרובים</td></tr><tr><td>מלח ים אוקיינוס מיידי</td><td>Sera Marin, היינסברג, גרמניה</td><td>5460</td><td></td></tr><tr><td>iSPAWN</td><td>Techniplast, Buguggiate, איטליה</td><td>iSPAWN</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקרו-הזרקה אוטומטית</td><td>Life Science Methods BV, ליידן, הולנד</td><td>מערכת</td><td></td></tr> <tr><td>מיקרו-הזרקה אוטומטיתמנתח וממיין חלקיקים של אובייקטים מורכבים XL (COPAS XL)</td><td>Union BioMetrica Inc., הוליסטון, מסצ'וסטס, ארה"</td><td></td><td></td></tr>ב <tr><td>טכנולוגיית סינון אוטומטית של בעלי חוליות BioImager (VAST BioImager)</td><td>Union BioMetrica Inc., הוליסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>VAST BioImager</td><td></td></tr><tr><td>LP Sampler</td><td>Union BioMetrica Inc., הוליסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב</td> סריקת לייזר קונפוקלית <td>LP Sampler</td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>מחט הזרקה 10 ומיקרו; m קוטר פנימי</td><td>Qvotek, מיסיסוגה, קנדה</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; marinum mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

דג הזברה הופך כלי רב ערך בשלב קליני של הקרנות גילוי סמים כמודל חיה שלמה עם אפשרויות הקרנת תפוקה גבוהה. הם יכולים לשמש כדי לגשר על הפער בין מבחני תא מבוסס בשלבים מוקדמים יותר ובאימות vivo במודלים של יונקים, צמצום, בדרך זו, מספר התרכובות שעברו לבדיקות במודלים של מכרסמים הרבה יותר יקר. לאור זאת, בכתב היד הנוכחי מתואר צינור תפוקה גבוהה חדש באמצעות דג הזברה כמערכת מודל בvivo לחקר Staphylococcus epidermidis וזיהום marinum Mycobacterium. הגדרה זו מאפשרת לדור והניתוח של מספר הגדול של עוברי סינכרוני נגוע homogenously. יתר על כן הגמישות של הצינור מאפשרת למשתמש ליישם פלטפורמות אחרות כדי לשפר את הרזולוציה של הניתוח בעת הצורך בקלות. שילוב של דג הזברה יחד עם te תפוקה גבוה החדשניchnologies פותח את תחום בדיקות סמים וגילוי לאפשרויות חדשות לא רק בגלל כוחו של שימוש במודל של בעלי חיים כולו, אלא גם בגלל המספר הגדול של קווים זמינים מהונדסים שניתן להשתמש בם כדי לפענח את אופן פעולה של תרכובות חדשות.

