Name: פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: חקור פיתוח ואפיון תאים דנדריטים טולרוגניים מעכברי C57BL/6 לטיפול במחלות אוטואימוניות כמו טרשת נפוצה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת יעילות תאים לטיפול תאי אימונותרפי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ריאטה תרופות על מתן CDDO-DFPA. אנו גם להכיר את התמיכה של ג'יין, לי כיסא זיידמן בחדשנות סרטן בילדים (ג'ון Letterio). עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה [W81XWH-12-1-0452]; יוזמת המחקר אנג'י פאולר המתבגר ויאנג של סרטן מבוגרים, בכל מקרה מקיף במרכז לחקר הסרטן; ופרס קלהאן בוגר מלומד עבור מצב Hsi-ג'ו ווי מקרן F.J. קלהאן.

כל מחקרים בוצעו בהתאם הליכים שאושרו על-ידי את Case Western Reserve הספר לרפואה של אוניברסיטת של אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. מכינים תאים דנדריטים הנגזרות מח העצם (BMDCs)
<ol><li>לעקר את כל מכשירי הניתוח באמצעות autoclaving, לבצע את הניסוי ב- class II בטיחות ביולוגית ארון עם נהלי בטיחות הופקעו.</li>
	<li>המתת חסד C57BL/6 עכברים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לסלק עצמות השוקה-שוקית, עצם הירך באמצעות מספריים כירורגיים ולמקם אותם עם 70% אתנול בצלחת תרבות 10 ס מ.</li>
	<li>השתמש להבים כירורגי, מלקחיים לנתח רקמות משם ככל האפשר על המכסה של 10 ס מ תרבות מאכל ובידוד tibias ועצמות ירך כדי למקם אותם עם 70% אתנול בצלחת תרבות 6 ס מ.</li>
	<li>השתמש להבים כירורגי כדי לקצץ בשני הקצוות של tibias ועצמות ירך. השתמש 3 מ"ל PBS במזרק 3 מ עם מחט 23 גרם לרוקן את התוכן של מח מקצה אחד של עצמות כדי צינור חרוטי המכיל 12 ml PBS. חזור על שלב 3 x בכל קצה של עצמות.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב g x 300 במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא עם 1 מ"ל ACK מאגר lysing במשך 5 דקות להסיר תאי דם אדומים.</li>
	<li>להוסיף 9 מ ל PBS לדלל מאגר lysing ACK, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בינונית תרבות 10 מ"ל (RPMI-1640 פלוס -גלוטמין, 10% FBS, חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1% (100 x), 10 מ מ HEPES, 50 ננומטר β-mercaptoethanol ו- 5% פניצילין/סטרפטומיצין). הערה: רמת אנדוטוקסין חייב להיות פחות מ 0.1 האיחוד האירופי/מ ל FBS.</li>
	<li>לעבור התליה תא דרך מסננת תא 40 μm לקחת 20 µl תא השעיה, לערבב עם µl 80 של trypan כחול כדי לספור את מספר תאים חיים על-ידי שימוש cytometer.</li>
	<li>התאם מספר תאים לעונה 1 פרק 106 תאים למ"ל ng/ml 15 GM-CSF, 10 ננוגרם למ"ל IL-4.</li>
	<li>צלחת 3 מ"ל של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל בבאר בכל צלחת 6-ובכן, דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% הלחות בחממה2 CO. הערה: תאי מח העצם של עכבר אחד הוא סביב 3-5 x 107 תאים, המציין כי זה יכול להיות ממוקם 2 כדי 3 צלחות 6-. טוב.</li>
