Name: אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 24 s
Description: למדו לייעל ביטוי חלבון חלוף בצמחים באמצעות עיצוב ניסויים מערכתי. שיטה זו מאפשרת זיהוי פרמטרים קריטיים וייצור יעיל של נוגדנים מונוקלונליים בטבק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד&quot;ר תומס Rademacher למתן וקטור ppam צמח הביטוי ואבראהים אל עמדי לטיפוח צמחי טבק המשמשים במחקר זה. ברצוננו להודות לד&quot;ר ריצ&#39;רד מ Twyman לסיועו בעריכת כתב היד. עבודה זו בחלקו מומנה על ידי המועצה האירופית למחקר מתקדם גרנט &quot;העתיד-פארמה&quot;, מספר הצעת 269,110 וFraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer עתיד הקרן).

<ol><li>Fischer, R., Emans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+farming+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+research%22%5BJournal%5D)">Molecular farming of pharmaceutical proteins.</a> Transgenic research. 9, 277-299 (2000).</li>
<li>Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosafety+of+molecular+farming+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22AgBiotechNet%22%5BJournal%5D)">The biosafety of molecular farming in plants.</a> AgBiotechNet. 5, 9 (2003).</li>
<li>Shoji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant-based+system+for+rapid+production+of+influenza+vaccine+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Resp%22%5BJournal%5D)">A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens.</a> Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+Its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).</li>
<li>Berg, R. H., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+applications+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein applications in plants.</a> Method Cell Biol. 85, 153 (2008).</li>
<li>Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+is+not+alone%3A+gene+transfer+to+plants+by+viruses+and+other+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria.</a> Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).</li>
<li>Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transient+Agrobacterium-mediated+gene+expression+system+in+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana.</a> Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+heterogeneous+biomass%3A+Overcoming+the+hurdles+in+model+building%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building.</a> Bioengineered. 4, (2013).</li>
<li>Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP+issues+for+recombinant+plant-derived+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins.</a> Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).</li>
<li>Daniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-at-a-time+plans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">One-at-a-time plans.</a> Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).</li>
<li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Factor-at-a-Time+versus+Designed+Experiments+The+American+Statistician%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician.</a> 53, 6 (1999).</li>
<li>Anderson, M. J., Kraber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keys+to+successful+designed+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ASQ+-+The+global+voice+of+quality%22%5BJournal%5D)">Keys to successful designed experiments.</a> ASQ - The global voice of quality. 6, 6 (1999).</li>
<li>Montgomery, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMontgomery%2C+DC+%22Design+and+Analysis+of+Experiments%22">Design and Analysis of Experiments</a>. , John Wiley & Sons Inc. (2007).</li>
<li>Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMyers%2C+RH+%22Response+Surface+Methodology%3A+Process+and+Product+Optimization+Using+Designed+Experiments%22">Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments</a>. , Wiley. (2009).</li>
<li>Piepel, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programs+for+generating+extreme+vertices+and+centroids+of+linearly+constrained+experimental+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Qual+Technol%22%5BJournal%5D)">Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions.</a> J Qual Technol. 20, 15 (1988).</li>
<li>FDA. , U.S. Department of Health and Human Services. Rockville, MD, USA. (2009).</li>
<li>Shivhare, M., McCreath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Considerations+for+DoE+Implementation+in+Quality+By+Design%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design.</a> BioProcess International. 8, 9 (2010).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+transient+protein+expression+in+tobacco+%28Nicotiana+tabacum+L.%29+can+optimize+process+time%2C+yield%2C+and+downstream+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs.</a> Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).</li>
<li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter%2F5%27UTR+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).</li>
<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , Productivity Inc. (2000).</li>
<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22Response+Surface+Methods+Simplified%22">Response Surface Methods Simplified</a>. , Productivity Press. (2005).</li>
<li>De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+correct+intervals+for+prediction%3A+A+tutorial+on+tolerance+intervals+for+ordinary+least-squares+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometr+Intell+Lab%22%5BJournal%5D)">Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression.</a> Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).</li>
<li> Plasmid DNA purification User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).</li>
<li> PCR clean-up Gel extraction User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).</li>
<li>Quick Ligation Protocol. 4, NewEnglandBiolabs. Ipswich. (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Transformation+of+Escherichia-Coli+with+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+protocols+for+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation protocols for Agrobacterium.</a> Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).</li>
<li>Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vienna+RNA+websuite%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The Vienna RNA websuite.</a> Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).</li>
<li>Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+immobilization+of+an+antibody+fragment+to+a+carboxymethylated+dextran-linked+biosensor+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface.</a> J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).</li>
<li>Newcombe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+biosensor+assay+to+quantify+polyclonal+IgG+in+ovine+serum+used+for+the+production+of+biotherapeutic+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments.</a> Process Biochem. 41, 842-847 (2006).</li>
<li>Peixoto, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+Variable+Selection+in+Polynomial+Regression-Models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Stat%22%5BJournal%5D)">Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models.</a> Am Stat. 41, 311-313 (1987).</li>
<li>Peixoto, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Property+of+Well-Formulated+Polynomial+Regression-Models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Stat%22%5BJournal%5D)">A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models.</a> Am Stat. 44, 26-30 (1990).</li>
<li>Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cauliflower+mosaic+virus+35S+and+nopaline+synthase+promoters+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants.</a> Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).</li>
<li>Ma, J. K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Assembly+of+Secretory+Antibodies+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants.</a> Science. 268, 716-719 (1995).</li>
<li>Wycoff, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA+antibodies+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Design%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA antibodies from plants.</a> Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).</li>
<li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).</li>
</ol>

