אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ליצור מודלים לחיזוי לביטוי חולף של חלבונים בעלים של צמחים. זה מושג על ידי הגדרת תכנון ניסיוני לזיהוי הפרמטרים החשובים ביותר לביטוי חולף ולכמת את השפעתם על הצטברות חלבון. כשלב שני, גנים משובטים ומועברים לחיידקים אגרו, אשר מוזרקים לאחר מכן לעלים וכתוצאה מכך ביטוי חלבון חולף.

לאחר מכן, דגימות העלים מנותחות על מנת לקבוע את רמות ביטוי החלבון. מתקבלות תוצאות המראות את דפוס רמות ביטוי החלבון החולף בעלים בגילאים שונים ובתנאי דגירה שונים על סמך תכנון הערכת מודל הניסוי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו גורם אחד בכל פעם, הוא שניתן לזהות ולכמת אינטראקציות בין פרמטרים שונים כמו גיל העזיבה או עלה מיקום.

גישת הגורם היחיד בכל פעם המשמשת לעתים קרובות לאפיון ההשפעה של גורמים מסוימים על תוצאות הניסוי היא לא אופטימלית מכיוון שהפרט רץ במהלך הניסוי יהיה מיושר כמו פנינים על חוט, ובכך משיג כיסוי נמוך של מרחב העיצוב. בניגוד לתכנון ניסויים של אסטרטגיית DOE, וריאציה של יותר מגורם אחד בכל פעם משפרת את הכיסוי ובכך את הדיוק של המודלים המתקבלים. יתר על כן, כיסוי חלל העיצוב המוטה בגורם אחד בכל פעם.

ניסויים יכולים גם להיכשל בזיהוי אזורי הפעלה אופטימליים ולחזות פתרונות לא אופטימליים, בעוד שאסטרטגיות DOE נוטות יותר לזהות תנאים מועדפים. תרשים זרימה זה ממחיש את התהליך לתכנון אסטרטגיית DOE. הצעד הראשון הוא זיהוי גורמים ותגובות רלוונטיים להכללה בתכנון.

בהדגמה זו רמות הביטוי של מודל נוגדן חד שבטי נגד HIV 2 G 12, וסמן פלואורסצנטי, חלבון DS אדום יימדדו על סמך ניסויים קודמים. ההבדל המינימלי הניתן לזיהוי שנחשב רלוונטי יהיה 10 מיקרוגרם למיליליטר עבור שני G 12 ו-20 מיקרוגרם למיליליטר עבור DS אדום. בנוסף, הערכים המשוערים לסטיית התקן המשוערת של המערכת עבור שני G 12 ו-DS אדום יהיו ארבעה ושמונה מיקרוגרם למיליליטר בהתאמה.

השלבים הנותרים לתכנון אסטרטגיה זו של ה-DOE לא יידונו כאן, אך ניתן למצוא פרטים בכתב היד המצורף. שני G 12 ואדום DS יבואו לידי ביטוי באופן זמני בצמחי טבק. כדי להתחיל בהליך גידול הצמחים, הכינו גושי קיר סלע בגודל 10 על 10 על שמונה סנטימטרים על ידי הבהוב נרחב במים נטולי יונים כדי להסיר שאריות כימיקלים.

לאחר מכן, יש לאזן את הבלוקים בתמיסה טרייה שהוכנה של צמחי טבק זרעי דשן על ידי הנחת זרעי טבק אחד עד שניים על כל גוש קיר סלע, ואחריו שטיפה קצרה עם דשן. היזהר להימנע משטיפת הזרעים, לנבוט ולטפח את צמחי הטבק במשך 42 יום בחממה בתנאים מתאימים. הכן את AUM FASS על-ידי גידול תרבית ל-OD 600 ננומטר של 5.0.

לדלל את התרבית במים ובמדיום הסננה כפול כדי להתאים ל-OD 600 ננומטר הנדרש להזרקה לפני ההזרקה. אשר את ה-OD 600 ננומטר של אטום תרחיף הפאזיה כדי להכין את העלים להזרקה. מגרדים בעדינות את האפידרמיס במקום ההזרקה בעזרת קצה פיפטה כדי להקל על זרם תמיסת AUM Fasion.

הימנע מקרע של להב העלה תוך כדי כך. החזק את המזרק המכיל את מתלה ה-AUM בניצב ללהב העלה, נוגע בקנה כנגד השדה הבין-צלעי שיש לטפל בו ודחף בעדינות את השקע לצד התחתון של העלה. במקביל, לחץ בעדינות על הצד העליון של העלה כדי למנוע מלהב העלה לזוז או להיקרע.