	<li>ביום 3, הסר כל 3 מ ל תרבות בינוני מכל קידוח, להוסיף PBS טריים 2 מ"ל כל היטב, ואז בעדינות מערבולת את הצלחת כדי להבטיח הסרת כל התאים שאינם מחסידי.</li>
	<li>החלף בינוני תרבות טריים 3 מ ל 15 ננוגרם למ"ל GM-CSF ו 10 ננוגרם למ"ל IL-4 כל היטב. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% הלחות בחממה2 CO.</li>
	<li>יום 5, ישירות להוסיף עוד 3 מ"ל טריים תרבות בינוני עם 15 ננוגרם למ"ל GM-CSF ו 10 ננוגרם למ"ל IL-4 מכל קידוח. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ו- 95% הלחות בחממה2 CO. הערה: הנפח הכולל כל היטב זה עכשיו 6 מ.</li>
	<li>יום 7, לשים את הצלחת על קרח במשך 10 דקות. בעדינות pipette המדיום תרבות בבאר כל מכך באופן רופף-כנצרות BMDCs כמו iDCs לתוך ההשעיה. הערה: המקרופאגים חסיד עדיין מחוברים לצלחת. טמפרטורה נמוכה ובעדינות ההליכים הם המפתח כדי למנוע DC הפעלה להשפיע עוד ניסויים.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב g x 300 במשך 5 דקות, resuspend טריים בינונית תרבות לניסויים נוספים. הערה: BMDCs יכול להיות מזוהה עם התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוגדן CD11c על ידי cytometry זרימה, הראנו את האסטרטגיה שלנו חסימה של BMDCs לניסויים נוספים באיור1.</li>
</ol>2. איפיון TolDC ג'ין ופרופיל חלבון
<ol><li>צלחת ml 2 של עונה 1 פרק 106 BMDCs/ml לכל באר היטב 6-צלחת עם תרבות במדיום נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA עבור המקננת h 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% הלחות בחממה2 CO. הערה: CDDO-DFPA, triterpenoid סינתטי, מהווה גורם גרעיני (נגזר erythroid 2) - כמו - 2 פקטור (Nrf2) משרן והמעכב הפקטור הגרעיני-κB (NF-κB). להחיל סוכנים אחרים עבור אינדוקציה של TolDCs מתוך iDCs, כגון IL-10, ויטמין D3, דקסמתזון או מפרץ 11-7085, ולשנות את שלב זה כדי תנאי האופטימלי עבור כל סוכן.</li>
	<li>להוסיף 10 או 100 ננוגרם למ"ל של LPS עבור המקננת 4-24 שעות כדי לגרום mDCs (זמן הדגירה היא שונה בשל מדידה mRNA או חלבון).</li>
	<li>בעדינות pipette המדיום תרבות בבאר כל ולקצור התליה תא באמצעות פיפטה 1 מ"ל. צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דקות לאסוף את התאים ואת תגובת שיקוע, בהתאמה.</li>
	<li>לנתח את ליגנדים משטח של כדורי תא ידי cytometry זרימה, כגון ליגנדים מופחתים: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL או מעכבות ליגנדים: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.</li>
	<li>לבודד את הרנ א מ כדורי תא ולנתח את ה-RNA ודוגמאות supernatant עבור ציטוקין פרופיל, גנים וחלבונים הרמות על ידי PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR) ואליסה, בהתאמה. הערה: לדוגמה, ציטוקינים דלקתיים: TNF-α, IFNγ, ציטוקינים EDN-1, IL-6, IL-12, ו- IL-23 או אנטי דלקתיות: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1, הו-1.</li>
</ol>3. להעריך את תפקוד TolDCs במבחנה , In Vivo
<ol><li>
תא T התפשטות Syngeneic Assay
	<ol>
<li>לעקר את כל מכשירי הניתוח באמצעות autoclaving, לבצע את הניסוי ב- class II בטיחות ביולוגית ארון עם נהלי בטיחות הופקעו.</li>