אגרת הפרסום מומנה באופן חלקי על ידי חברות Statease, Inc (ארה&quot;ב) וStatcon (גרמניה), שלא היו מעורבות במעורב בהכנת כתב היד או אחראית לכל התוכן שלו.

כל ניסוי דורש תכנון זהיר, כי משאבים הם לרוב נדירים ויקרים. זה נכון במיוחד לאסטרטגיות מחלקת אנרגיה בגלל שגיאות במהלך שלב תכנון (לדוגמא: בחירת דגם בסיס שאינו מכסה את כל אינטראקציות הגורם משמעותיות) באופן משמעותי יכולות לצמצם את כוח הניבוי של מודלים וכתוצאה מכך ובכך פיחות הניסוי כולו. עם זאת, יכולות בקלות להימנע טעויות אלה על ידי ביצוע נהלים בסיסיים. שיקולים בתכנון מחלקת האנרגיה <p class="jove_content" sty...

הייצור של חלבונים ביולוגיות בצמחים יש יתרון משום שצמחים הם זולים לגדול, הפלטפורמה וניתן לשנותם רק על ידי גידול צמחים יותר, ופתוגנים אנושיים אינם מסוגלים לשכפל 1,2. אסטרטגיות ביטוי חולפות מבוססות למשל על החדירה של עלים עם Agrobacterium tumefaciens מספקת יתרונות נוספים בגלל הזמן בין נקודת מסירת DNA והמשלוח של מוצר מטוהר מצטמצם משנה לפחות מ 2 חודשים 3. ביטוי חולף משמש גם לניתוח פונקציונלי, למשל כדי לבדוק גנים ביכולתם להשלים את מוטציות אובדן של פונקציה או לחקור אינטראקציות חלבון 4-6. עם זאת, רמות ביטוי חולפות נוטות להראות גדולה יותר וריאציה אצווה כדי אצווה מ רמות ביטוי בצמחים מהונדסים 7-9. הדבר זה מפחית את הסבירות לכך שתהליכי ייצור ביולוגיות המבוססים על wi ביטוי החולףתהיה מאושר בהקשר של תרגול טוב ייצור (GMP), כי שחזור הוא תכונת איכות קריטית והוא כפוף להערכת סיכונים 10. וריאציה כזו יכולה גם להסוות את כל אינטראקציות שחוקרים מתכוונים לחקור. לכן, יצאנו לזהות את הגורמים העיקריים המשפיעים על רמות ביטוי חולפות בצמחים ולבנות מודל חיזוי כמותית באיכות גבוהה. הגישה אחת גורם ב-פעמי (OFAT) משמשת לעתים קרובות כדי לאפיין את ההשפעה (אפקט) של פרמטרים מסוימים (גורמים) על התוצאה (בתגובה) של ניסוי 11. אבל זה לא טובים, כי הבדיקות בודדות (פועל) במהלך חקירה (ניסוי) תהיה מיושרת כמו פנינים במחרוזת דרך אזור הפוטנציאל מורחב על ידי הגורמים שנבדקו (מרחב תכנון). הכיסוי של עיצוב החלל, ולכן המידה של מידע ההופק מהניסוי הואדל, כפי שמוצג באיור 1 א 12. יתר על כן, תלות הדדית בין גורמים שונים (אינטראקציות גורם) יכולה להישאר נסתרת וכתוצאה מכך מודלים עניים ו / או החיזוי של אופטימה הכוזבת, כפי שמוצג באיור 1 ב 13. ניתן להימנע מהחסרונות שתוארו לעיל באמצעות עיצוב של ניסויי גישה (DOE), שבריצות של ניסוי מפוזרות בצורה שווה יותר לאורך כל מרחב תכנון, כלומר יותר מגורם אחד הוא נע בין שתי ריצות 14. ישנם עיצובים מיוחדים לתערובות, הקרנת גורמים (עיצובי עצרת) ולכמת את השפעות גורם בתגובות (שיטות משטח