פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לפתח ולאפיין תאים דנדריטיים טולרוגניים של עכברים להערכת התועלת האימונותרפית שלהם בטיפול בהפרעות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול בתאים דנדריטיים טולרוגניים על ידי מתן שיטה סטנדרטית לפיתוח ואפיון תפקודי של תאים דנדריטיים טולרוגניים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן להשתמש בה להתפתחות מוצלחת של תאים דנדריטיים טולרוגניים ולבדיקת יעילות תפקודית של תאים דנדריטיים טולרוגניים.

ההשלכות של טכניקה זו הן משמעותיות. הם מתרחבים לקראת פיתוח אימונותרפיה תאית להפרעות אוטואימוניות, שכן תאים דנדריטיים טולרוגניים יכולים לאפס תגובה חיסונית חריגה תוך שהם נשארים כפופים למנגנוני ויסות חיסוניים מהותיים. לאחר קצירת עצמות הרגל האחורית מעכברי C57BL/6 בני שמונה עד 10 שבועות, על פי הפרוטוקולים הסטנדרטיים, השתמשו בלהבים ובמלקחיים כירורגיים כדי לנתח כמה שיותר רקמות ולהניח את השוקה ועצם הירך הנקיים בצלחת תרבית של שישה סנטימטרים המכילה 70% אתנול.

חתוך את שני קצוות העצמות בעזרת להב כירורגי והשתמש במזרק של שלושה מיליליטר, המצויד במחט בגודל 23, כדי לשטוף את המח מהעצם הראשונה עם שלושה מיליליטר PBS לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. כאשר כל מח העצם נאסף, צנטריפוגה את תרחיף התאים והשהה מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות. לאחר חמש דקות, עצרו את הליזיס עם תשעה מיליליטר PBS ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את כדור תאי מח העצם הלבן ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית וסנן את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור חדש. התאם את התאים לריכוז אחד של 10 עד שישי תאים למיליליטר במדיום תרבית בתוספת GM-CSF ו-IL-4. וצלחת שלושה מיליליטר תאים לכל באר של צלחת של 6 בארות למשך שלושה ימים של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

ביום השלישי יש לשטוף את התאים בכל באר עם שני מיליליטר PBS ומערבולת עדינה להסרת התאים שאינם דבקים. לאחר מכן האכילו את התאים בשלושה מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת GM-CSF ו-IL-4 והחזירו את התאים לחממת תרבית התאים, והוסיפו עוד שלושה מיליליטר של מדיום תרבית טרי, בתוספת ציטוקינים לכל באר לאחר יומיים. ביום השביעי של התרבות, הניחו את הצלחת על קרח.

לאחר 10 דקות, פיפטה בעדינות את מדיום התרבית בכל באר כדי לעקור את התאים הדנדריטים הדבקים באופן רופף, לא בשלים, שמקורם במח העצם לתרחיף. לאחר מכן, אסוף את התאים לאיסוף על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בנפח המתאים של מדיום תרבית טרי לניתוח בהמשך הזרם. כדי למדוד את התפשטות תאי ה-T הסינגניים, השתמש תחילה בקצה האחורי של בוכנה של מזרק של שלושה מיליליטר כדי לרסק טחול מעכבר OT2 C57BL/6 בן שמונה עד 10 שבועות דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר ולשטוף את המסננת עם PBS.

גלולה את תרחיף התאים המאוגד על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה ב-400 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים ו-100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ביוטין חיובי CD4 בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. בתום הדגירה, הוסיפו לתאים 300 מיקרוליטר של מאגר מיון ו-200 מיקרוליטר של חרוזי אנטי-ביוטין למשך 10 דקות, ארבע מעלות צלזיוס והניחו עמוד חרוז מגנטי ומסנן הפרדה מראש למגנט הפרדת תאים בגודל מתאים. שוטפים את העמודה בשלושה מיליליטר של מאגר מיון ומוסיפים תשעה מיליליטר של מאגר מיון לתאים.

לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את התא ואת כדור החרוז בשלושה מיליליטר של מאגר מיון והוסיפו את תרחיף התא לעמודה כדי לאסוף את תאי ה-T החיוביים CD4 במיכל מתאים. לאחר מכן שטפו את העמוד עם עוד שלושה מיליליטר של מאגר מיון, אספו את הזרימה והניחו את תאי ה-T על קרח. לבידוד תאים דנדריטיים של מחבת טחול סינגנית, הנח את הטחול מעכבר C57BL/6 בן שמונה עד עשרה שבועות בצלחת תרבית של שישה סנטימטרים והשתמש במזרק מיליליטר אחד, המצויד במחט בגודל 25, כדי להזריק מיליליטר אחד של תמיסת קולגנאז D לטחול פעמיים.

לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את הטחול לחתיכות קטנות ולדגור את החלקים בניעור בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות. בתום הדגירה, הוסף 500 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולארי לתמיסת הרקמות לדגירה אחרונה של חמש דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, השתמש בקצה האחורי של בוכנת מזרק של שלושה מיליליטר כדי לרסק את תמיסת הטחול דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים, 50 מיקרוליטר של מגיב חוסם קולטן Fc, ו-100 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים של תאים דנדריטיים למשך 10 דקות דגירה בארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, שטפו את התאים בתשעה מיליליטר של מאגר מיון והשעו מחדש את הגלולה ב-800 מיקרוליטר של מאגר מיון טרי עם 200 מיקרוליטר של חרוזי אנטי-ביוטין בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לבידוד אוכלוסיית התאים הדנדריטים של הטחול על ידי מיון חרוזים מגנטיים, כפי שהודגם זה עתה. השעו מחדש את התאים בריכוז כפול 10 עד החמישי למיליליטר וטפלו בהם בריכוז הניסיוני המתאים של הטריטרפנואיד המעניין למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.

במהלך השליש האחרון של הדגירה, השעו מחדש את תאי ה-T בריכוז של 10 פעמים 10 עד 7 תאים למיליליטר ב-CFSE מיקרו-מולרי אחד למשך 15 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS והתאימו מחדש את הנפח לריכוז סופי של פעמיים כפול 10 לתאי ה- T השישי למיליליטר. תרבית משותפת של 100 מיקרוליטר של התאים הדנדריטים המטופלים עם 100 מיקרוליטר של תאי T חיוביים CD4 המסומנים ב-CFSE בכל באר של צלחת של 96 בארות והוספת 100 ננוגרם למיליליטר של פפטיד OVA 323-329 לתאים, תוך מדידת עוצמת ה-CFSE של תאי ה-T על ידי זרימה ציטומטרית לאחר יומיים-שלושה של דגירה.

תאי אב של מח עצם שגודלו במדיום שלם, בנוכחות GM-CSF ו-IL-4, מציגים מורפולוגיה של תאים דנדריטיים לא בשלה לאחר שישה ימים בתרבית. ניתוח של תאים דנדריטיים לא בשלים שמקורם במח עצם ביום השביעי חושף את הביטוי החזק של CD11c, סמן ספציפי של תאים דנדריטיים בעכברים, על ידי רוב התאים המתורבתים. למרות חוסר ההשפעה על ביטוי סמני התבגרות המושרים על ידי LPS, תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם מציגים פרופיל תאים דנדריטי טולרוגני בתגובה לטיפול ב-CDDO-DFPA כפי שמעיד ירידה משמעותית בביטוי גנים פרו-דלקתיים וביטוי גן ציטוקינים אנטי דלקתי משופר, גם לאחר גירוי LPS.

בנוסף, נצפתה ירידה משמעותית בשגשוג תאי T סינגניים ספציפיים ל-OVA בתרביות מבחנה שבהן OVA מוצג על ידי תאים דנדריטיים שטופלו ב-CDDO-DFPA וב-vivo כפי שמעידה התקדמות מאוחרת לדלקת מוח אוטואימונית ניסיונית לאחר הזרקת תאים דנדריטיים שטופלו ב-CDDO-DFPA בפולסים של MOG, מה שמאשר עוד יותר את הפנוטיפ הטולרוגני של תאים אלה. לאחר שליטה בטכניקה זו, ניתן לפתח תאים דנדריטיים טולרוגניים תוך שמונה ימים, אם הניסויים מבוצעים כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שתאים דנדריטיים טולרוגניים אינם הומוגניים.

הפנוטיפ התאי שלהם תלוי באופי החומרים המשמשים לאינדוקציה של הסובלנות שלהם. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח ציטומטרי זרימה מפורט, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי אנרגיית תאי T ספציפיים לאנטיגניים המושרה על ידי תאים דנדריטיים טולרוגניים או אפופטוזיס או היכולת של התמיינות תאי T. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח תאים דנדריטיים טולרוגניים פעילים פונקציונלית באמצעות חומרים ידועים או כיצד לבדוק את יכולתם של חומרים חדשים לגרום לתאים אלה.