דחף בעדינות כלפי מטה את בוכנת המזרק. פתרון האופנה AUM ייכנס לחללים הבין-תאיים בתוך להב העלה כפי שמצוין על ידי האזורים המטופלים הנראים כהים יותר, ירוקים ולחים יותר. וודא שהמזרק נשאר בניצב לעלה במהלך ההזרקה.

אחרת, תרחיף החיידקים עלול לדרבן החוצה בלחץ גבוה. חזור על הליך זה במספר עמדות עד שכל השדה הבין-צלעי חודר עם aum, aum, fass. לאחר מכן המשיכו עם השדה הבין-צלעי הבא לאחר ההזרקה, דגרו את הצמחים בתנאים שנקבעו על ידי ה-DOE עם סיום תקופת הדגירה.

התחל לדגום. ייצב את העלה במגבת נייר כף יד והשתמש בשאול שעם כדי להסיר ארבעה עד חמישה דיסקי עלים מהשדות הבין-צלעיים המטופלים במיקומים ובזמנים שצוינו על ידי ה-DOE. אל תסיר את כל העלה מהצמח במהלך הדגימה.

קבע את המסה של כל דגימה והנח אותה בצינור תגובה פלסטי של 1.5 מיליליטר המסומן בשם המדגם ובמסה. אחסן את הדגימות ב-20 מעלות צלזיוס שליליות או שליליות 80 מעלות צלזיוס לפני כימות החלבון. התהליך עשוי להיות מושהה בשלב זה למשך מספר חודשים, תלוי ביציבות הדגימה ובטמפרטורת האחסון כדי לחלץ חלבונים מדגימות דיסק העלים.

הוסף שלושה מיליליטר של מאגר מיצוי לכל מיליגרם של מסת דגימה וטחן דיסקי עלים בצינור התגובה באמצעות עלי חשמלי עד שלא יישארו שברים גדולים. כדי למנוע התחממות יתר של הדגימה, הנח את הצינור על קרח בכל פעם שהצינור מרגיש חם לאחר צנטריפוגה. כדי להסיר מוצקים מפוזרים, העבירו את הסופרנטנט לצינור תגובה נקי של 1.5 מילימטר.

מדוד את הקרינה האדומה DS פעמיים ברצף. בקורא 96 משוחק היטב המצויד בעירור 530 25 ננומטר ו-590 מסנני פליטה של 35 ננומטר לכל דגימה. ממוצע הקרינה על פני שתי הקריאות ושלושת השכפולים הטכניים ומחסיר את הערך שנרשם עבור הפקד הריק המכיל אפס מיקרוגרם למיליליטר DS אדום.

הפחיתו גם ערך זה מהקנים של הדילולים הסטנדרטיים והשתמשו בערכים המתוקנים הריקים הללו עבור רגרסיה ליניארית המניבה עקומת ייחוס. לאחר מכן נעשה שימוש בשיפוע עקומת הייחוס כדי להמיר את הקרינה הנמדדת עבור הדגימות לריכוזים אדומים של DS. ההליך לקביעת הריכוז של שני נוגדני G 12 לא יוצג כאן, אך מפורט בכתב היד המצורף.

תוכנת Design Expert משמשת לניתוח והערכה של נתונים בצומת הניתוח. בחרו בתגובה לניתוח ובחרו תחילה באפשרות 'לא' בכרטיסייה 'שינוי צורה'. המשך לכרטיסיה סיכום התאמה, המספקת מידע כללי אודות גורמים החשובים למערכת הנחקרת.

התוכנה תציע מודל ראשוני על סמך המשמעות שלו בלשונית המודל. מודל ראשוני נבחר מראש על סמך תוצאות סיכום ההתאמה. השתמש במצב האוטומטי כדי לערוך מודל זה בכרטיסייה Innova.

חקור את המודל המוצע ואת הגורמים הכלולים במידת הצורך. הסר באופן ידני את כל הגורמים עם ערכי P מעל סף מוגדר מראש או כאלה שאינם סבירים בהתבסס על שיקול מכניסטי על ידי חזרה ללשונית המודל, שינוי הבחירה לידנית וביטול הגורמים המתאימים מהמודל. המשך ללשונית האבחון כדי לאשר את איכות המודל ולזהות חריגים פוטנציאליים במערך הנתונים שיש להם השפעה חזקה על המודל.

על ידי בחינת כל הכרטיסיות בכלי האבחון, התאם את סוג הטרנספורמציה בכרטיסייה לפי אם מוצע על ידי התיבה עלילת קוקס והפעל מחדש את הליך הניתוח בכרטיסייה גרפים של מודל. דמיין את המודל המוערך עבור מספר מוגבל של גורמים מספריים כגון שלושה. ייצוג משטח התגובה שימושי להערכת מאפיינים אופטימליים.