תגובה, RSM ים) 15. יתר על כן, יכול להתממש RSMs עיצובים מרכזיים-מרוכבים אבל גם יכול להיות מושגת בצורה יעילה על ידי שימוש בתוכנות מיוחדות שניתן להחיל קריטריונים שונים לבחירה של ריצות. לדוגמא, מה שנקרא D-optimalitקריטריון y יבחר ריצות כך כדי למזער את השגיאה במקדמים של המודל וכתוצאה מכך, בעוד שקריטריון IV-האופטימלי בוחר ריצות כי להשיג את שונות התחזית הנמוכה ביותר בחלל העיצוב 15,16. RSM אנו מתארים כאן מאפשר לכמת המדויקים של ביטוי חלבון החולף בצמחים, אבל זה יכול בקלות להיות מועבר לכל מערכת מעורבת מספר (~ 5-8) גורמים מספריים (למשל טמפרטורה, זמן, ריכוז) וכמה (~ 2 - 4) גורמים משמעיים (למשל אמרגן, צבע) שבו תיאור מכניסטית אינו זמין או מורכב מדי לדגמן. גישת מחלקת האנרגיה שמקורה במדעי החקלאות, אך התפשטה לאזורים אחרים בגלל זה הוא להעברה לכל מצב שבו כדאי להקטין את מספר ריצות צורך לקבל נתונים אמינים וליצור מודלים תיאורים עבור תהליכים מורכבים. זה בתורו הוביל להכללתה של מחלקת אנרגיה ב&quot; ההדרכה לתעשייה, Q8 (R2) תרופות פיתוח &quot;, שפורסם על ידי הרמוני הבינלאומי של דרישות טכניות עבור רישום של תרופות לשימוש בבני אדם (ICH) 17. DOE הוא כיום בשימוש נרחב במחקר ותעשייה 18 מדעיים. עם זאת, יש להקפיד במהלך התכנון והביצוע של הניסוי, כי בחירת תואר פולינום לא תקין למודל מרובה ליניארי רגרסיה (דגם בסיס) יכולים להציג את צורך בריצות נוספות למודל את כל השפעות הגורם בצורה נכונה. יתר על כן, פגום או חסר נתונים ליצור מודלים ופגומים שגויים תחזיות, ואף עלול למנוע כל ניסיון בניית מודל כפי שמתואר בסעיפי הפרוטוקול ודיון 18. בקטע הפרוטוקול, יהיה להגדיר תחילה אנו את צעדי תכנון החשובים ביותר לניסוי מבוסס RSM ולאחר מכן להסביר את העיצוב מבוסס על האיילה v8.1 תוכנת DesignExpert. אבל עיצובים דומים יכול להיות בנוי עם includi תוכנה אחרng JMP, Modde, וSTATISTICA. הליכי הניסוי ואחריו הוראות לניתוח נתונים והערכה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1.jpg" /> איור 1. השוואה של OFAT והאיילה.. וריאציה רציפה של גורם אחד בכל פעם (OFAT) בניסוי (עיגולים שחורים, אדום וכחול) משיגה כיסוי נמוך של מרחב תכנון (אזורים בקעו). לעומת זאת, הווריאציה של יותר מגורם אחד בכל פעם באמצעות העיצוב של ניסויי אסטרטגיה (DOE) (עיגולים ירוקים) משפרת את הכיסוי ובכך הדיוק של המודלים וכתוצאה מכך. ב &#39;. כיסוי מרחב תכנון המוטה אומר שניסויי OFAT (עיגולים שחורים) גם יכולים שלא לזהות את האזורים אופטימליים הפעלה (אדום) ולחזות פתרונות לא אופטימליים (עיגול שחור גדול), ואילו strategi מחלקת האנרגיהes (כוכבים שחורים) יש סיכוי גבוה יותר לזהות תנאים עדיפים (כוכב שחור גדול).