		<li>להכין מאגר MACS באמצעות 0.5% אלבומין שור (BSA) ו- 2 מ מ EDTA 500 מ"ל PBS. לעקר את המאגר על-ידי סינון דרך מסנן 0.2 µm. הערה: לשמור על המאגר על הקרח במהלך הניסוי הבא.</li>
		<li>כדי להשיג CD4+ T תאים, המתת חסד OT-II T-cell קולטן (TCR) העכברים הטרנסגניים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לבודד את הטחול מהצד השמאלי של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים וחדים.</li>
		<li>הכניסו את הטחול עם 2 מ"ל PBS לצלחת תרבות 6 ס מ ולהשתמש האחורי של דחיפה-מקל של מזרק 3 מ"ל מינצ הטחול על-ידי העברת מסננת תא 40 μm.</li>
		<li>לאסוף את ההשעיה תא צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 400 μl מאגר מקינטוש.</li>
		<li>להוסיף 100 μl של CD4+ תא T ביוטין-נוגדן קוקטייל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. הערה: קוקטייל הנוגדן נקשר על סוגי תאים אחרים מלבד CD4+ T תאים, כגון CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, אנטי-MHC class II, טר-119, TCRγ/אלפא.</li>
		<li>הוסף μl 300 MACS מאגר μl 200 של חרוזים אנטי ביוטין (טבלה של חומרים) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
		<li>מקום חיבר העמודה של הספירות פרומגנטי (טבלה של חומרים) ומסנן הכנה להפרדות צבע ביחד על המגנטי שדה, לשטוף אותו עם 3 מ"ל של מאגר מקינטוש.</li>
		<li>מוסיפים 9 מ של מקינטוש מאגר התאים ואת צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של מאגר MACS, החל על העמודה. לאסוף זרימה דרך CD4 המכיל+ T תאים.</li>
		<li>לשטוף את העמודה עם עוד 3 מ"ל של מקינטוש מאגר ולאסוף גם את הזרימה דרך.</li>
		<li>כדי להשיג DCs פאן הטחול, המתת חסד C57BL/6 עכברים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לבודד את הטחול מהצד השמאלי של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים וחדים. הכניסו את הטחול לצלחת תרבות 6 ס"מ המכילה 2 מ"ל של פתרון collagenase D (2 מ"ג/מ"ל collagenase D מומס HBSS המכילים סידן, מגנזיום).</li>
		<li>להזריק 1 מ"ל collagenase D לפתרון הטחול פעמיים עם מזרק 1 מ"ל, מחט 25 גרם. לחתוך הטחול לחתיכות קטנות עם מספריים קטנות.</li>
		<li>לנער, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 25 דקות.</li>
		<li>להוסיף 500 μl של 0.5 M EDTA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הערה: השלבים של 3.1.13-3.1.14 הם קריטיים להגדלת היבול של בקרי תחום.</li>
		<li>כעת להשתמש האחורי של דחיפה-מקל של מזרק 3 מ"ל מינצ slurry את הטחול על-ידי העברת מסננת תא 40 μm ולאסוף התליה תא על-ידי צריך שתוציאו ב g x 300 במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 350 μl של מקינטוש מאגר, 50 μl של ה-FcR חסימת ריאגנט μl 100 של פאן הדנדריטים תאים ביוטין-נוגדן קוקטייל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הערה: נוגדן קוקטייל נגד אנטיגנים זה אינם מבוטאים על-ידי בקרי.</li>