התוצאות הנוכחיות מראות כי צינור העברת נתונים הגבוה ללימודי ס epidermidis ומ &#39; זיהום marinum כבר נקבע בהצלחה ושניתן להארכה לדגמי זיהום אחרים. ראשית, השימוש בכלי הגדול רבייה (איור 1 א), המבוסס על המערכת שפורסמה על ידי אדטו et al. (2011) 11, מאפשר לייצר כמויות גדולות של ביצי סינכרוני באירועים בודדים והנותן שליטה גבוהה של תהליך ההשרצה. הבא כדי להיות מסוגל להזריק מספר גדול של עוברים בתקופה קצרה של זמן, גרסה משופרת של המערכת שפותחה בעבר מיקרו ההזרקה האוטומטית 7 הייתה בשימוש (איור 1 א). כדי להעריך שהיא שלב התפתחותי הטוב ביותר לזיהום חלמון, הזריקות עם ס &#39; epidermidis ומ &#39; marinum בוצע בכל השלבים השונים בין שלב תא 1 ו512, על פי התיאור שנעשה על ידי קימל et al. (1995) 12 </sup&gt;. זריקות עם 100 CFU ס epidermidis בין שלב 16 ו128 תא סיפק את דפוס הזיהום הטוב ביותר (איור 2). החיידקים התרבו בתוך החלמון במשך 3 ימים והתפשטו לתוך הגוף מ3 dpi ואילך. ביצוע זריקות לפני שלב 16 התא הוביל לתמותה גבוהה מ4 dpi, והזרקה לאחר שלב תא 256 הראה צמיחה בעיקר חיידקים בתוך החלמון עם כמעט כל חיידקים מתפשטים בתוך הגוף של העובר. כימות של נטל חיידקים בוצעה על ידי ניתוח עוצמת הקרינה באמצעות החלקיקים הגדולים cytometer זרימה כפי שתוארו על ידי ונמן et al. 8 (איור 3) (2013). תצפיות הראו כי שלב ההתפתחות האופטימלי לזריקה של 30 מ &#39;CFU הזרקת marinum היא בין 16-128 שלב תא למתח E11 (איור 4 א) ובין שלב תא 16-64 עם strai M האלים יותרn (איור 4). עוברים מוזרקים בשלבים אלה הראו התפתחות חיידקים בתוך החלמון והתפשטות החיידקים דרך העובר (איור 7). הידבקות בשני הזנים בשלבים מוקדמים יותר הציגה צמיחת חיידקים כללית ספציפיות מובילה את העוברים למות אחרי 4 dpi. מצד השני, בעוברים שהוחדרו בשלבים מאוחר יותר נטל חיידקים הוגבל לחלמון. בשלב הבא, presorting עם חלקיקים גדולים cytometer זרימה (איור 1) שנוצר קבוצות הומוגניות גדולות של דגים נגועים לא כולל עוברים שאינם נגועים או גבוה (5A דמויות ו6A). לאחר presorting, מ &#39; טופלו עוברים נגועים marinum עם ריפאמפיצין, תרופה נגד שחפת השורה ראשונה. מחקרים קודמים הראו כי טיפול עם ריפאמפיצין במינון של 200 מיקרומטר ביעילות מפחית מ &#39; זיהום marinum בדג הזברה 7, 13. לקחת advantagדואר של המספר הגדול של עוברים נגועים homogenously שנוצרו עם קצב העברת נתונים הגבוה התקנה, הטיפול עם מינונים שונים בוצעו. עוברים נגועים במ &#39; זן marinum M והתייחס ל48 שעות עם 12, 24, ו200 מיקרומטר ריפאמפיצין הראו כדי להפחית את הזיהום ביעילות mycobacterial באופן תלוי מינון (איור 5). לאור ההפחתה היעילה של הזיהום באמצעות ריפאמפיצין במינון של 200 מיקרומטר ריכוז זה שימש לניסויים העתידיים. בקנה אחד עם התוצאה הקודמת, לומד התקדמות נטל חיידקים באמצעות מ &#39; זן marinum E11 שעה הפחתת 24 משמעותית ואילך לאחר טיפול עם 200 מיקרומטר ריפאמפיצין נצפה (איור 6). יתר על כן, אם נדרש הדמיה בהגדלה גבוהה של עוברים אלה, הם יכולים להיות