תכנון מערכות תסיסה במצב מוצק לייצור אנזימים חוץ-תאיים פולימריים הידרוליטיים על ידי פטריות חוטיות

אנו מתכננים מערכות תסיסה רב-תכליתיות במצב מוצק, בננות, ייצור אנזימים על ידי פטריות. חקר האופן שבו גורמים שונים, סוגים אינוקולריים ומערכות סיבוביות משפרים את יכולת ההרחבה והג'ל.

הרחבת מערכות תסיסה במצב מוצק סיבובי תוך שמירה על תנאים הומוגניים, העברת חמצן ותפוקת אנזימים עקבית נותרה אתגר ניסיוני מרכזי.

הראינו שמערכות תסיסה במצב מוצק סיבובי מייצרות פי ארבעה עד שישה יותר באותן תפוקות מאשר תסיסה שקועה, ומציגות את הרבגוניות והמדרגיות שלהן עבור אנזימים מרובים.

הפרוטוקול שלנו משלב ערבוב סיבובי, סוגי פרוטוקולים מגוונים ומגוון של גורמים ספציפיים, מה שמבטיח ג'ל אנזימים מתקדם, צמיחה הומוגנית וישימות על פני מערכות אנזימים מרובות.

נתמקד בהגדלת מצב מוצק סיבובי, מערכת תסיסה כדי לחקור את היישום שלהם לייצור אנזימים חדשים בביו-אנרגיה של מזון ובמגזרים סביבתיים.

[קריין] כדי להתחיל, שטפו את סובין החיטה שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים כדי להסיר שאריות חומר אורגני, פסולת ואבק. מורחים את סובין החיטה השטוף על מגש אלומיניום ומייבשים אותו בתנור המוגדר על 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. להכנת תרחיף הנבגים, העבירו דיסק מקדחה בקוטר חמישה מילימטר רווי בתפטיר על צלחת מקדחת דקסטרוז תפוחי אדמה טרייה. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך חמישה עד שבעה ימים, או עד שהתפטיר ירווה את המדיום. לאחר מכן הוסיפו לצלחת חמישה מיליליטר מים מזוקקים סטריליים, ובעזרת לולאה סטרילית נתקו את הנבגים מפני השטח. כעת, הכינו דילול של 1 עד 100 של תרחיף הנבגים, באמצעות מים מזוקקים סטריליים. הוסף 10 מיקרוליטר מהתרחיף לתא נויבאואר, וספור את הנבגים באמצעות מיקרוסקופ. לתרבית נוזלית, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר דיסק מקדחה רווי תפטיר לצלחת מקדחת דקסטרוז תפוחי אדמה טריים. דגרו את הצלחת בחום של 28 מעלות צלזיוס עד לרוויה מלאה של המדיום. מכינים 25 מיליליטר מרק דקסטרוז תפוחי אדמה בבקבוק ארלנמאייר סטרילי של 125 מיליליטר, ומחטאים את הבקבוק כדי לעקר את המדיום. לאחר מכן, העבירו דיסק תפטיר של חמישה מילימטר מצלחת ה- PDA הרוויה למרק הסטרילי. דגרו את הבקבוק על שייקר ב-125 סל"ד למשך 24 עד 48 שעות, והתאימו את הזמן על סמך זן פטרייתי. אוספים שני מיליליטר מהמרק המתורבת להכנת חיסון, ועוד שני מיליליטר לקביעת משקל יבש. לחיסון ישיר של דיסקי תפטיר, הנח את דיסק המקדחה הרווי בתפטיר על צלחת מקדחת דקסטרוז תפוחי אדמה טרייה, ודגר אותו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס עד לרוויה מלאה של המדיום. הכן את צינור המצע עם חמישה גרם סובין חיטה, 0.5 גרם של המשרה ו-5.5 מיליליטר מים, וחיטוי הצינור ב-15 פאונד לאינץ' מרובע למשך 15 דקות. לאחר הקירור, הכנס את בדיקת האלקטרודה ישירות לתוך הכור בעומקים משתנים כדי למדוד את הלחות היחסית, באמצעות מד לחות מבוסס אלקטרודה. חסנו את המצע במיליליטר אחד של תרחיף נבגים, המכיל 10 בחזקת שישה עד 10 בחזקת שבעה נבגים למיליליטר. מערבל את הצינורות במהירות מקסימלית למשך חמש דקות במחזורים של דקה אחת כדי למנוע גוש מצע. לאחר מכן הניחו את הצינורות במיקסר סיבובי עם ציר אופקי. דגרו את המערבל הסיבובי בחממה המכוונת לטמפרטורת הגידול האופטימלית של המיקרואורגניזם. למיצוי אנזימים, השעו מחדש את המצע ב-20 מיליליטר של מאגר מקורר מראש לאחר תקופת התסיסה הרצויה. מערבל את הצינורות במחזורים של דקה אחת במהירות מקסימלית, ולאחר מכן דקה אחת על קרח. סנן את המתלים באמצעות מסנני נייר ולחץ כדי לחלץ מכנית את הסופרנטנט. לבסוף, צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-3,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להבהיר את הנוזל. לאחר שישה ימים של תסיסה במצב מוצק, המצע הראה קולוניזציה פטרייתית גלויה עם רשת תפטירים סיבית המכסה את פני השטח. היווצרות גלוקוזאמין באמצעות הידרוליזה של צ'יטוזן הייתה גבוהה משמעותית בטריכודרמה הרציאנום בתסיסה במצב מוצק, מה שמצביע על כך שפעילות הכיטינאז במקרה זה הייתה גבוהה בהרבה מזו בתסיסה שקועה. באופן דומה, פעילות העמילאז על ידי אספרגילוס לנטולוס הייתה מוגברת משמעותית בתסיסה במצב מוצק בהשוואה לזו בתסיסה שקועה.