		<li>לשטוף את התאים על-ידי הוספת 9 מ של מאגר MACS, צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב- 800 μl MACS המאגר ולהוסיף 200 μl של אנטי ביוטין חרוזים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.</li>
		<li>חזור על השלבים של 3.1.9-3.1.11 כדי לאסוף DCs.</li>
		<li>לשטוף עמודה עם עוד 3 מ"ל של מקינטוש מאגר פעמיים, גם לאסוף את הזרימה דרך.</li>
		<li>לפנק את 2 x 105 Dc/ml נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA ב C ° 37 עבור 1 מר בנפרד, תווית CD4+ תאי T (1 x 107/ml) עם 1 μM CFSE ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, לשטוף עם PBS , והתאם את עוצמת הקול כדי להשיג ריכוז סופי 2 x 106 T תאים/מ ל....</li>
		<li>בשלב הבא, בצלחת 96-ובכן, בשיתוף תרבות 100 μl של התאים הדנדריטים שטופלו באותו אמצעי אחסון של CD4 התווית על-ידי CFSE+ T תאים, שניהם שנאסף על השלבים שלעיל כדי לקבל 1:10 יחס. עכשיו להוסיף 100 ננוגרם למ"ל אובלבומין (פשוט) פפטיד 323-329 לכל טוב, למדוד עוצמת CFSE של תאי T על ידי cytometry זרימה לאחר 2-3 ימי דגירה. הערה: את מספרי הטלפון הנייד ואת יחס של DCs ו- T תאים מוטבו מן העבודה הקודמת שלנו37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זירוז פסיבית EAE באמצעות הזרקת BMDCs פעמו עם מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) (35-55)
	<ol>
<li>צלחת ml 2 של עונה 1 פרק 106 BMDCs/ml לכל טוב טוב 6-צלחת בינונית-תרבות ב נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA עבור המקננת 1שעות.</li>
		<li>להוסיף 10 ng/ml של LPS עבור ומוכנסות 24 שעות.</li>
		<li>להוסיף 100 μg/ml של ש. א. (35-55) עבור ומוכנסות 4 שעות.</li>
		<li>לקצור את הבולם תא, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא עם PBS ולספור את התאים.</li>
		<li>Subcutaneously להזריק μl 200 2 x 106 תאים עכברים C57BL/6 נקבה בת 8-10 שבועות (100 μl לתוך כל רגל).</li>
		<li>ביום של הזרקת BMDC ו- 48 שעות. מאוחר יותר, להזריק 200 ng של שעלת רעל (PTX) כל עכבר.</li>
		<li>חזור על צעדים 3.2.6-3.2.7 פעם בשבוע, למשך 4 שבועות רצופים.</li>
		<li>להעריך את הסימפטומים הקליניים של EAE מדי יום באמצעות הקריטריונים הסטנדרטיים37 (0.5-רפוי הזנב, הזנב 1-צליעה, חולשה של הגפיים האחוריות 2 בינוני, חולשה של הגפיים האחוריות 3-חמור, שיתוק גפיים הינד 4-שלמה, 5-quadriplegia או אדעך המדינה, 6-מוות).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל זה עשוי לשמש reproducibly ליצירת iDCs, לאחר מכן להבדיל אותם לתוך TolDCs, אנו מציעים כי זה ניתן להחיל כדי להעריך את היכולת של סוכנים היעד מולקולריים חדשים כדי לעודד את TolDC פנוטיפ. כפי שמתואר בדו ח זה, עקבנו רצף שבו קודם ניתחנו ביטוי TolDC של ליגנדים פני השטח על ידי cytometry זרימה, ואחריו הערכה של הפרופיל ציטוקין DC כפי שנמדד על-ידי לרביעיית-PCR ELISA. לבסוף, הפונקציה immunoregulatory של TolDCs אושר על ידי הפגנת יכולת שלהם כדי להפחית את תא T התפשטות במבחנה והיעילות שלהם לדכא את מחלת ח...