מוצג באופן אוטומטי בלוחות 96 היטב (איור 1 ג), ממקום שבי ניתן לנתח הדגימות באמצעותמערכת הטכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית עם החלקיקים הדגם גדול רכוב על גבי CLSM. מערכת הטכנולוגיה הקרנת החוליות אוטומטית עם סמפלר החלקיקים גדול היא מערכת שיכול להיות מותקן על גבי CLSM או מיקרוסקופ סטריאו. מכשיר זה מאפשר הטעינה של עובר לחיות או קבוע מצלחת 96 היטב או מיכל בתפזורת באופן אוטומטי דרך נימי זכוכית, וorientates את זה מול המצלמה בזווית הרצויה (למשל, גב או לרוחב). תמונות של העובר בכל האוריינטציות יכולות להתבצע עם המצלמה הלוח או עם CLSM חיצוני (איור 7). עוברים יהיו בהמשך הועברו במכלים המיוחדים לאיסוף או פסולת. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> איור 1. Outl ניסיוני הרגילהine. א) דגים בוגרים הם ביחד להזדווג, ביצים נאספות, מיושרת לתוך צלחת agarose ומוזרקת. ב &#39;) הביצים מוזרקות מודגרת על 28 מעלות צלזיוס ותהיה מראש מסודרים לטיפול תרופתי אפשרי. ג) ניתוח לאחר על ידי גדול חלקיקים לזרום cytometer ו / או דגם / חוליות טכנולוגיה חלקיקים גדולות אוטומטית הקרנה עם CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> איור 2. הקמת שלב התא הטוב ביותר עבור ס epidermidis חלמון הזרקה. עוברי דג הזברה הוזרקו בחלמון בשלבי התפתחותיים שונים 1-512 שלב תא עימו של ס &#39;100 CFU epidermidis. עוברים מוזרק בין 1nd 8 שלב תא הראה התפתחות חיידקים בחלמון ותמותה גבוהה מ4 dpi. עוברים מוזרק בין 16 ו128 שלב תא הראה התפתחות חיידקים בחלמון ובתוך הגוף החל מהשעה 3 dpi. עוברים מוזרק בין שלב 256 ו512 תא הראה הרבה התפתחות חיידקים בתוך החלמון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> איור 3. כימות של נטל חיידקים באמצעות זרימת חלקיקים גדולה cytometer. 100 של ס &#39;CFU epidermidis הוזרק לתוך החלמון של עוברי דג הזברה.) עד 5 dpi, בכל יום, קבוצות של 10 עוברים היו הומוגני ומצופים באופן ישיר, המציגות את הצמיחה המעריכית הממוצעת מבוססת על שני העתקים ביולוגיים (ברים שגיאה= SEM). ב &#39;) זרימת חלקיקים גדולה cytometer הניתוח מראה אותות הקרינה הממוצע מאינם מוזרק וס epidermidis הזריק עוברים. 30-160 עובר לכל מצב נותחו (סורגי שגיאה = SEM), אותיות שונות מצביעים על הבדלים משמעותיים סטטיסטיים בדרך אחד ANOVA ואחרי הבדיקה של Tukey שלאחר מעשה (P &lt;0.001), NS: מתאם לא הבדלים משמעותיים C) בין CFU ו. אות הקרינה ממוצעת של קבוצות של 10 ס epidermidis נגוע עוברים (ברים שגיאה = SEM). נתון זה שונה מנמן et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> איור 4. Establishment של שלב התא הטוב ביותר עבור מ &#39; marinum חלמון הזרקה. עוברי דג הזברה הוזרקו בכל שלבי ההתפתחות השונים 1-512 שלב תא עם 30 CFU של מ &#39; marinum E11 ומתח M., B) עוברים מוזרק משלב תא 1-8 הראו דומה מתפשט ותמותה עם שני הזנים.) עוברים מוזרקת בין שלב תא 16-128 עם זן E11 הראה היווצרות של גרנולומות וזיהום מערכתי תוך הזריקו אלה 256-512 שלב תא המשיך נטל חיידקים לתוך החלמון. ב &#39;) עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם זן M הראה היווצרות גרנולומה כמו מבנים וזיהום מערכתי ואילו אלה שהוחדרו מ128 לשלב תא 512 המשיכו נטל חיידקים לתוך החלמון . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo: תוכן width = &quot;5in&quot; עבור: src = /&gt; &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; src איור 5. טיפול של מ &#39; זיהום חריף marinum עם תרופה נגד שחפת קו ראשון. עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם 30 CFU של מ &#39; זן marinum M היה לרוץ דרך החלקיקים הגדולים לזרום cytometer ב3 dpi להיות מסודר בשתי קבוצות לאחר השלכת שאינה ו / או העוברים נגועים מאוד.) הקרינה של עוברי אדם בשני הקבוצות. עוברי B) שטופלו עם ריפאמפיצין (RIF ) ל48 שעות במינונים של 12, 24, ו200 מיקרומטר נותח ב 4 dpi; עומס החיידקים שלהם מצטמצם באופן משמעותי. C) פרופילי נציג Copas של עוברי מטופלים עם DMSO וריפאמפיצין במינונים של 12, 24, ו200 מיקרומטר ל24 שעות. עומס והפצת חיידקים מצויינים על ידי הפסגות האדומות. קו כחול מייצג את הפרופיל של האלמנט מסודרים (DPF 4 דואר דג הזברהmbryo) על ידי Copas. 60-90 עובר לכל מצב נותחו. כל נקודת נתונים מייצגת עובר בודד. ערכים הם ציינו ממוצע ± SEM. NS: הבדלים לא משמעותיים. ניתוח המובהקות סטטיסטיות של הבדלים בוצע על ידי דרך אחת ANOVA ואחריו מבחן posthoc של Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> איור 6. טיפול של מ &#39; זיהום כרוני marinum עם תרופה נגד שחפת השורה ראשונה. עוברים מוזרקים בין שלב תא 16-64 עם 30 CFU של מ &#39; זן marinum E11 היה לרוץ דרך זרימת חלקיקים הגדולה cytometer ב3 dpi להיות מסודר בשתי קבוצות לאחר השלכת העוברים נגועים מאוד לא ו / או.<html> א) הקרינה של עוברי אדם בשתי הקבוצות. ב &#39;) עוברים מטופלים עם ריפאמפיצין (RIF) ב200 מיקרומטר במהלך 4 ימים נותחו מראה הפחתה משמעותית של עומס החיידקים לאחר יום 1 של טיפול. 90 עובר לכל מצב נותחו. ערכים הם ציינו ממוצע ± SEM. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין נקודות של אותו הטיפול בזמן. * מצביע על הבדלים משמעותיים בקבוצת ביקורת. NS: הבדלים לא משמעותיים. ניתוח המובהקות סטטיסטיות של הבדלים בוצע על ידי דרך אחת ANOVA ואחריו מבחן posthoc של Tukey. (P &lt;0.05). איור ב &#39;) שונה מSpaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;Src =&quot; hres.jpg / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; איור 7. תוצאה של מ &#39; הזרקת חלמון marinum E11 הדמיה באמצעות טכנולוגיה הקרנת חוליות אוטומטית וCLSM. ערימת Confocal Z (תפרה 3 תמונות) של עובר 14 5 fli1-egfp dpi. התפשטות מראה עובר בשידור חי) של מ &#39; חיידקי marinum E11 (אדום) בכל גוף. B) עובר fli-egfp 5 dpi קבוע מראה M. חיידקי marinum E11 (אדום) בכל הגוף שיתוף לוקליזציה עם leucocytes (תכלת) זוהה על ידי L-plastin immunostaining 15.

