הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד סטפילוקוקוס epidermidis ו Marinum Mycobacterium זיהום כמודל לגילוי תרופות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מספר רב של עוברי דגי זברה נגועים לבדיקת תרכובות בתפוקה גבוהה כדי לאפשר גילוי תרופות. זה מושג על ידי שימוש תחילה בכלי רבייה גדול כדי להשיג מספר גדול של ביצי דג זברה סינכרוניות באירוע אחד. לאחר מכן, הביצים מיושרות לרשת ארוס ונדבקות בחיידקים בחלמון באמצעות מזרק מיקרו אוטומטי.

כאשר הזיהום התפשט דרך העוברים, הם מטופלים על ידי ציטומטריית זרימת חלקיקים גדולים לפני שהם מטופלים בתרופות. לבסוף, רמות העומס החיידקי בעוברים נגועים מנותחות לאחר טיפול בתרכובת. בסופו של דבר, ניתוח ברזולוציה גבוהה באמצעות חוליות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

סינון אוטומטי ודגימת חלקיקים גדולים משמשים כדי להראות ביתר פירוט את ההשפעות שיש לתרכובות על הזיהום. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני טכניקות קיימות כמו הזרקות ידניות או ניתוח סריקת PIX, הוא שבעזרתה אנו יכולים לייצר כמות גדולה של עוברים מושפעים הומוגנית, אותם אנו יכולים לנתח בצורה תפוקה גבוהה. להכנת חיסון אפידרם S יש לבודד מספר מושבות בודדות מצלחת של זן אפידרם S, O 47 המכיל וקטור ביטוי דובדבן M PW פולקסווגן 180 9, ולחסן אותו.

25 מיליליטר LB בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר. כלורמפניקול דגירה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עד שלב האמצע למחרת, צנטריפוגה של מיליליטר אחד של התרבית ב-12,000 GS למשך דקה אחת והשתמש במיליליטר אחד של PBS סטרילי עם 0.3% נפח לנפח בין 80 כדי לשטוף את הגלולה שלוש פעמים. מדוד את הצפיפות האופטית ב-OD 600 והשתמש ב-2% משקל לנפח, פוליוויניל פרון 40 או PVP 40 ב-PBS כדי לדלל את תרחיף החיידקים ל-OD 600 השווה ל-0.3 או אחד כפול 10 לשמונה CFUs למיליליטר.

להכנת חיסון אמינום, יש לבודד מספר מושבות בודדות מזן M Meum M או E 11 המבטא ביציבות את וקטור הדובדבן PS MT 3M מאוורר Middlebrook 7 H 10 ולחסן 10 מיליליטר של מרק Middlebrook 7 H 9 המכיל 10% נפח לנפח. העשרה של מידלברוק A DC בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של היגרומיצין דגירה למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס למחרת. צנטריפוגה מיליליטר אחד של התרבית ב-12,000 GS למשך דקה אחת והשתמש במיליליטר אחד של PBS סטרילי עם 0.3% נפח לנפח בין 80 כדי לשטוף את הגלולה שלוש פעמים.

מדוד את ה-OD 600 של תרחיף החיידקים ועם 2% משקל לנפח. PVP 40 ב-PBS מדולל ל-OD 600 של 0.3 או 0.3 כפול 10 לשמונה CFUs למיליליטר כדי להשיג ביצי דגי זברה בלילה שלפני האיסוף, הנח מקסימום 50 נקבות דגי זברה בתא התחתון של כלי רבייה גדול ו-70 זכרים בחלק העליון של הכלי. למחרת בבוקר, הסר את המפריד מהכלי לאחר כשעה דרך אספן הביצים בתחתית כלי הרבייה, אסוף את הביצים לצינור של 50 מיליליטר מלא במי ביצים.

לאחר הכנת לוחות הזרקה, על פי פרוטוקול הטקסט בתוכנת ההפעלה האוטומטית של מזרק מיקרו, לחץ על כיול stagה, ולאחר מכן לחץ על 10 24. רשת באר והנח את צלחת הארוס במזרק המיקרו, כייל את הצלחת על ידי לחיצה על המסך במיקום המרכזי של הבאר. לאחר מכן עבור לתפריט המחט ולחץ על כיול מחזיק המחט.

בעזרת קצה מיקרו מעמיס מלאו מחט הזרקת קצה בקוטר 10 מיקרון ב-10 מיקרוליטר של PVP 40 המכילים 100 CFUs לננוליטר של אפידרם S, 30 CFUs לננוליטר של erum או PVP 40 בלבד להזרקות מדומה, הנח את המחט במזרק המיקרו האוטומטי וכיול את מיקום ה-XY על ידי הורדה או הזזת המחט כלפי מעלה ולחיצה על המסך במיקום המחט. לאחר מכן כייל את מיקום Z של המחט על ידי לחיצה על המסך במיקום קצה המחט. לאחר מכן, השתמש בפיפטה להעברה מפלסטיק כדי לפזר את הביצים על רשת ה-aros ולהסיר עודפי מי ביצים.