משטחי תגובה ידניים רק ממחישים את ההשפעה של שני גורמים על התגובה הנחקרת. ההשפעה של כל גורם נוסף על התגובה מתגלה על ידי שינוי ערכו או רמתו בחלון הכלים של הגורמים. לחלופין, ניתן להקצות גורמים לציר העלילה על ידי לחיצה ימנית עליהם בחלון כלי הגורמים ובחירת ציר המשתנים הבלתי תלוי הרצוי.

תפעל את רמות הגורמים והקצה אותן לקואורדינטות הגרף באמצעות כלי הגורמים. ייצא תרשימים באמצעות הפקודה 'ייצוא תרשים לקובץ' בכרטיסייה 'קובץ'. השתמש בצומת המשנה המספרי בצומת האופטימיזציה כדי לייעל את התגובה הרצויה מבחינה מספרית, בהתאם לגורמי המודל שעליהם ניתן להחיל אילוצים מסוימים באמצעות כרטיסיית הקריטריונים.

חשב ובחן פתרונות מספריים בכרטיסיה פתרונות בהתבסס על הקלט שסופק בכרטיסיה קריטריונים. ייצא פתרונות אלה לתוכנות אחרות כגון גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף החושף את הגדרות הגורם המשויכות לערכי תגובה גבוהים או נמוכים. זה מועיל אם נחקרים יותר משלושה גורמים מספריים, וייצוג תלת מימד קשה במחקר מייצג זה.

אסטרטגיית ה-DOE שימשה לבחינת ההשפעות של מקדמים שונים וחמישה RS ראשוניים על ביטוי חולף של ds. גורמים אדומים הכלולים במודל הביטוי החולף והטווחים הנחקרים מוצגים בטבלה זו. הגורמים המודגשים ייחודיים לניסוי זה.

הגורמים בכתב נטוי מיועדים לניסוי אחר שיתואר בהמשך. לפחות שלוש רמות נבחרו עבור כל הגורמים המספריים הדיסקרטיים כדי לאפשר חישוב של מודל בסיס ריבועי. נבחר אלגוריתם בחירה אופטימלי לבחירת ריצות ה-DOE כדי להשיג את האומדנים המדויקים ביותר עבור המקדמים של מודל הרגרסיה.

התכנון שהוצע בתחילה על ידי מומחה התכנון כלל 90 ריצות, אך ה-FDS לא היה מספיק כדי להשיג שגיאת תקן של 1% של חיזוי. הגדלה אופטימלית של העיצוב לסך של 210 ריצות פתרה בעיה זו והביאה ל-FDS של 100% עם דיוק חיזוי אחיד יותר על פני מרחב התכנון המצוין על ידי העקומה השטוחה, הריכוזים האדומים של DS נקבעו עבור כל 210 הריצות והנתונים עברו טרנספורמציה של 10. גורמי המודל נבחרו על ידי בחירה אוטומטית לאחור ממודל מעוקב עם רמת אלפא של 0.100.

זה הביא למודל משמעותי עם חוסר התאמה לא משמעותי וערכים גבוהים עבור מקדמי המתאם המרובים. ערך ה-P של כל גורמי המודל היה נמוך מ-0.05, ולכן לא נדרשה מניפולציה ידנית נוספת של המודל. המודל הכיל אינטראקציות של שלושה גורמים שהודגשו בהדגשה שלא היו חלק מההערכה המחודשת של מודל הבסיס הריבועי הראשוני של גרף ה-FDS.

שימוש בכל הגורמים הכלולים במודל החיזוי הסופי גילה כי ה-FDS עבור שגיאת התקן של החיזוי לא פחת באופן משמעותי על ידי הכללת האינטראקציות הנוספות של שלושת הגורמים. כלי האבחון של איכות המודל במומחה התכנון הצביעו על כך שטרנספורמציה של הנתונים הייתה שימושית ולא היו גורמים חסרים במודל מכיוון שהעלילה הרגילה של שאריות הראתה התנהגות ליניארית ולא נצפתה דפוס ספציפי בשאריות לעומת העלילה החזויה. כמו כן, במהלך הניסוי לא הייתה מגמה להצביע על משתנה נסתר תלוי זמן.

במקום זאת, תחזיות המודל היו תואמות מאוד את הקרינה האדומה של דיאז שנצפתה מכיוון שכל הנקודות נמצאות קרוב לאלכסון. לכן ההנחה הייתה שהמודל שנבחר שימושי לחיזוי הביטוי החולף של אדום DS בעלי טבק שאינם מובילים שמקורם בחמישה שילובי UTR ראשוניים שונים במהלך תקופת דגירה לאחר הסתננות שנמשכה שמונה ימים, ונבחר גם מודל רגרסיה ליניארית מלאכותית ללא טרנספורמציה של נתונים כדי להמחיש את ההשלכות של בחירה וטרנספורמציה שגויה של גורמים. כפי שניתן לראות בבירור כאן, העלילה הרגילה של שאריות חורגת מההתנהגות הליניארית הצפויה ויש דפוס בצורת V בשאריות לעומת העלילה החזויה במקום פיזור אקראי.

