הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר מספר רב של עוברים של דג זברה (zebrafish) המדובקים בזיהום עבור בדיקת תרכובות בסריקה רחבה (high throughput), כדי לאפשר גילוי תרופות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי שימוש בכלי רבייה גדול כדי להשיג מספר רב של ביצי דג זברה סינכרוניות באירוע בודד. לאחר מכן, הביצים מסודרות בתוך רשת aros ומודבקות בחיידקים בתוך החלמון באמצעות מיקרו-מזרק אוטומטי.

כאשר הזיהום התפשט בעוברים, הם עוברים מיון מקדים באמצעות ציטומטריה של זרימה לחלקיקים גדולים לפני הטיפול בתרופות. לבסוף, רמות העומס החיידקי בעוברים המזוהמים מנותחות לאחר הטיפול בתרכובות. לבסוף, מתבצע ניתוח ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של חוליות.

סריקה אוטומטית ודגימה של חלקיקים גדולים משמשות להצגת השפעותיהם של תרכובות על הזיהום בפירוט רב יותר. היתרון המרכזי של שיטה זו על פני טכניקות קיימות, כגון הזרקות ידניות או ניתוח סריקת PIX, הוא שבאמצעותה ניתן להפיק כמות גדולה של עוברים שהושפעו באופן הומוגני, אותם ניתן לנתח בשיטות של תפוקה גבוהה (high throughput). כדי להכין אינוקולום של S epiderm, יש לבודד מספר מושבות בודדות מתוך צלחת של זן S epiderm, O 47 המכיל וקטור ביטוי של M cherry הגזור מ-A PW VW 180 9, ולהוסיף אותן למצע גידול.

25 milliliters של LB מועשר ב-10 micrograms per milliliter של Chloramphenicol; דגרו למשך לילה ב-37 °C עד לשלב ה-midlog. למחרת, סובבבבו (centrifuge) מיליליטר אחד של התרבית ב-12,000 ×g למשך דקה אחת והשתמשו במיליליטר אחד של PBS סטרילי עם 0.3% v/v של β-mercaptoethanol כדי לשטוף את המשקע שלוש פעמים. מדדו את הצפיפות האופטית ב-OD 600 והשתמשו ב-2% w/v של polyvinylpyrrolidone 40 או PVP 40 ב-PBS כדי לדלל את תרחיף החיידקים עד ל-OD 600 השווה ל-0.3 או ל-1 × 10⁸ CFUs per milliliter.

להכנת תרבית התבואה (inoculum) של M. meum, בודדים מספר מושבות בודדות משבט M או E 11 של M. meum המבטאים באופן יציב את וקטור ה-PS MT 3M cherry מתוך מצע Middlebrook 7H10 מאוורר, ומחדירים אותן ל-10 מיליליטר של ציר Middlebrook 7H9 המכיל 10% (נפח לנפח) של העשרה Middlebrook ADC בתוספת 50 מיקרוגרם למילליטר של היגרומיצין. מדגירים למשך לילה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס. למחרת, סובבים במערך צנטריפוגה מיליליטר אחד של התרבית ב-12,000 g למשך דקה אחת, ומשתמשים במיליליטר אחד של PBS סטרילי עם 0.3% (נפח לנפח) Tween 80 לשטיפת המשקע שלוש פעמים.

מדוד את ה-OD 600 של תרחיף החיידקים ודלל אותו באמצעות 2% משקל לנפח PVP 40 ב-PBS עד ל-OD 600 של 0.3 או 0.3 × 10⁸ CFUs למילליטר. כדי להשיג ביצי דגי זברה, ה neuromuscular בלילה שלפני האיסוף, הנח מקסימום 50 נקבות של דגי זברה בתא התחתון של כלי רבייה גדול ו-70 זכרים בחלק העליון של הכלי. למחרת בבוקר, הסר את המפריד מהכלי. לאחר כשעה, אסוף את הביצים דרך אספן הביצים שבתחתית כלי הרבייה אל תוך מבחנה של 50 מיליליטר מלאה במי ביצים (egg water).

לאחר הכנת לוחיות ההזרקה, בהתאם לפרוטוקול הטקסט בתוכנת ההפעלה של המיקרו-מזרק האוטומטי, לחצו על כיול הבמה (calibrate stage), ולאחר מכן לחצו על רשת בארות 10 24. מקמו את לוחית ה-aros במיקרו-מזרק, וכיילו את הלוחית על ידי לחיצה על המסך במרכז הבאר. לאחר מכן, עברו לתפריט המחטים ולחצו על כיול מחזיק המחט (calibrate needle holder).

באמצעות קצה טעינה מיקרוסקופי (micro loader tip), מלאו מחט הזרקה בעלת קוטר של 10 מיקרון עם 10 µL של PVP 40 המכיל 100 CFUs לננוליטר של S epiderm, או 30 CFUs לננוליטר של erum, או PVP 40 לבד עבור הזרקות דמה (mock injections). מקמו את המחט במזרק המיקרוסקופי האוטומטי וכיילו את מיקום ה-XY על ידי הורדת המחט או הזזתה למעלה ולחיצה על המסך במיקום המחט. לאחר מכן, כיילו את מיקום ה-Z של המחט על ידי לחיצה על המסך במיקום קצה המחט. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת העברה פלסטית כדי לפזר את הביצים על גבי רשת ה-aros והסירו כל עודף של מי ביצים.