תאים דנדריטים (Dc) הם חלק אינטגרלי של מערכת החיסון המולדת, היו ראשית גילה, מאופיין על ידי ראלף שטיינמן, כהן Zanvil בשנת 1973 כמו הצגת אנטיגן מקצועיים ראשי תאים1. DCs הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהפעלת מערכת החיסון על ידי הצגת אנטיגנים מעובד על תאי T ותאי B באמצעות קומפלקסים histocompatibility הגדולות (MHC) באיברים הלימפה משני כדי לקשר את מולדת ומערכות החיסון מסתגלת2. המערכת החיסונית יונקים, יש לפחות שתי קטגוריות של בקרי קבוצת מחשבים אשר תוארו מיאלואידית DCs ו- plasmacytoid בקרי קבוצת מחשבים (שיתפקדו)3. תאים מיאלואידים DCs, ידוע גם בשם DCs קונבנציונאלי (cDCs), מאופיינים על ידי הביטוי של CD11c, ניתן להבחין כמו בקרי קבוצת מחשבים (iDCs) לא בוגר חוץ גופית בתוך מח העצם ובתאים או ומונוציטים דם היקפיים באמצעות פקטור גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF) ו- IL-4 במאתר או מין אנושי, בהתאמה4.
הפעלת 'סכנה' אותות, כגון פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרית (PAMP) או נזק-הקשורים דפוסי מולקולרית (רטיבות), יניעו ההבשלה iDCs לכיוון immunogenic DCs בתור בוגר בקרי קבוצת מחשבים (mDCs) דרך מחייבות קולטנים שונים של זיהוי תבנית DC משטח5. Immunogenic Dc נוסף פריים התפשטות תא T נאיבי ובידול דרך קולטנים upregulation של MHCII2, ליגנדים costimulatory (CD80, CD86 ו- CD40)6, ציטוקינים מגשרים מסיסים אחרים7. מפל של המתווך הפרו דלקתיים הפקה של Dc Immunogenic חיוני עבור תא T בתיווך ציטוקין בידול. לדוגמה, IFN-γ ו- IL-12 נחוצים Th1 בידול8 ו- IL-1, IL-6, ו- IL-23 הם קריטיים עבור תמים קיטוב תא T לכיוון תאי Th179. למרות DCs בוגרת מגיבים אנטיגנים זרים, הפעלת DC לא מבוקרת על ידי העצמי-אנטיגנים עלול לגרום סובלנות אבלציה ולטפח התפתחות מחלות אוטואימוניות על ידי יצירת autoreactive T תאים אשר הפעלת מוביל הרס רקמות10 .
דיווחים אחרונים סיפקו ראיות ברורות של DC פלסטיות, ומעוררות את יכולתם לתקשר ברמזים שונים בתוך microenvironment רקמות שלהם וכדי להבדיל לערכות אפקטור ברורים/DC מדכא. המתווכים אנטי-דלקתי, כגון IL-1011, TGF-β12והו-113 הוכחו לשחק תפקיד חשוב בדיכוי המערכת החיסונית על ידי גרימת tolerogenic בקרי קבוצת מחשבים (TolDCs). TolDCs אלה לרכוש פונקציות רגולטוריות, לדכא את תא T התפשטות14. יתר על כן, העדר גירוי משותף על-ידי בקרי ואת הייצור של מגשרים אנטי דלקתיות של TolDCs לתרום אינדוקציה של הרגולציה ותאי T (Tregs) והן גם ביעילות לעכב Th1 והן Th17 בידול והתרחבות15. אחרי שני עשורים, הפוטנציאל הטיפולי של TolDCs דווח על ידי מספר חוקרים. במחקרים אלה, הממשל של לשעבר-vivo המופקים סימפטומים פתולוגיים TolDCs לא רק יושבחו במודלים פרה שונה של מחלות אוטואימוניות16 אבל גם הוביל את הפיתוח של רגישות המערכת החיסונית בחולי17 ,18. מעניין, היום הטיפול TolDCs נחשב כמו גישה חלופית או משלים עבור מחלות אוטואימוניות בניסויים קליניים מספר, כולל מסוג 1 סוכרת19, דלקת מפרקים שגרונית20, 21, טרשת נפוצה (MS)22,23,24, ו- מחלת קרוהן25.
ישנם מגוון של פרוטוקולים נועדה לפתח TolDCs, מספר מעבדות דיווחו על שיטות הדור, אפיון פנוטיפי של TolDCs. שיטות אלה ניתן לייצר reproducibly TolDCs במבחנה אבות hematopoietic, לשמור אותם על stably tolerogenic המדינה ויוו26,27,28,29. ניתן להמיר את iDCs TolDCs על ידי חשיפה שונים immunomodulatory סוכנים תרופתי או ציטוקינים אנטי דלקתיות. לדוגמה, ויטמין D3 הוא סוכן תרופתי ידוע ידוע אל להגדיל ייצור IL-10, לדכא את הפרשת IL-12 מ- Dc, ובכך להגביר את הפונקציה לדיכוי המערכת החיסונית שלהם30. יתר על כן, כאשר DCs חשופים לגירויים דלקתי חזק, כגון lipopolysaccharides (LPS), מספר סוכנים תרופתי כגון דקסמתזון31, rapamycin32קורטיקוסטרואידים33 הוכחו כדי לעודד פנוטיפ TolDC על-ידי הפחתת ביטוי משטח DC CD40, CD80, CD86 ו- MHCII34. IL-10 ו- TGF-β הן רוב: לימודי ציטוקינים אנטי דלקתיות לזירוז DC סובלנות35 , חשיפה והמצוות הן של ציטוקינים אלה הוכחו לגרום פנוטיפ tolerogenic ב Dc36.
מאז tolerogenic ש-DC מוגדרת על-ידי מאפיינים פונקציונליים ולא על ידי סמנים פנוטיפי, שם הוא נהדר צריך לפתח שיטה עקבית של אפיון הסלולר ופונקציונליים של TolDCs. יתר על כן, נוהל קפדני ועקבית יש ליצור את אפיון פנוטיפ tolerogenic DC והערכת עקבי אם אנחנו רוצים ביעילות, reproducibly להשוות את היכולת של סוכנים חדשים כדי לעודד את פנוטיפ TolDC ב מעבדה. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם שיטות שלב אחר שלב כדי לבודד את iDCs של אבות hematopoietic של עכברים וכדי לאחר מכן לנתח את היעילות של סוכנים חדשים תחת הערכת היכולת שלהם להמיר iDCs TolDCs, מתן של חזקים אפיון פנוטיפי פונקציונלי של TolDCs גם במבחנה וגם בתוך vivo. תיאור זה כולל שיטה משוכללת כדי לאפיין את TolDCs על ידי שלהם ליגנדים משטח, ציטוקינים בפרופיל פונקציות לדיכוי המערכת החיסונית במבחנה. אנו מספקים גם דוגמה של שיטה כדי לחקור את היישום טיפולית פוטנציאל של אלה TolDCs במודל של ניסויים פרה-קליניים של MS, ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE). פרוטוקול הוקמה זה יסייע החוקרים להעריך את היכולת של סוכנים חדשים כדי לקדם את אינדוקציה של TolDCs, יקל על המאמץ להרחיב את היקף הפיתוח טיפוליות TolDC.