בנוסף, עלילת השאריות לעומת הריצה מדגישה שני ערכים קיצוניים. בעוד שהתחזיות היו גרועות עבור ערכים קטנים וגבוהים החורגים מהאלכסון, משטחי התגובה האופטימליים של המודל לביטוי אדום חולף של DS בעלי טבק מוצגים כאן. המודל חזה כי גיל העלים היה גורם משמעותי עם רמות ביטוי נמוכות יותר בעלים זקנים, למשל, עלה שני בחלקה A וחלקה B בהשוואה לעלים צעירים כמו עלה 6 בחלקה C וחלקה D. התקדמות הצטברות האדום של DS בעלים לא הייתה ליניארית או אקספוננציאלית, אלא עקבה אחר עקומה סיגמואידית במהלך שמונת ימי הדגירה שלאחר החדירה.

חמשת שילובי ה-UTR העיקריים עם מקדם ה-CAMV 35 SS הביאו לביטוי אדום DS חזק יותר מאשר שילובים עם מקדם NOS. למרות שלחמשת ה-UTR הראשוניים הייתה גם השפעה משמעותית על הביטוי הנכון של DS כפי שמוצג על ידי ההשוואה בין TL ל-CHS, חוזק הביטוי היה תלוי במקדם הנלווה. מודל החיזוי הצביע גם על כך שזוגות מסוימים של מקדם חמישה שילובי UTR ראשוניים כגון nas CHS ו-CAMV 35 SS CHS הביאו לרמות ביטוי מאוזנות שונות בפחות מ-30% מיחס מוגדר על פני כל העלים וזמני הדגירה של יותר מיומיים.

ביטוי מאוזן כזה יהיה שימושי לביטוי של חלבונים מולטימריים עם סטויכיומטריה מוגדרת. גישת ה-DOE שימשה גם כדי לייעל את תנאי הדגירה ותוכניות הקציר לייצור בו זמנית של שני G 12 ו-DS אדום בטבק. הגורמים המשפיעים על ביטוי חולף שנכללו בניסוי זה הם נטוי של 600 ננומטר וזמן הדגירה.

נקבע מודל חיזוי לביטוי של כל חלבון בצמחים בגילאים שונים. עלים צעירים נקטפו 40 יום לאחר הזריעה עלים ישנים נקטפו 47 יום לאחר הזריעה. לאחר מכן הוערכו ארבעת המודלים הללו והוקם מודל קונצנזוס שכלל כל גורם שנמצא משמעותי במודלים הבודדים.

לאחר מכן אושר כי מודל הקונצנזוס עדיין מייצג היטב את כל מערכי הנתונים הראשוניים. מודל הקונצנזוס שימש לאחר מכן לזיהוי טמפרטורות דגירה אופטימליות ו-OD חיידקי 600 ננומטר עבור שני החלבונים כדי לחזות ריכוזי חלבון בכל העלים ומיקומי העלים בצמחים צעירים ומבוגרים. שילוב פרופילי הריכוז עם נתוני ביומסה הביא אז לתפוקת חלבון מוחלטת.

כמויות החלבון המוחלטות היו בקורלציה עם העלויות הקשורות במורד הזרם, מה שאפשר ניתוח עלות-תועלת לעיבוד של כל עלה לגיל הצמח. אותה כמות של DS אדום וכ-65% משני G 12 נמצאה בצמחים צעירים בהשוואה לזקנים, למרות ביומסה ממוצעת נמוכה בכ-50% המשקפת ביטוי חלבון ספציפי גבוה יותר בצמחים צעירים. זה גילה שצמחים צעירים היו יתרון לביטוי חולף מכיוון שהחלבונים הגיעו לריכוזים גבוהים יותר בתקופות גידול קצרות יותר למרות הביומסה הכוללת הנמוכה יותר בהשוואה לצמחים ותיקים.

לבסוף, נמצא גם שעיבוד כל העלים מצמחים ישנים היה יקר יותר מאשר השלכת עלים אחד עד שלושה והגדלת מספר הצמחים בכל אצווה במקום זאת. לפיכך, מודלים מבוססי DOE מתאימים לא רק לסימון השלב האחרון של ניסוי, אלא גם לשילוב עם נתונים אחרים כדי להקל על היבטים מורכבים יותר של ניתוח תהליכים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להגדיר התנהלות ולנתח DOE כדי לחקור ביטוי חלבון חולף בצמחים.