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר מספר רב של עוברים של דג זברה (zebrafish) המדובקים בזיהום עבור בדיקת תרכובות בסריקה רחבה (high throughput), כדי לאפשר גילוי תרופות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי שימוש בכלי רבייה גדול כדי להשיג מספר רב של ביצי דג זברה סינכרוניות באירוע בודד. לאחר מכן, הביצים מסודרות בתוך רשת aros ומודבקות בחיידקים בתוך החלמון באמצעות מיקרו-מזרק אוטומטי.כאשר הזיהום התפשט בעוברים, הם עוברים מיון מקדים באמצעות ציטומטריה של זרימה לחלקיקים גדולים לפני הטיפול בתרופות. לבסוף, רמות העומס החיידקי בעוברים המזוהמים מנותחות לאחר הטיפול בתרכובות. לבסוף, מתבצע ניתוח ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של חוליות.סריקה אוטומטית ודגימה של חלקיקים גדולים משמשות להצגת השפעותיהם של תרכובות על הזיהום בפירוט רב יותר. היתרון המרכזי של שיטה זו על פני טכניקות קיימות, כגון הזרקות ידניות או ניתוח סריקת PIX, הוא שבאמצעותה ניתן להפיק כמות גדולה של עוברים שהושפעו באופן הומוגני, אותם ניתן לנתח בשיטות של תפוקה גבוהה (high throughput). כדי להכין אינוקולום של S epiderm, יש לבודד מספר מושבות בודדות מתוך צלחת של זן S epiderm, O 47 המכיל וקטור ביטוי של M cherry הגזור מ-A PW VW 180 9, ולהוסיף אותן למצע גידול.25 milliliters של LB מועשר ב-10 micrograms per milliliter של Chloramphenicol; דגרו למשך לילה ב-37 °C עד לשלב ה-midlog. למחרת, סובבבבו (centrifuge) מיליליטר אחד של התרבית ב-12,000 ×g למשך דקה אחת והשתמשו במיליליטר אחד של PBS סטרילי עם 0.3% v/v של β-mercaptoethanol כדי לשטוף את המשקע שלוש פעמים. מדדו את הצפיפות האופטית ב-OD 600 והשתמשו ב-2% w/v של polyvinylpyrrolidone 40 או PVP 40 ב-PBS כדי לדלל את תרחיף החיידקים עד ל-OD 600 השווה ל-0.3 או ל-1 × 10⁸ CFUs per milliliter.להכנת תרבית התבואה (inoculum) של M. meum, בודדים מספר מושבות בודדות משבט M או E 11 של M. meum המבטאים באופן יציב את וקטור ה-PS MT 3M cherry מתוך מצע Middlebrook 7H10 מאוורר, ומחדירים אותן ל-10 מיליליטר של ציר Middlebrook 7H9 המכיל 10% (נפח לנפח) של העשרה Middlebrook ADC בתוספת 50 מיקרוגרם למילליטר של היגרומיצין. מדגירים למשך לילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. למחרת, סובבים במערך צנטריפוגה מיליליטר אחד של התרבית ב-12,000 g למשך דקה אחת, ומשתמשים במיליליטר אחד של PBS סטרילי עם 0.3% (נפח לנפח) Tween 80 לשטיפת המשקע שלוש פעמים.מדוד את ה-OD 600 של תרחיף החיידקים ודלל אותו באמצעות 2% משקל לנפח PVP 40 ב-PBS עד ל-OD 600 של 0.3 או 0.3 × 10⁸ CFUs למילליטר. כדי להשיג ביצי דגי זברה, ה neuromuscular בלילה שלפני האיסוף, הנח מקסימום 50 נקבות של דגי זברה בתא התחתון של כלי רבייה גדול ו-70 זכרים בחלק העליון של הכלי. למחרת בבוקר, הסר את המפריד מהכלי. לאחר כשעה, אסוף את הביצים דרך אספן הביצים שבתחתית כלי הרבייה אל תוך מבחנה של 50 מיליליטר מלאה במי ביצים (egg water).לאחר הכנת לוחיות ההזרקה, בהתאם לפרוטוקול הטקסט בתוכנת ההפעלה של המיקרו-מזרק האוטומטי, לחצו על כיול הבמה (calibrate stage), ולאחר מכן לחצו על רשת בארות 10 24. מקמו את לוחית ה-aros במיקרו-מזרק, וכיילו את הלוחית על ידי לחיצה על המסך במרכז הבאר. לאחר מכן, עברו לתפריט המחטים ולחצו על כיול מחזיק המחט (calibrate needle holder).באמצעות קצה טעינה מיקרוסקופי (micro loader tip), מלאו מחט הזרקה בעלת קוטר של 10 מיקרון עם 10 µL של PVP 40 המכיל 100 CFUs לננוליטר של S epiderm, או 30 CFUs לננוליטר של erum, או PVP 40 לבד עבור הזרקות דמה (mock injections). מקמו את המחט במזרק המיקרוסקופי האוטומטי וכיילו את מיקום ה-XY על ידי הורדת המחט או הזזתה למעלה ולחיצה על המסך במיקום המחט. לאחר מכן, כיילו את מיקום ה-Z של המחט על ידי לחיצה על המסך במיקום קצה המחט. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת העברה פלסטית כדי לפזר את הביצים על גבי רשת ה-aros והסירו כל עודף של מי ביצים.לאחר מכן, מקמו את רשת ה-agros הממולאת בביצים במחשב המזריק המיקרוסקופי האוטומטי בתפריט ההזרקה, כווןנו את הגדרת לחץ ההזרקה ל-200 hPa, את זמן ההזרקה ל-0.2 שניות, ואת לחץ הפיצוי ל-15 hPa, המקביל לננולטר אחד בתפריט הגדרות ה-Femtojet. לחצו על inject all להזרקה לכל פלטת העוברים. אספו את הביצים על ידי שטיפתן בתוך פטריה והדגירו אותן בטמפרטורה של 28 °C.לאחר הגדרת ציטומטר הזרימה לחלקיקים גדולים, היכנסו לתפריט ה-PMT והגדירו את הערוץ האדום ל-650 volts ואת הערוצים הירוק והצהוב ל-zero volts. לאחר מכן, בתוך תפריט הספים (thresholds), הגדירו את אות סף הצפיפות האופטית ל-50, התואם ל-975 millivolts, ואת מינימום זמן המעוף (time of flight) ל-800, התואם ל-320 microseconds. כדי להפחית את השפעת השאריות, מקמו את העובריים בכוס הדגימה ובסיוע תפריט המיון הגדירו מקסימום של 70 עובריים למיון לכל פלטה על ידי הזנת המספר 70.הניחו צלחת פטרי ריקה תחת המיון ולחצו על מיון ידני (manual sort). כאשר צלחת הפטרי מלאה, שמרו את הנתונים על ידי לחיצה על שמירה (store). במידה ונדרשים ניתוח או דימות ברזולוציה גבוהה, ניתן למיין את העוברים באופן פרטני לבארים של פלטת 96 בארות.הניחו את העוברים בכלי הדגימה והגדירו מקסימום של עובר אחד למיון בכל באר. לאחר מכן, מקמו פלטת 96 בארות ריקה במחזיק הפלטות השמאלי ולחצו על fill plate. כאשר הפלטה תהיה מלאה, שמרו את הנתונים על ידי לחיצה על store כדי לנתח עוברים שעברו טיפול תרופתי שלושה ימים לאחר ההזרקה באמצעות erum.טפלו קבוצה אחת של עוברים בתרכובת הנחקרת המומסת בממסות ובקבוצה שנייה בממסות בלבד. מקמו את העוברים המטופלים, ארבעה וחמישה ימים לאחר ההפריה, בכוס הדגימה של ציטומטר הזרימה (flow cytometer), והגדירו את המיון ל-70 עוברים לצלחת לאחר הרדמת העוברים ב-trica והגדרת מערכת הסריקה האוטומטית של חולייתנים ודוגם החלקיקים הגדולים. בהתאם לפרוטוקול הטקסט של תפריט הגדרות זיהוי אובייקטים בדימות, בחרו את תמונות הייחוס התואמות לגיל העוברים בתפריט שמירת תמונות דימות אוטומטית, ובחרו את מספר התמונות שיוצרו ואת הכיוון שיש להשתמש בו.הניחו פלטת 96 בארות מלאה בעוברי עוברים במחזיק הפלטה השמאלי של דוגם החלקיקים הגדולים ולחצו על run plate. כאשר עוברי עוברים ממוקם נכון, השתמשו בעדשה יבשה רגילה בעלת הגדלה של 10x וצלמו את הראש והזנב בנפרד. לאחר מכן, השתמשו בתוכנה לעיבוד תמונה כדי לחבר את התמונות יחד כדי להעריך איזה שלב התפתחותי הוא המתאים ביותר להדבקה בחלמון.הזרקות של dermitis ו-marum בוצעו בכל השלבים השונים בין שלב התא הבודד לשלב 512 התאים. כפי שניתן לראות כאן, הזרקות של 100 CFU של dermitis שבוצעו בין שלב 16 התאים לשלב 128 התאים סיפקו את תבנית ההדבקה הטובה ביותר. החיידקים השתכפלו בתוך החלמון למשך שלושה ימים והתפשטו אל הגוף החל מהיום השלישי לאחר ההדבקה ואילך.כימות בעוצמה גבוהה של העומס החיידקי בוצע באמצעות ניתוח עוצמת פלואורסצנציה בעזרת ציטומטר זרימה לחלקיקים גדולים. כפי שמוצג כאן, כמות החיידקים החיים הנוכחים בתוך העובר תואמת היטב את האות הפלואורסצנטי שנמדד. איור זה מדגים כי השלב ההתפתחותי האופטימלי להזרקה של 30 CFUs של aminum הוא בין שלב 16 ל-128 תאים עבור זן E 11 ובין שלב 16 ל-64 תאים.בשימוש בזן EM virulent יותר, עוברים שהוזרקו בשלבים אלה הראו צמיחה בקטריאלית בתוך ה-oak והתפשטות של החיידקים דרך העובר. טיפול מקדים של עוברים נגועים ב-emerin בריכוזים שונים של rifampicin הראה הפחתה של הזיהום המיקובקטרי באופן תלוי מינון. שימוש בתרופה במינון של 200 micromolar הוכיח כי היא עשירה בעצירת התקדמות בקטריאלית של M mein E 11, החל מ-24 שעות לאחר הטיפול ובשלבים מאוחרים יותר לאחר התפתחותו.טכניקות אלו סללו את הדרך עבור חוקרים בתחום של בדיקת תרכובות ופיתוח תרופות, המחפשים טיפולים חדשים למחלות זיהומיות כגון שחפת או זיהומים הקשורים לחומרי בנייה ביולוגיים.