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>בסינתזה ביתית</td> עכבר <td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>עכבר בידול BMDC</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td><td>התמיינות BMDC</td></tr><tr><td>ליפופוליסכרידים (LPS)</td><td>סיגמא אולדריץ' בע"מ.</td><td>L2880</td><td>תרבית תאים</td></tr> <tr><td>ובטא;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא אולדריץ' בע"מ</td><td>516732</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>רעלן שעלת (PTX)</td><td>R& D systems</td><td>3097</td><td>EAE אינדוקציה</td></tr><tr><td>MOG (35&ndash; 55) פפטיד</td><td>21stCentury ביוכימיקלים</td><td>בסינתזה ביתית</td><td>אינדוקציה EAE</td></tr><tr><td>טריפאן כחול</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>RPMI-1640 בתוספת L-גלוטמין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>חומצת אמינו לא חיונית (100X)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>תרבית</td></tr><tr><td>תאים HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>40 & #956; מסננת תאים</td><td>m Corning</td><td>352340</td><td>בידוד תאים</td></tr><tr><td>מצומד PE CD80</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>מצומד PE CD86</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>מצומד PE PD-L1</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>מצומד APC MHCII</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td>ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>מצומד APC CD11c</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>איזוטיפ ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>תואם PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>איזוטיפ ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>תואם APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>ציטומטריית זרימה</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאים דנדריטיים</td><td>פאן Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>מגיב חוסם FCR</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>בדיקת התפשטות תאי</td></tr><tr><td>T קוקטייל נוגדנים ביוטין של תאים דנדריטיים</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr> אנטי <tr><td>ביוטין מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>בדיקת התפשטות תאי</td></tr><tr><td>T CD4+ ערכת בידוד תאי T</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>בדיקת התפשטות תאי</td></tr><tr><td>T CD4+ תאי T קוקטייל נוגדנים</td><td>ביוטין Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr> אנטי <tr><td>ביוטין מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454</td><td>בדיקת התפשטות תאי</td></tr><tr><td>T מאגר ליסינג ACK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>BMDC התמיינות</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרק</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>התמיינות BMDC</td></tr><tr><td>25G מחט</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>מחט 23G</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>התמיינות BMDC</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>A2058</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>מסנן טרום הפרדה</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823</td><td>בדיקת התפשטות תאי</td></tr><tr><td>T קולגנאז D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>11088858001</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>אובאלבומין (OVA) פפטיד 323&ndash; 329</td><td>סיגמא אולדריץ' בע"מ</td><td>O1641</td><td>בדיקת התפשטות תאי T</td></tr><tr><td>עכבר IFN-&gamma; בדיקה TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>עכבר qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-12a בדיקה TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>עכבר qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R& מערכות D</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Mouse EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alpha; בדיקה TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>עכבר TNF-&alpha; Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 TaqMan בדיקה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>עכבר IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a TaqMan בדיקה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>עכבר IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R& D systems</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 TaqMan בדיקה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 TaqMan בדיקה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta; בדיקת TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Heme Oxygenase 1 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actin נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSמנתח תאי קליבור</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>זרימה ציטומטריה</td></tr></tbody></table>