<table><tbody><tr><td>מומחה עיצוב(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td> <td>תוכנה</td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8952.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2363.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K029.2</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5210.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Escherichia coli K12 DH5a</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td>מיקרואורגניזם</td></tr><tr><td>pPAM</td><td>GenBank</td><td>AY027531</td><td>וקטור שיבוט/ביטוי; &nbsp;</td></tr><tr><td>פלסמיד נוקלאוספין&nbsp;</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740588.250</td><td>ערכת בידוד DNA פלסמיד</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel וניקוי PCR</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740609.250</td><td>ערכת טיהור DNA פלסמיד</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>n.a.Spectrophotometer</td><td></td></tr> <tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193L</td><td>הגבלהאנדונוקלאז</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs Inc.</td><td>R3101L</td><td>הגבלהאנדונוקלאז</td></tr><tr><td>AscI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ</td><td>R0558L</td><td>הגבלהאנדונוקלאז</td></tr><tr><td>NEB 4</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס בע"מ</td><td>B7004S</td><td>Restrictionendonuclease buffer</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>דיסודיום טטרבוראט</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4403.3</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8040.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6352.4</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A512.1</td><td>מחוון צבע</td></tr><tr><td>קסילן ציאנול</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A513.1</td><td>מחוון צבע</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>7530.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>תא Mini-Sub GT Cell</td><td>BioRad</td><td>170-4406</td><td>תא אלקטרופורזה ג'ל</td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens זן GV3101:pMP90RK</td><td>DSMZ</td><td>12365</td><td>מיקרואורגניזם</td></tr><tr><td>Electroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td>4307000.658</td><td></td></tr><tr><td>תמצית בקר</td><td>Electroporator Carl Roth GmbH</td><td>X975.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2365.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0261.3</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>קרבניצילין</td><td>קארל רוט GmbH</td><td>6344.2</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>קנמיצין</td><td>קארל רוט GmbH</td><td>T832.3</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4163.2</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>FWD פריימר</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCT</td> <td>CAG GAA GAG CAA TAC</td></tr><tr><td>REV פריימר</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCA</td> <td>AAG CGA GTA CAC AAC</td></tr><tr><td>2720 Thermal</td><td>cycler Applied Biosystems</td><td>4359659</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>RNAfold</td><td>webserver אוניברסיטת וינה</td><td>n.a.Software</td><td></td></tr> <tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>דשן</td></tr><tr><td>גרודן קוביות צמר סלעים 10 x10 ס"מ</td><td>Grodan</td><td>n.a.Rockwool</td> <td>block</td></tr><tr><td>חממה</td> n.a.n.a.לגידול <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צמחיםPhytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.לגידול</td> <td>צמחים</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo</td><td>B. Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Murashige ומלחי Skoog</td><td>Duchefa</td><td>M 0222.0010</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.2</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Phytohormon analogon</td></tr><tr><td>&nbsp; ביופוטומטר פלוס</td><td>אפנדורף</td><td>6132 000.008</td><td>פוטומטר</td></tr><tr><td>אוסראם לבן מגניב 36 W</td><td>אוסראם</td><td>4930440</td><td>מקור אור</td></tr><tr><td>דיסודיום פוספט</td><td>קארל רוט GmbH</td><td>4984.3</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5415D</td><td>אפנדורף</td><td>5424 000.410</td><td>צנטריפוגה</td></tr><tr><td>פורמה -86C מקפיא ULT ThermoFisher</td><td></td><td>88400</td><td>מקפיא</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>קורא צלחות פלואורסצנטיות</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>n.a.SPR</td> <td>מכשיר</td></tr><tr><td>חלבון</td> A <td>Life Technologies</td><td>10-1006</td><td>חלבון קושר נוגדנים</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>2G12 נוגדן</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>נוגדן ייחוס</td></tr></tbody></table>