establishment-optimization-high-throughput-setup-to-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

תכנון תרופות המבוסס על מבנה ממלא תפקיד חשוב בפיתוח תרופה. רודף מטרות מרובות במקביל מגדיל מאוד את הסיכוי להצלחה לגילוי עופרת. המאמר הבא מדגיש עד כמה מרכז ג'נומיקס המבני סיאטל למחל זיהומיות מנצל גישה רב יעד לקביעת גן למבנה של שפעת PB2 מקטע.

גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

שילובים תרופתיים סינרגטי הם וממושכת לזהות את הנתונים באופן אמפירי. כאן נתאר שיטת זיהוי ואימות של מולקולות קטנות סינרגטי.

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

פרוטוקול זה נועד לתאר כיצד לחקור את היקף הפנמת Staphylococcus aureus ואת יכולתה לשרוד בתוך התא המארח האנושי, כמו גם את היעילות התאית של תרכובות מיקרוביאלית.

שיפור הגנה מפני אנזימים כדי לחקור הפנמת Staphylococcus aureus ויעילות תאית של תרכובות מיקרוביאלית

הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב להגדרת מודל עור פצוע ex vivo ovine הנגוע בסטפילוקוקוס אאורוס. מודל תפוקה גבוהה זה מדמה טוב יותר זיהומים in vivo בהשוואה לטכניקות מיקרוביולוגיה קונבנציונליות ומציג לחוקרים פלטפורמה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לבדיקת היעילות של מיקרוביאלים מתפתחים.

מודל חדשני של פצעי עור Ex Vivo Ovine בתפוקה גבוהה לבדיקת אנטיביוטיקה מתפתחת

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

בכתב יד זה, אנו מספקים פרוטוקול מקיף להערכת הישרדות אנטיביוטיקה עבור Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus, הפיכת פלסמידים ל - P. aeruginosa ו- S. aureus כדי ליצור זני כתב ולדמיין וריאנטים פנוטיפיים, כגון מתמידים, על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר.

הדמיית מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר של Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus פנוטיפים הטרוגניים

למדו שיטת זיהום אוטומטית של עוברי זברה פיש לבדיקת תרכובות בקנה מידה גבוה. השיטה מאפשרת גילוי תרופות יעיל נגד Staphylococcus epidermidis ו-Mycobacterium marinum.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד

גלה סרטונים נוספים