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר tolerogenic

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

מערכת החיסון פועלת על ידי שמירה על איזון הדוק בין תיאום תגובות נגד אנטיגנים זרים, שמירה על מצב שאינו מגיב נגד אנטיגנים העצמי, כמו גם אנטיגנים נגזר מאורגניזמים commensal. שיבוש הומאוסטזיס החיסון הזה יכול להוביל לדלקת כרונית להתפתחות של מחלת חיסון עצמי. תאים דנדריטים (Dc) הם תאים אנטיגן מקצועיים של מערכת החיסון המולדת הכרוכה בהפעלתו תמים T תאים ליזום תגובות מערכת החיסון כנגד אנטיגנים זרים. עם זאת, ניתן להבחין DCs גם לתוך TolDCs שפועלים כדי לשמר ולקדם את תא T סובלנות וכדי לדכא את התאים אפקטור תורמים להתפתחות של תנאים או דלקת אוטואימונית או כרונית. ההתקדמות האחרונה בהבנה שלנו של TolDCs מרמז כי DC סובלנות יכולה להיות מושגת על ידי להתכוונן מצבם בידול. תופעה זו הובילה לצמיחה אדירה בפיתוח טיפולים TolDC רבים כשל חיסוני נגרמת בשל לפרוץ סובלנות המערכת החיסונית. להצלחה בלימודים במודלים מאתר פרה מחלת חיסון עצמי יש נוספת לאמת את התועלת immunotherapeutic של TolDCs בטיפול של הפרעות אוטואימוניות. היום, TolDCs הפכו כלי immunotherapeutic מבטיח במרפאה עבור החזרתו של רגישות המערכת החיסונית בהפרעות חיסוניים שונים על ידי מיקוד תגובות אוטואימוניות פתוגניים תוך השארת חיסון הגנתי ללא פגע. למרות מגוון של אסטרטגיות הוצע על ידי מעבדות מרובים כדי לגרום TolDCs, יש אין עקביות באפיון של פנוטיפ הסלולר ופונקציונליים של תאים אלה. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד להתפתחות של מח עצם-derived DCs במספרים גדולים, שיטה ייחודית המשמשת כדי להבדיל אותם לתוך TolDCs עם triterpenoid סינתטי 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic חומצה-difluoro-propyl-אמיד (CDDO-DFPA), של טכניקות השתמשו כדי לאשר פנוטיפ שלהם, כולל ניתוחים של חיוניות חתימות מולקולרית של TolDCs. לבסוף, אנו מראים שיטה להערכת הפונקציה TolDC על-ידי בדיקת שלהם לדיכוי המערכת החיסונית בתגובה במבחנה וב -vivo במודל של פרה של טרשת נפוצה.

בידול ובחירה של BMDCs:
מח עצם ובתאים היו תרבותי שלם בינוני RPMI בנוכחות GM-CSF ו- IL-4 כדי להתמיין iDCs במשך 7 ימים (איור 1 א'). יום 1, התאים היו קטנים בגודלם, הראו מורפולוגיה כדורית. כביסה עם PBS לפני ההחלפה של בינוני טריים יום 3 עזר תאים לאשכולות טופס, גם הגדילה את אוכלוסיית CD11c+ תאים. ביום 4, BMDCs הורחבו במידה ויזם הקמת אשכול. מודבקת מקרופאגים היו גם המרה, נצפתה בתח...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לפתח ולאפיין תאים דנדריטיים טולרוגניים של עכברים להערכת התועלת האימונותרפית שלהם בטיפול בהפרעות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול בתאים דנדריטיים טולרוגניים על ידי מתן שיטה סטנדרטית לפיתוח ואפיון תפקודי של תאים דנדריטיים טולרוגניים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן להשתמש בה להתפתחות מוצלחת של תאים דנדריטיים טולרוגניים ולבדיקת יעילות תפקודית של תאים דנדריטיים טולרוגניים.ההשלכות של טכניקה זו הן משמעותיות. הם מתרחבים לקראת פיתוח אימונותרפיה תאית להפרעות אוטואימוניות, שכן תאים דנדריטיים טולרוגניים יכולים לאפס תגובה חיסונית חריגה תוך שהם נשארים כפופים למנגנוני ויסות חיסוניים מהותיים. לאחר קצירת עצמות הרגל האחורית מעכברי C57BL/6 בני שמונה עד 10 שבועות, על פי הפרוטוקולים הסטנדרטיים, השתמשו בלהבים ובמלקחיים כירורגיים כדי לנתח כמה שיותר רקמות ולהניח את השוקה ועצם הירך הנקיים בצלחת תרבית של שישה סנטימטרים המכילה 70% אתנול.חתוך את שני קצוות העצמות בעזרת להב כירורגי והשתמש במזרק של שלושה מיליליטר, המצויד במחט בגודל 23, כדי לשטוף את המח מהעצם הראשונה עם שלושה מיליליטר PBS לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. כאשר כל מח העצם נאסף, צנטריפוגה את תרחיף התאים והשהה מחדש את הכדור במיליליטר אחד של מאגר ליזה של כדוריות דם