לאחר מכן, מקמו את רשת ה-agros הממולאת בביצים במחשב המזריק המיקרוסקופי האוטומטי בתפריט ההזרקה, כווןנו את הגדרת לחץ ההזרקה ל-200 hPa, את זמן ההזרקה ל-0.2 שניות, ואת לחץ הפיצוי ל-15 hPa, המקביל לננולטר אחד בתפריט הגדרות ה-Femtojet. לחצו על inject all להזרקה לכל פלטת העוברים. אספו את הביצים על ידי שטיפתן בתוך פטריה והדגירו אותן בטמפרטורה של 28 °C.

לאחר הגדרת ציטומטר הזרימה לחלקיקים גדולים, היכנסו לתפריט ה-PMT והגדירו את הערוץ האדום ל-650 volts ואת הערוצים הירוק והצהוב ל-zero volts. לאחר מכן, בתוך תפריט הספים (thresholds), הגדירו את אות סף הצפיפות האופטית ל-50, התואם ל-975 millivolts, ואת מינימום זמן המעוף (time of flight) ל-800, התואם ל-320 microseconds. כדי להפחית את השפעת השאריות, מקמו את העובריים בכוס הדגימה ובסיוע תפריט המיון הגדירו מקסימום של 70 עובריים למיון לכל פלטה על ידי הזנת המספר 70.

הניחו צלחת פטרי ריקה תחת המיון ולחצו על מיון ידני (manual sort). כאשר צלחת הפטרי מלאה, שמרו את הנתונים על ידי לחיצה על שמירה (store). במידה ונדרשים ניתוח או דימות ברזולוציה גבוהה, ניתן למיין את העוברים באופן פרטני לבארים של פלטת 96 בארות.

הניחו את העוברים בכלי הדגימה והגדירו מקסימום של עובר אחד למיון בכל באר. לאחר מכן, מקמו פלטת 96 בארות ריקה במחזיק הפלטות השמאלי ולחצו על fill plate. כאשר הפלטה תהיה מלאה, שמרו את הנתונים על ידי לחיצה על store כדי לנתח עוברים שעברו טיפול תרופתי שלושה ימים לאחר ההזרקה באמצעות erum.

טפלו קבוצה אחת של עוברים בתרכובת הנחקרת המומסת בממסות ובקבוצה שנייה בממסות בלבד. מקמו את העוברים המטופלים, ארבעה וחמישה ימים לאחר ההפריה, בכוס הדגימה של ציטומטר הזרימה (flow cytometer), והגדירו את המיון ל-70 עוברים לצלחת לאחר הרדמת העוברים ב-trica והגדרת מערכת הסריקה האוטומטית של חולייתנים ודוגם החלקיקים הגדולים. בהתאם לפרוטוקול הטקסט של תפריט הגדרות זיהוי אובייקטים בדימות, בחרו את תמונות הייחוס התואמות לגיל העוברים בתפריט שמירת תמונות דימות אוטומטית, ובחרו את מספר התמונות שיוצרו ואת הכיוון שיש להשתמש בו.

הניחו פלטת 96 בארות מלאה בעוברי עוברים במחזיק הפלטה השמאלי של דוגם החלקיקים הגדולים ולחצו על run plate. כאשר עוברי עוברים ממוקם נכון, השתמשו בעדשה יבשה רגילה בעלת הגדלה של 10x וצלמו את הראש והזנב בנפרד. לאחר מכן, השתמשו בתוכנה לעיבוד תמונה כדי לחבר את התמונות יחד כדי להעריך איזה שלב התפתחותי הוא המתאים ביותר להדבקה בחלמון.

הזרקות של dermitis ו-marum בוצעו בכל השלבים השונים בין שלב התא הבודד לשלב 512 התאים. כפי שניתן לראות כאן, הזרקות של 100 CFU של dermitis שבוצעו בין שלב 16 התאים לשלב 128 התאים סיפקו את תבנית ההדבקה הטובה ביותר. החיידקים השתכפלו בתוך החלמון למשך שלושה ימים והתפשטו אל הגוף החל מהיום השלישי לאחר ההדבקה ואילך.

כימות בעוצמה גבוהה של העומס החיידקי בוצע באמצעות ניתוח עוצמת פלואורסצנציה בעזרת ציטומטר זרימה לחלקיקים גדולים. כפי שמוצג כאן, כמות החיידקים החיים הנוכחים בתוך העובר תואמת היטב את האות הפלואורסצנטי שנמדד. איור זה מדגים כי השלב ההתפתחותי האופטימלי להזרקה של 30 CFUs של aminum הוא בין שלב 16 ל-128 תאים עבור זן E 11 ובין שלב 16 ל-64 תאים.

בשימוש בזן EM virulent יותר, עוברים שהוזרקו בשלבים אלה הראו צמיחה בקטריאלית בתוך ה-oak והתפשטות של החיידקים דרך העובר. טיפול מקדים של עוברים נגועים ב-emerin בריכוזים שונים של rifampicin הראה הפחתה של הזיהום המיקובקטרי באופן תלוי מינון. שימוש בתרופה במינון של 200 micromolar הוכיח כי היא עשירה בעצירת התקדמות בקטריאלית של M mein E 11, החל מ-24 שעות לאחר הטיפול ובשלבים מאוחרים יותר לאחר התפתחותו.

טכניקות אלו סללו את הדרך עבור חוקרים בתחום של בדיקת תרכובות ופיתוח תרופות, המחפשים טיפולים חדשים למחלות זיהומיות כגון שחפת או זיהומים הקשורים לחומרי בנייה ביולוגיים.