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

צמחים מספקים יתרונות רבים לייצור תרופות ביולוגיים כוללים עלויות נמוכות, יכולת הרחבה, ובטיחות. ביטוי חולף מציע יתרון נוסף של פיתוח קצר וזמני ייצור, אבל רמות הביטוי יכולות להשתנות באופן משמעותי בין קבוצות ובכך הולידו חששות רגולטורים בהקשר של ייצור נאות. אנחנו השתמשנו בעיצוב של גישת ניסויים (DOE), כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים מרכזיים כגון אלמנטים רגולטוריים במבנה הביטוי, גידול צמחים ופרמטרי פיתוח, ותנאי הדגירה בהבעה, בשונות של ביטוי בין קבוצות. בדקנו צמחים המבטאים נוגדן מודל אנטי HIV חד שבטי (2G12) וחלבון פלואורסצנטי סמן (DsRed). אנו דנים את הרציונל לבחירת מאפיינים מסוימים של המודל ולזהות מגבלות הפוטנציאל שלה. הגישה הכללית בקלות ניתן להעביר לבעיות אחרות, כי את עקרונות המודלמחדש החלים רחב: בחירת פרמטר המבוסס על ידע, הפחתת מורכבות על ידי פיצול הבעיה הראשונית לתוך מודולים קטנים יותר, מונחה תוכנת התקנה של שילובי ניסוי אופטימליים והגדלת עיצוב צעד חכמה. לכן, המתודולוגיה היא לא רק שימושית לאפיון ביטוי חלבון בצמחים, אלא גם לחקירה של מערכות מורכבות אחרות חסרות תיאור מכניסטי. משוואות החיזוי המתארות את הקישוריות בין פרמטרים ניתן להשתמש כדי להקים מודלים מכניסטית למערכות מורכבות אחרות.

מודל תיאורים עבור הצטברות DsRed בביטוי חולף באמצעות יזמים ו5&#39;UTRs שונים הקרינה DsRed בתמציות עלים שימשה כדי להצביע על רמת הביטוי של חלבון רקומביננטי וכך שימש כתגובה באסטרטגית DOE. הבדל גילוי המינימום שאנחנו נחשבים רלוונטיים היה 20 מיקרוגרם / מיליליטר וסטיית התקן המשוער של המערכת הייתה 8 מיקרוגרם / מיליליטר המבוסס על ניסויים ראשוניים. גורמים הנכללים במודל הביטוי החולף נבחרו על בסיס 7,8</s...

אנו מתארים עיצוב של גישת ניסויים שיכולים לשמש כדי לקבוע ולעצב את ההשפעה של אלמנטי transgene רגולציה, פרמטרים גדילה והתפתחות צמח, ותנאי דגירה על הביטוי החולף של נוגדנים חד שבטיים וחלבונים כתב בצמחים.

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

characterization-complex-systems-using-design-experiments-approach

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מקור: רופיאן, י. ס. ואחרים. ניתוח תא יחיד של ביטוי גני Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים שיטה לניתוח ביטוי גנים בחיידקים פתוגניים שמופקים מצמחים ברמת תא יחיד באמצעות פקטור שעתוק פלואורסצנטי. הדמיה קונפוקלית חושפת הטרוגניות בביטוי גנים של אלימות, ומדגיש גיוון פונקציונלי בתוך אוכלוסיית חיידקים משובטים.

ניתוח ביטוי גנים בתא יחיד מפתוגנים שמופקים על ידי צמחים

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן...

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

תעלות יוני לימוד באמצעות מערכת להביע heterologously הפכו טכניקת ליבה במחקר ביו. בכתב היד הזה, אנו מציגים שיטה יעילה זמן כדי להשיג ביטוי ערוץ יון תחת פיקוח הדוק על ידי ביצוע transfection חולף בשליטת האמרגן מושרה.

ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

למדו לייעל ביטוי חלבון חלוף בצמחים באמצעות עיצוב ניסויים מערכתי. שיטה זו מאפשרת זיהוי פרמטרים קריטיים וייצור יעיל של נוגדנים מונוקלונליים בטבק.

אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

גלה סרטונים נוספים