הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להעריך מספר אנזימים באמצעות מערכת סינון אחת בעלת תפוקה גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרואורגניזמים והביו-הנדסה לגבי סינון מטגנומי והנדסת אנזימים. פיתחנו מערכת סינון אנזימים גנטית המורכבת מתרכובת הפנילן האחראית המוטנטית MPL ומדווח ה-GFP במורד הזרם.

ברגע שגן מטאגנומי כלשהו מראה את פעילות האנזים המעניינת אותנו על ידי תגובה עם המצע המסופק, תרכובת פנילן של תוצר התגובה מפעילה מוטציה Dmp ומפעילה ביטוי מדווח GFP שניתן ללכוד בקלות על ידי מד פלואורסצנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבניגוד לטכניקות סינון קונבנציונליות, שיטה בודדת זו ישימה לסינון סוגים מרובים של אנזימים שונים באמצעות המצע המתאים. מי שידגים את ההליך הזה יהיה קיל קואנג קוון, סטודנט לתואר שני במעבדה שלנו.

לאחר בניית ספרייה מטאגנומית ב-E.Coli עם וקטור פוסמיד באמצעות ערכת ייצור ספריית פוסמיד, העבר את ה-pGESS(E135K)DNA לתאי הספרייה המטאגנומיים. לאחר מכן אחסן את תאי הספרייה שעברו טרנספורמציה במינוס 70 מעלות צלזיוס ו-20 מיקרוליטר אליקוטים. כדי להסיר את התוצאות החיוביות השגויות, תחילה יש להפשיר תאי ספרייה מטאגנומיים על קרח.

לאחר מכן יש לחסן עשרה מיקרוליטרים של התאים המופשרים בשני מיליליטר של מרק ליזוגנאט המכיל אמפיצילין וכלורמפניקול בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך ארבע שעות. בינתיים, הגדר את הפרמטרים המתאימים במכונת ה-FACS לקריאת תאי הספרייה המטא-גנומיים בתוכנת ברירת המחדל של FACS. בתום הדגירה, העבירו חמישה מיקרוליטר תאים למיליליטר אחד של PBS בצינור תחתון עגול של חמישה מיליליטר.

לאחר מכן, טען את דגימת הספרייה המדוללת והתאם את קצב האירועים ל-1000 עד 1500 אירועים בשנייה. כדי ליצור אזור פיזור קדימה בקנה מידה של יומן לעומת תרשים פיזור של אזור מפוזר בצד בקנה מידה של יומן בגליון עבודה גלובלי, צור תרשים נקודות וצייר שער מצולע סביב אירועי הסינגל המכילים את אוכלוסיית החיידקים. כדי להתוות ספירת תאים לעומת היסטוגרמה של אזור FITC בקנה מידה של לוג, פתח היסטוגרמה והתאם את מתח ה-FITC כך ששיא ההתפלגות בצורת הפעמון יהיה פחות מעשר לשניים של אזור ה-FITC.

לאחר מכן, פתח עלילת נקודות נוספת כדי ליצור אזור פיזור קדימה בקנה מידה של יומן לעומת תרשים אזור FITC לוג והגדר שער מיון R2 בין פלוס חמישה למינוס חמישה אחוזים מהתאים ממרכז ההתפלגות. לאחר שכל השערים הוקמו, הנח צינור איסוף המכיל 1.2 מיליליטר של מרק ליזוגנאט בתוספת אנטיביוטיקה בשקע מכשיר ה-FACS ומיין אחת פעמים עשר עד שישית מהתאים המגודרים לתוך המרק. בסוף המיון, מכסים את צינור האיסוף ומערבלים בעדינות את התאים.

כדי לסנן את האנזימים המטאגנומיים המעניינים, דגרו על התאים הממוינים ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד עד שה-OD600 יגיע ל-0.5, ולאחר מכן הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת אינדוקציה להעתקה כדי להגביר את מספר העותק התוך-תאי. לאחר שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-250 סל"ד משלבים 0.5 מיליליטר מהתאים עם המצע המתאים בצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר לריכוז סופי של 100 מיקרו-מולרי. לאחר מכן דגרו את דגימות הבקרה והניסוי ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד למשך שלוש שעות נוספות.

בזמן שהדגימות רועדות, הגדר את הפרמטרים של מכונת ה-FACS כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטר של תאים מכל דגימה לצינורות תחתונים עגולים בודדים של חמישה מיליליטר המכילים מיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן, טען את תאי הדגימה והגדר את קצב האירועים ל-1000 עד 3000 אירועים בשנייה.

צור אזור פיזור קדימה בקנה מידה של יומן לעומת תרשים פיזור של אזור פיזור צדדי בקנה מידה של יומן והתאם את שער הפיזור R1 כך שיקיף את תאי החיידקים של האירוע היחיד. לאחר מכן צור פיזור קדימה בקנה מידה של יומן לעומת תרשים פיזור של אזור FITC בקנה מידה של יומן והגדר שער מיון R2 כך שפחות מ-0.1% מהתאים השליליים יזוהו. כעת, טען את צינור הדגימה והתאם מחדש את קצב האירועים ל-1000 עד 3000 אירועים בשנייה, לפי הצורך.

לאחר מכן הנח צינור איסוף המכיל 0.5 מיליליטר של מרק ליזוגנאט בשקע מכשיר ה-FACS ואסוף אחת פעמים עשר עד רביעית מהתאים בתוך שערי R1 ו-R2. לאחר שכל התאים בודדו, כסו את צינור האיסוף ומערבלו בעדינות את התאים. לאחר מכן מורחים 0.5 מיליליטר מהדגימות שנאספו על שתי צלחות אגר של 90 מילימטר המכילות מרק ליזוגנט בתוספת אנטיביוטיקה, ואז מדגרים את הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.

באיור זה, פרוטוקול הסינון המודגם מומחש כולל הסרת התוצאות החיוביות השגויות על ידי מיון שלילי, ובחירת ההיטים החיוביים באמצעות שערי המיון R1 ו-R2. לאחר מכן ניתן להעריך את הפגיעות על ידי השוואת תפרחת הדגימה עם ובלי המצע. בהקרנה מייצגת זו בתיווך p-nitrophly אצטט, התפרחת של התאים שטופלו בסובטסטרט הייתה גבוהה מזו של תאי הביקורת, מה שאישר חמישה מועמדים לליפאז בניסוי זה.

למרות ההתפלגות הרחבה של שלושת המועמדים לתאית הללו, נצפים הבדלים ברורים בעוצמת ה-FITC הממוצעת של האוכלוסיות. ארבעת המועמדים הללו לפוספטאז מפגינים גם רמות תפרחת גבוהות בהשוואה לתאי הביקורת. יתר על כן, ניתן לאשר את פעילות הפוספטאז האלקליין של וקטורים שהוכנסו ל-orf על ידי ציטומטריית זרימה עם אות תפרחת חזק יותר שנצפה עבור פגיעת האנזים מאשר עבור התאים הנושאים את הפלסמיד הריק.

חשוב לזכור שניתן ליישם טכניקה זו להקרנה של מגוון רחב של אנזימים על ידי בחירת סובסטרט וריכוז מנה מתאימים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף הדור הבא כדי לענות על שאלות נוספות לגבי זיהוי ואפיון של מועמד האנזים בצורה בעלת תפוקה גבוהה. לאחר פיתוחה, טכניקת סינון אנזימים בתפוקה גבוהה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת האנזימים לחקור אנזימים מטגנומיים שונים ללא צורך בספציפיות אנזים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במערכת הסינון המבוססת על מעגלים מטוגניים עם מגוון רחב של מטרות אנזימים.