לאחר מכן הניחו את רשת האגרוס המלאה בביצים במזרק המיקרו האוטומטי בתפריט ההזרקה, התאימו את הגדרת לחץ ההזרקה ל-200 דונם פסקל את זמן ההזרקה ל-0.2 שניות, ואת לחץ הפיצוי ל-15 הקטור פסקל, המתואם עם ננוליטר אחד בתפריט הגדרות הסילון של Femto. לחץ על להזריק הכל ולהזריק את כל צלחת העוברים לאחר ההזרקה. אוספים את הביצים על ידי שטיפתן בצלחת פטרי ומדגרים אותן בחום של 28 מעלות צלזיוס.

לאחר הגדרת ציטומטר זרימת החלקיקים הגדול, היכנס לתפריט PMT והגדר את הערוץ האדום ל-650 וולט ואת הערוצים הירוקים והצהובים לאפס וולט. לאחר מכן, בתפריט הסף, הגדר את אות סף הצפיפות האופטית ל -50, המתאים ל -975 מילי-וולט ואת זמן הטיסה המינימלי ל -800, המתאים ל -320 מיקרו שניות. על מנת להפחית את השפעת הפסולת, הניחו את העוברים בכוס הדגימה ובתפריט המיון כדי למצוא את המקסימום של 70 עוברים לצלחת למיון על ידי הזנת 70.

מניחים צלחת פטרי ריקה מתחת לממיין ולוחצים על מיון ידני. כאשר צלחת הפטרי מתמלאת, שמור את הנתונים על ידי לחיצה על חנות. אם נדרש ניתוח או הדמיה ברזולוציה גבוהה, ניתן למיין עוברים בנפרד לבארות של צלחת 96 בארות.

הניחו את העוברים בכוס הדגימה והגדירו את המקסימום של עובר אחד לכל באר למיון. לאחר מכן מקם צלחת ריקה של 96 בארות לתוך מחזיק הצלחת השמאלית ולחץ על לוחית המילוי. כאשר הצלחת מתמלאת, שמור את הנתונים על ידי לחיצה על החנות כדי לנתח עוברים שטופלו בתרופות שלושה ימים לאחר ההזרקה עם ארום.

טפל בקבוצה אחת של עוברים עם תרכובת מעניינת בממס ובקבוצה שנייה עם ממס בלבד. הנח את העוברים המטופלים ארבעה וחמישה ימים לאחר ההפריה בכוס הדגימה על ציטומטר הזרימה והגדר את המיון ל-70 עוברים לצלחת לאחר הרדמת עוברים בטריקה, והקמת מערכת הסינון האוטומטית של בעלי החוליות ודגימת חלקיקים גדולים. על פי פרוטוקול הטקסט מתפריט ההגדרה לזיהוי אובייקטי הדמיה, בחר את תמונות ההתייחסות המתאימות לגיל העוברים בתפריט האחסון האוטומטי של תמונות ההדמיה, בחר את מספר התמונות שייווצרו ואת הכיוון שבו יש להשתמש.

הנח צלחת 96 באר מלאה בעוברים לתוך מחזיק הצלחת השמאלית של דוגם החלקיקים הגדול ולחץ על צלחת ההפעלה. כאשר העובר ממוקם נכון, השתמש במטרה יבשה רגילה פי 10 ודמיין את הראש והזנב בנפרד. לאחר מכן השתמש בתוכנת עיבוד תמונה כדי לתפור את התמונות יחד כדי להעריך איזה שלב התפתחותי הוא הטוב ביותר לזיהום בחלמון.

הזרקות עם דרמיטיס ומרום בוצעו בכל השלבים השונים בין שלב התא האחד לשלב 512. כפי שניתן לראות כאן, זריקות עם 100 CFU של דרמיטיס שבוצעו בין שלב 16 ל-128 תאים סיפקו את דפוס הזיהום הטוב ביותר. החיידקים התרבו בתוך החלמון במשך שלושה ימים והתפשטו לגוף משלושה ימים לאחר ההדבקה ואילך.

כימות תפוקה גבוהה של עומס חיידקים בוצע על ידי ניתוח עוצמת הקרינה באמצעות ציטומטר זרימת חלקיקים גדולים. כפי שמוצג כאן, כמות החיידקים החיים שנמצאים בתוך העובר תואמת היטב את האות הפלואורסצנטי שנמדד. איור זה מדגים כי השלב ההתפתחותי האופטימלי להזרקת 30 CFUs של אמינום הוא בין שלב 16 ל-128 תאים עבור זן E 11 ובין שלב 16 ל-64 תאים.

עם זן EM אלים יותר, עוברים שהוזרקו בשלבים אלה הראו צמיחת חיידקים בתוך האלון והתפשטות החיידקים דרך העובר. לאחר טיפול בעוברים נגועים באמרין עם ריכוזים שונים של ריפמפיצין הראה הפחתה של הזיהום המיקובקטריאלי באופן תלוי מינון. שימוש בתרופה במינון של 200 מיקרומולר הוכיח כי היא עצרה ביעילות את התקדמות החיידקים של M mein E 11, 24 שעות ואילך לאחר הטיפול לאחר התפתחותה.

טכניקות אלו סללו את הדרך לחוקרים בתחום בדיקת תרכובות ופיתוח תרופות, שחיפשו טיפולים חדשים למחלות זיהומיות כגון שחפת או זיהומים הקשורים לחומרים ביולוגיים.