development-functional-characterization-murine-tolerogenic-dendritic

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

מצגת Antigen באיברים הלימפה משני על ידי התאים הדנדריטים הוא קריטי עבור ייזום של תא T בתיווך תגובה חיסונית אדפטיבית. כאן אנו מדגימים את התרבות של מוח העצם נגזר תאים דנדריטים Murine, הפעלה, וסימון עבור הדמיה 2-פוטון.

הדור של מח עצם נגזר תאים דנדריטים Murine לשימוש 2-פוטון הדמיה

סרטון זה מדגים את יצירתם של תאים דנדריטיים לא בוגרים, בוגרים וסובלוגניים, או DCs, ממונוציטים אנושיים. הדגירה של מונוציטים עם גורמי גדילה וציטוקינים מובילה לייצור DCs לא בוגרים. בתגובה למולקולות ויסות חיסוניות, DCs לא בשלים מתמיינים ל-DCs סובלרוגניים ובוגרים.

יצירת תאים דנדריטיים לא בוגרים, בוגרים וסובלניים ממונוציטים

סרטון זה מדגים שיטה להמרת תאים דנדריטיים (DCs) ל-DCs סובלרוגניים (TolDCs) באמצעות סוכן תרופתי אימונומודולטורי. המרה זו מאושרת על ידי הערכת הפונקציה TolDC באמצעות ההשפעה החיסונית שלהם על תאי CD4+ T.

השפעת סוכן פרמקולוגי אימונומודולטורי על האינטראקציה בין תאים דנדריטיים ותאי T CD4+

פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

במחקר זה אנו מציגים מערכת תרבית במבחנה שיכולה לייצר ביעילות pDCs על ידי תרבית משותפת של אבות לימפואידים נפוצים עם תאי הזנה AC-6 בנוכחות ליגנד Flt3.

במבחנה הדור של תאי דנדריטים Murine Plasmacytoid מנפוצים הלימפה אבות באמצעות מערכת מזין AC-6

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

ניתן להתמיין באופן סלקטיבי לתאים דנדריטיים טולרוגניים או בוגרים כדי לווסת את האיזון בין חסינות לסבילות. עבודה זו מציגה אמצעי ליצירת תאים דנדריטיים לא בשלים שמקורם במונוציטים (moDCs), moDCs טולרוגניים ובוגרים במבחנה הנבדלים זה מזה בפנוטיפים מטבוליים.

הדור של בוגר, בוגרת Tolerogenic דנדריטים תאים, עם שינוי פנוטיפים מטבולית

כאן אנו מספקים פרוטוקול לסינון גורמי שעתוק פוטנציאליים המעורבים בפיתוח של תא דנדריטי (DC) באמצעות transduction lentiviral של shRNA כדי להשיג קווי תא נוק-אאוט יציבים עבור בידול במבחנה DC.

מחקר של התפתחות תאים דנדריטיים על ידי קצר סיכות ראש RNA מתווך RNA נוקאאוט גזע הגבעול Hematopoietic וקו תא האב הקדמה במבחנה

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית ויעילה לבודד וליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם בטוהר גבוה מעכברים לאחר 7 ימים של תרבית עם 10 ננוגרם/מ"ל GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

אנו מתארים הליך להערכת היכולת של חומרים פרמקולוגיים לייצר תאים דנדריטיים טולרוגניים מתאים דנדריטיים נאיביים שמקורם במונוציטים במבחנה ולאמת את עוצמתם על ידי יצירת תאי T רגולטוריים אוטולוגיים.

שיטה פשוטה ויעילה לבדיקת חומרים אימונומודולטוריים ליצירת תאים דנדריטיים טולרוגניים ממונוציטים CD14+ אנושיים

חקור פיתוח ואפיון תאים דנדריטים טולרוגניים מעכברי C57BL/6 לטיפול במחלות אוטואימוניות כמו טרשת נפוצה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת יעילות תאים לטיפול תאי אימונותרפי.

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

גלה סרטונים נוספים